一种肺癌预后评估试剂盒

1.本发明涉及疾病诊断试剂盒领域，具体涉及一种肺癌预后评估试剂盒。


背景技术：

2.肺癌是全球最常被诊断的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，估计每年有220万新病例和179万人死亡。肺癌可分为非小细胞肺癌(nsclc)(85％)和小细胞肺癌(sclc)(15％)。中国肺癌三期至四期的比例为64.6％，肺癌年龄标准化5年生存率仍不足20.0％。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snps)是影响肺癌易感性和预后的常见遗传变异。此外，吸烟也是一个重要的危险因素，约80-90％的肺癌病例是由吸烟引起的。然而，中国从不吸烟人群的肺癌发病率明显高于美国，尤其是女性。其他难以明确的相关因素包括性别、年龄、恶性肿瘤家族史、环境因素等。
3.g蛋白偶联受体(gpcr)传递大量细胞外信号，在生理和疾病中发挥重要作用并且可以被调节。g蛋白信号(rgs)蛋白的调控因子于20世纪90年代初首次被发现，它通过增加gtp结合的gα的水解速率来抑制gpcr信号，起到gtpase激活蛋白(gap)的作用。根据序列同源性，rgs蛋白被分为四个亚家族:r4/b、rz/a、r7/c和r12/d。rgs17基因编码rz/a亚家族中的一个蛋白质。它是一个210个氨基酸的蛋白质，首次从鸡背根神经节文库的酵母双杂交筛选中分离出来，使用组成性活性gαo作为诱饵。最近的研究报道了大量关于rgs17基因与恶性肿瘤之间关系的证据。you等通过对匹配的肿瘤和正常人体组织进行定量rt-pcr分析，发现肺癌患者肿瘤组织中rgs17显著过表达，肿瘤组织中rgs17转录物积累水平比正常对照组的组织高9.1倍。james等人发现rgs17通过腺苷酸环化酶激活物forskolin和/或pka抑制剂h89处理h1299细胞，正调节camp积累、creb磷酸化和forskolin诱导的肺癌细胞增殖。基于这些发现，rgs17可能是一种致癌基因。
4.位于染色体6q23-25上的rgs17 rs4083914在一项临床研究中与肺癌的风险相关，另一项关于rs9479510的研究也报告了类似的结果。然而，没有任何报道研究rgs17 rs4083914、rs9479510与肺癌预后的关系。


技术实现要素：

5.为了进一步研究rgs17 snp rs4083914和rs9479510是否与肺癌转归相关，并进行分层分析，本发明收集了839例治疗开始前确诊为肺癌的患者的外周血样本，并进行了基因分型和患者随访。
6.具体地，本发明提供了检测rgs17基因rs4083914或rs9479510位点基因型的试剂在制备癌症预后评估试剂盒中的应用。
7.在某些实施方式中，所述癌症为肺癌。
8.在某些实施方式中，当检测位点为rs4083914时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌或非吸烟的肺癌患者。
9.在某些实施方式中，rs4083914cc基因型指示不良预后。
10.在某些实施方式中，当检测位点为rs9479510时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌的肺癌患者。
11.在某些实施方式中，rs9479510gg基因型指示不良预后。
12.在某些实施方式中，所述试剂选自利用snpscan技术、测序法、taqman探针法、arms-pcr法、分子信标法、高分辨率熔解曲法、caps法、snapshot法、kasp法、基因芯片法、质谱法、taqman探针、测序法进行基因分型的相关试剂。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
14.肺癌是最常见的癌症之一，但其5年生存率并不理想。预测肺癌患者的预后具有挑战性。本发明首次研究了rgs17(g蛋白信号调节因子17)基因中的两个单核苷酸多态性(snps)与肺癌患者预后的关系，并发现rgs17 rs4083914和rs9479510是肺癌患者死亡风险的重要预后因素。为肺癌预后的预测提供了全新的方法。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
16.实施例1材料和方法
17.1.1研究组
18.从长海医院(536例)和台州卫生科学研究所(352例)的共纳入888名初步诊断为肺癌的患者，49例患者因缺乏临床资料而被排除，最终获得839例肺癌患者血液样本。入选标准为:经组织病理诊断为原发性肺癌，无其他恶性肿瘤病史，无年龄和性别限制。根据病史和电话随访获得患者临床资料。
19.1.2snp位点选择和基因分型
20.治疗前，从每个选定的患者中抽取5ml血液样本。使用qiaamp dna blood mini kit(qiagen,51106,hilden,germany)提取基因组dna，并使用2
×
48-plex snpscan tm kit(genesky biotechnologies,g0104,shanghai,china)进行基因分型。本发明采用了详细的程序来保证基因分型质量，保证响应率大于95％，复制基因型检测，内阳性对照样品，并进行hardy-weinberg平衡(hwe)试验。
21.1.3统计分析
22.皮尔逊卡方检验用于检查hwe。总生存期计算从样本收集之日起至任何原因死亡或最后一次随访之日止。本研究采用kaplan-meier法估计中位生存时间，log-rank检验比较组间差异，多变量cox回归分析估计危险比(hr)和年龄、性别、医院调整的95％置信区间(ci)。分析了四种snp遗传模型(等位基因、基因型、显性和隐性)。根据年龄、性别、吸烟状况、肺癌家族史、肺癌组织学类型和tnm分期进行分析。所有检验均为双侧检验，p《0.01为差异有统计学意义。所有统计分析均采用r 3.6.2版本进行。
23.实施例2研究结果
24.2.1患者人口统计学和临床特征
25.由于临床资料不完整，剔除49例患者后，对839例患者数据进行分析。研究样本由
同族的汉族个体组成。死亡668例(79.6％)，存活5年以上103例(12.3％)，失访68例(8.1％)。男性610例(72.7％)，年龄≥60岁524例(62.5％)，吸烟史582例(69.4％)，恶性肿瘤家族史302例(36％)。在癌症亚型方面，367例(43.7％)患者被诊断为腺癌(adc)，282例(33.6％)患者被诊断为鳞癌(scc)，72例(8.6％)患者被诊断为sclc,118例(14.1％)患者被诊断为其他癌症类型，包括腺鳞癌(asc)，大细胞癌，癌肉瘤(cs)和粘液表皮样癌(mec)。154例(18.4％)患者被诊断为i期和ii期疾病，625例(74.5％)患者被诊断为iii期和iv期疾病(表1)。
26.2.2患者特征与肺癌预后之间的关联
27.如表1所示，男性的中位生存时间明显低于女性(34.27个月vs.40.17个月；p＝0.01)，≥60岁患者与《60岁患者比较(33.2vs.40.87个月；p＝0.003)，吸烟者与非吸烟者之间(33.9vs.41.03个月；p《0.001)。此外，与早期肿瘤患者相比，晚期肿瘤患者的中位生存时间明显较短(29.4vs 113.93个月；p《0.001)(表1)。
28.表1.中国肺癌患者(n＝839)的一般特征分布及预后分析
29.[0030][0031]
2.3rgs17基因多态性与肺癌预后的关系
[0032]
rgs17 rs4083914位点有606个gg、214个gc和16个cc基因型，基因型检出率为99.64％(表2)。rgs17位点rs4083914g/c位点的基因型频率与hwe一致(p＝0.631)。rgs17 rs9479510共检出575cc、217cg、16gg基因型，基因型检出率为96.31％(表2)。rgs17 rs9479510 c/g基因型频率与hwe一致(p＝0.459)，表明调查人群处于遗传平衡状态(即群体调查数据可信)。在rgs17的rs4083914位点检测到1426个g和246个c等位基因。g和c在死亡组的频率分别为84.76％(1129/1332)和15.24％(203/1332)。rgs17的rs9479510位点共检测到1367个c和249个g等位基因；等位基因g和c的频率分别为83.77％(1079/1288)和16.23％(209/1288)(表2)。
[0033]
2.4rgs17多态性与肺癌预后的关联(按患者特征分层)
[0034]
发明人观察到，在年龄小于60岁的患者中，rgs17 rs4083914cc基因型比gg基因型的死亡风险更高(p＝0.003)(表3)，隐性基因型cc相对于gg+gc基因型的死亡风险也更高(p＝0.002)(表6)。与gg基因型相比，cc基因型的死亡风险更高(p＝0.004)(表3)。在sclc患者中，隐性基因型cc相对于gg+gc(p＝0.004)也是如此(表6)。发明人还观察到，在基因型模型和隐性模型中，rgs17基因rs9479510多态性gg基因型在sclc患者中均表现出更高的死亡率(gg vs.cc,p＝0.003；gg vs.cc+cg,p＝0.004)(表3,4,6)。
[0035]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
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此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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技术特征：
1.检测rgs17基因rs4083914或rs9479510位点基因型的试剂在制备癌症预后评估试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为肺癌。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当检测位点为rs4083914时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌或非吸烟的肺癌患者。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，rs4083914cc基因型指示不良预后。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当检测位点为rs9479510时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌的肺癌患者。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，rs9479510gg基因型指示不良预后。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自利用snpscan技术、测序法、taqman探针法、arms-pcr法、分子信标法、高分辨率熔解曲法、caps法、snapshot法、kasp法、基因芯片法、质谱法、taqman探针、测序法进行基因分型的相关试剂。

技术总结
本发明提供了检测RGS17基因rs4083914或rs9479510位点基因型的试剂在制备癌症预后评估试剂盒中的应用。当检测位点为rs4083914时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌或非吸烟的肺癌患者，并且rs4083914CC基因型指示不良预后。当检测位点为rs9479510时，所述检测对象优选年龄小于60岁、组织学分类为小细胞肺癌的肺癌患者，并且rs9479510GG基因型指示不良预后。rs9479510GG基因型指示不良预后。


技术研发人员：吴俊杰
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/7/18