具有群体感应行为的菌株及其在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有群体感应行为的菌株及其在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用。


背景技术：

2.厌氧氨氧化工艺是在厌氧或缺氧条件下，厌氧氨氧化菌以硝酸盐为电子受体，将氨转化为氮气的化能自养型脱氮工艺。与传统的硝化-反硝化工艺相比，厌氧氨氧化工艺具有脱氮效率高、耗氧量低、污泥产量低、甚至不需要有机碳补给等优点。目前实验室多采用序批式反应器、升流式厌氧污泥床(uasb)反应器、生物转盘等反应器实现厌氧氨氧化菌的培养厌氧氨氧化菌。然而，由于厌氧氨氧化菌生长缓慢(倍增时间为10-14天)，其富集难度很大，且厌氧氨氧化菌的活性易受温度、ph、有机物、重金属和抗生素等环境因子的影响，从而降低厌氧氨氧化菌在系统中的丰度。因此，寻找富集厌氧氨氧化菌的方法，是本领域迫切需要解决的一个技术难题。
3.近年来大量研究表明，厌氧氨氧化颗粒污泥的eps合成行为与群体感应(qs)高度相关。群体感应是细菌间的一种交流方式。具有群体感应行为的细菌可以合成和释放信号分子，当环境中信号分子的浓度达到阈值时，细菌会调节相关基因的表达，并赋予微生物发光、生物膜形成、基因水平转移、蛋白酶合成等能力。
4.革兰氏阴性细菌分泌的含有n酰基高丝氨酸内酯类化合物（ahls）是典型的种内信号分子。已有多个报道添加合适类型的外源性ahls可以显著提高厌氧氨氧化絮状物和颗粒的脱氮性能。cn202111110727.1公开了一种利用ahls酰胺淬灭酶提高厌氧氨氧化污泥的总氮去除率的方法。所述方法为：往稳定运行的氧氨氧化污泥sbr反应器中投加100-200mg/l的ahls酰胺淬灭酶，在ahls酰胺淬灭酶的作用下，厌氧氨氧化菌产生的信号分子被分解成高丝氨酸内酯和脂肪酸，脂肪酸被厌氧氨氧化菌利用，促进了内源反硝化作用，从而在保证厌氧氨氧化作用仍是反应器的主题脱氮途径的前提下，提高了反应器的总氮去除率。厌氧氨氧化由于产生了硝态氮，其极限总氮去除率为89％，本发明方法为污水总氮的高效去除提供一种新的方法。cn202210490284.1公开了一种利用外源ahls提高do胁迫条件下厌氧氨氧化颗粒污泥总氮去除率的方法。所述方法为：在溶解氧胁迫条件下(溶解氧浓度为3.00-5.00mg/l)，往厌氧氨氧化颗粒污泥反应器中投加200-400nmol/l的c14-hsl，利用c14-hsl与厌氧氨氧化菌胞内的amxr结合蛋白相结合而成的复合物调控与厌氧氨氧化相关的目的基因，强化厌氧氨氧化作用，最终达到在溶解氧胁迫条件下提高厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮效率的目的，可将反应器的脱氮效率提高6.52％-8.25％。为在溶解氧胁迫条件下，厌氧氨氧化颗粒污泥的高效脱氮提供一种新的调控方法。
5.外源信号分子不易获得且工艺操作繁琐，由本身带有群体感应行为的菌株分泌信号分子调控微生物群体的生理特征，从而提高厌氧氨氧化絮状物和颗粒的脱氮性能的应用研究尚未见报道。


技术实现要素：

6.发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一株具有群体感应行为的恶臭假单胞菌菌株（pseudomonas putida）syl-3及其在降解厌氧氨氧化污泥的总氮中的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种具有群体感应行为的恶臭假单胞菌，所述菌株分类命名为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida），菌株名为syl-3，于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.26071，所述syl-3分泌酰基高丝氨酸内酯类信号分子，特别是分泌c8-hsl。
8.本发明进一步提出了一种恶臭假单胞菌菌液，其包含上述恶臭假单胞菌。
9.其中，发酵完成后，所述菌液中菌体数量不少于108个/ml。
10.本发明还提出了上述恶臭假单胞菌菌液的制备方法，将上述恶臭假单胞菌单菌落接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；将对数期的菌种按体积比为5%-10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；将种子液按体积比1%-5％的接种量接入生产罐培养，发酵完成后即得恶臭假单胞菌菌液。
11.本发明进一步提出了上述恶臭假单胞菌或上述恶臭假单胞菌菌液在降解厌氧氨氧化污泥的总氮中的应用。
12.本发明还提出了一种提高厌氧氨氧化污泥的总氮去除率的方法，在反应器中接种厌氧氨氧化污泥，以氨态氮和亚硝态氮为进水基质，同时添加无机盐、微量元素，待反应器运行稳定后向进水中再投加所述恶臭假单胞菌菌液。
13.其中，氨态氮和亚硝态氮的进水浓度为250～300mg/l，其中，进水中氨态氮和亚硝态氮的浓度比为 1:0 .9～1，厌氧氨氧化污泥用量为2000-4000 mg/l。
14.优选地，所述无机盐包括kh2po41.0-1.5g/l、cacl2·
2h2o 1.0-1.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2-0.4g/l和khco
3 0.2-0.4 g/l；所述微量元素通过微量元素溶液的形式添加；所述微量元素溶液包含edta0.5-1.0 mg/l、feso4·
7h2o 0.4
ꢀ‑
0.7mg/l、h3bo
4 0.3-0.5 mg/l、mncl2·
4h2o 0.3-0.5mg/l、cuso4·
5h2o 0.3-0.5 mg/l、znso4·
7h2o 0.3-0.5 mg/l、nicl2·
6h2o 0.4-0.7 mg/l、namoo4·
2h2o 0.3-0.5 mg/l和cocl2·
6h2o 0.4-0.7 mg/l。
15.其中，所述恶臭假单胞菌菌液在进水中的添加量按照体积比为10～20%。
16.优选地，所述反应器为序批式反应器，反应器水力停留时间为3～4h。
17.有益效果：与现有技术相比，本技术具有如下优点：（1）本发明中提供的恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）syl-3对环境适应性强，易培养获得；（2）本发明中提供的恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）syl-3可分泌群体感应信号分子，有助于富集厌氧氨氧化菌，提高脱氮效率；（3）本发明中恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）syl-3的投加工艺操作简便，同时提高了废水微生物的活性，对废水中总氮降解率高达95％，对废水降解总氮具有实际的应用价值。
附图说明
18.图1为恶臭假单胞菌syl-3菌株的菌落图；图2为恶臭假单胞菌syl-3菌株的系统发育树；
图3为微生物信号分子的液相色谱结果图；图4为恶臭假单胞菌syl-3菌株在生长过程中信号分子的变化曲线；图5为温度对恶臭假单胞菌syl-3菌株活性的影响；图6为ph对恶臭假单胞菌syl-3菌株活性的影响；图7为恶臭假单胞菌syl-3菌株在实际废水中的脱氮效果。
实施方式
19.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
20.实施例1 恶臭假单胞菌syl-3的分离、纯化和筛选。
21.恶臭假单胞菌（pseudomonas putida）syl-3的分离、纯化和筛选，包括如下步骤：采集江苏南京某废水处理厂的活性污泥混合液，按照10%（v/v）的比例添加到mes液体培养基中，以ahl类的信号分子（c6-hsl、c8-hsl、c10-hsl、c12-hsl）作为唯一的碳源供给微生物营养。在28
°
c摇动培养1-2天后，将20 %的采样体积添加到新的mes培养基中并再次培养。取200 μl液体培养物，并将其滴加到仅含c8-hsl 的固体mes培养基表面，均匀平铺在培养基表面进行培养。在28
°
c放置24小时后，挑选出生长旺盛的菌落，不同形态的菌落单独挑出，划线培养，分离纯化。
22.其中，无碳源无机培养基mes组成为：nacl 1 g，kcl 0.5 g，mgcl2·
6h
2 o 0.4 g，nh4cl 0.3 g，cacl20.1 g，kh2po40.2 g，na2so40.15 g，mes (2-(n-morpholino)-ethanesulfonicacid) 1 g，蒸馏水定容至1 l，ph 7.5，121 ℃，20 min灭菌。
23.恶臭假单胞菌主要生物学特性：镜检观察菌落呈浅黄色，圆形扁平，表面湿润，光滑，边缘整齐，不透明，为革兰氏阴性菌，能够以ahl类的信号分子作为唯一碳源进行生长。其菌落图如图1所示。
24.将菌株的16s rrna 基因序列通过genbank数据库中blasting程序与ncbi中的核酸数据进行比对分析，结合16s rrna基因系统发育分析（图2），菌株syl-3鉴定为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida），并于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.26071，所述syl-3分泌酰基高丝氨酸内酯类信号分子。
25.实施例2 恶臭假单胞菌syl-3菌株的群体感应ahls检测及分析。
26.首先将恶臭假单胞菌菌株syl-3活化培养至对数期后，取10 ml于灭菌后的三角锥形瓶中，加入等体积的色谱级乙酸乙酯后于超声波清洗器中振荡30 min，振荡结束后用分液漏斗分液，收集乙酸乙酯相，水相则继续加入10 ml乙酸乙酯后振荡，重复两次后将乙酸乙酯相混合，利用氮吹仪吹脱的方法来处理样品直至乙酸乙酯完全挥发后用1 ml超纯水溶解样品瓶中剩余的白色物质（为分泌的ahls分子 c8-hsl）。最后将样品过0.22
µ
m尼龙膜并保存于2 ml液相的液相小瓶中，置于-4℃冰箱备用。
27.基础盐培养基（msm）：(nh4)2so
4 2.0 g，mgso47h2o 0.2 g，cacl22h2o 0.01g，feso47h2o 0.001g，na2hpo4·
12h2o 1.5 g，kh2po41.5 g，蒸馏水定容至1 l，ph 7.2-7.5,温度32-35 ℃。
28.系统中微生物信号分子的测定采用液相色谱进行测定，结果如图3所示。
29.实施例3 恶臭假单胞菌syl-3菌株在生长过程中信号分子的变化。
30.图4为恶臭假单胞菌syl-3菌株在生长过程中信号分子的变化曲线，由图4可得，恶臭假单胞菌菌株syl-3培养至对数期后，在0-6 h由于细菌处于适应期，细菌总数较少，酰基高丝氨酸内酯（ahls）c8-hsl的分泌量较少，在7-14h细菌总数呈几何级数增加，此时细菌进入对数期，细菌活性较高且活性变化速度较快。在15-18h细菌活性由逐渐提高到达到最大值，对应于细菌生长的稳定期，ahls信号分子随着菌体浓度增加而在胞外积累，细菌活性同时达到最高。
31.实施例4 温度对恶臭假单胞菌syl-3菌株活性的影响微生物生长需要适宜的温度，过高和过低的温度均不利于微生物的生长，也就不利于将微生物应用到实际工程中。将在培养基中培养到对数期的恶臭假单胞菌的菌株sly-3，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，50r/min摇床中培养，ph 7.5， 24 h后测定c8-hsl的浓度。
32.由图5可知，syl-3菌在温度为30℃-40℃时分泌的c8-hsl的浓度较高，30℃时为最佳生长温度，c8-hsl的浓度达到最高为64 mg/l，分泌ahls能力较强，且高于同等条件下温度为35℃时的浓度（60 mg/l）。培养温度高于40℃或低于25℃都会对细菌分泌ahls产生影响。
33.实施例5 ph对恶臭假单胞菌syl-3菌株活性的影响。
34.ph过高或过低都会影响酶的产生和相关反应，以及微生物的形成代谢及一系列生命活动，对微生物种群也会产生不利的影响。将在培养基中培养到对数期的恶臭假单胞菌的菌株sly-3，置于ph分别为5、6、7、8、9，150r/min的摇床中培养，30℃，24 h后测定c8-hsl的浓度。
35.由图6可知，不同的环境ph值对syl-3菌株分泌信号分子c8-hsl的影响较显著。在弱碱或中性环境下，syl-3菌株信号分子分泌量差别较大，ph=7时ahls分泌量达到最大，最大值可达65 mg/l，可得到ph=7为最佳生长条件。ph=5时c8-hsl浓度最低，这有可能是在酸性条件下，细菌生长繁殖受到抑制。syl-3菌株在中性偏碱性条件下适合生长，细菌活性较强，信号分子分泌量较多，在酸性条件下，细菌生长繁殖明显受到限制，信号分子分泌量较少，ahls 活性较低。
36.实施例6 恶臭假单胞菌syl-3菌株在实际废水中的脱氮效果。
37.同时在两组sbr反应器r1和r2中接种厌氧氨氧化污泥，氨氧化污泥取自南京农业大学某课题组，以浓度均为300mg l-1
的氨氮和亚硝态氮为进水基质，水力停留时间为3～4 h，同时添加无机盐kh2po
4 1.0 g/l、cacl2·
2h2o 1.0 g/l、mgso4·
7h2o 0.2 g/l和khco
3 0.2 g/l以及微量元素edta 0.5 mg/l、feso4·
7h2o 0.4 mg/l、h3bo
4 0.4 mg/l、mncl2·
4h2o 0.3 mg/l、cuso4·
5h2o 0.3 mg/l、znso4·
7h2o 0.3 mg/l、nicl2·
6h2o 0.4 mg/l、namoo4·
2h2o 0.3 mg/l和cocl2·
6h2o 0.4 mg/l，待反应器r1运行稳定后进水中再投加10 v/v% syl-3菌液，r2反应器不投加菌液运行。运行期间每天测定出水总氮浓度，在 120～124℃下，碱性过硫酸钾溶液使样品中含氮化合物的氮转化为硝酸盐，采用紫外分光光度法于波长 220nm 和 275nm 处，分别测定吸光度 a220 和 a275，计算校正吸光度a，总氮（以 n计）含量与校正吸光度a成正比。
38.由运行效果可知，两反应器的脱氮情况如图7所示，0～7天为适应阶段，该阶段r1
和r2无明显差异，总氮去除率均维持在较低水平，从第8天开始，二者脱氮效能开始呈现明显差异，r2明显优于r1，第20天时r2总氮去除达到约80％，比r1高30％以上，到第30天时，去除率高达95%，在后续的运行中，随着进水总氮浓度的不断提升，r2中总氮去除率始终高于r1。
39.本发明提供了一株具有群体感应行为的恶臭假单胞菌菌株（pseudomonas putida）syl-3及其在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用的应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.一株具有群体感应行为的菌株，其特征在于，所述菌株分类命名为恶臭假单胞菌（pseudomonas putida），菌株名为syl-3，于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：cgmcc no.26071，所述syl-3分泌酰基高丝氨酸内酯类信号分子。2.一种恶臭假单胞菌菌液，其特征在于，其包含权利要求1所述的恶臭假单胞菌。3.根据权利要求2所述的恶臭假单胞菌菌液，其特征在于，所述菌液中菌体数量不少于108个/ml。4.权利要求2所述的恶臭假单胞菌菌液的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的恶臭假单胞菌单菌落接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；将对数期的菌种按体积比为5%-10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，得到种子液；将种子液按体积比1%-5％的接种量接入生产罐培养，发酵完成后即得恶臭假单胞菌菌液。5.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌液在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用。6.一种提高厌氧氨氧化污泥的总氮去除率的方法，其特征在于，在反应器中接种厌氧氨氧化污泥，以氨态氮和亚硝态氮为进水基质，同时添加无机盐、微量元素，待反应器运行稳定后向进水中再投加权利要求2所述的恶臭假单胞菌菌液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，氨态氮和亚硝态氮的进水浓度为250～300mg/l，其中，进水中氨态氮和亚硝态氮的浓度比为 1:0 .9～1，厌氧氨氧化污泥用量为2000-4000 mg/l。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机盐包括kh2po
4 1.0-1.5g/l、cacl2·
2h2o 1.0-1.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2-0.4g/l和khco
3 0.2-0.4 g/l；所述微量元素通过微量元素溶液的形式添加；所述微量元素溶液包含edta0.5-1.0 mg/l、feso4·
7h2o 0.4
ꢀ‑
0.7mg/l、h3bo
4 0.3-0.5 mg/l、mncl2·
4h2o 0.3-0.5mg/l、cuso4·
5h2o 0.3-0.5 mg/l、znso4·
7h2o 0.3-0.5 mg/l、nicl2·
6h2o 0.4-0.7 mg/l、namoo4·
2h2o 0.3-0.5 mg/l和cocl2·
6h2o 0.4-0.7 mg/l。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述恶臭假单胞菌菌液在进水中的添加量按照体积比为10～20%。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应器为序批式反应器，反应器水力停留时间为3～4h。

技术总结
本发明提供了一株具有群体感应行为的菌株及其在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用，所述菌株为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）SYL-3，菌种保藏号为CGMCC No.26071。本发明基于所述菌株SYL-3具有较强的群体感应信号表达能力，提出所述菌株SYL-3在促进厌氧氨氧化脱氮上的应用，可以提高厌氧氨氧化污泥的总氮去除率。本发明中恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）SYL-3的投加提高了废水微生物的活性，对废水中总氮降解率高达95％，对废水降解总氮具有实际的应用价值。具有实际的应用价值。具有实际的应用价值。


技术研发人员：蔡天明 陈立伟 程海磊 孙佳佳 唐莲莲
受保护的技术使用者：江苏聚庚科技股份有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/7/17