用于心血管研究的微流控芯片及方法

1.本技术涉及微流控芯片技术领域，特别涉及一种用于心血管研究的微流控芯片。


背景技术：

2.传统的病理模型构建及大规模药物筛选主要使用基于细胞或分子靶标的体外检测进行评价，受限于检测靶标的有限性和特定系统微环境(如肠道)的模拟难度，以及病理变化无法进行连续观察的缺点。而传统的利用小动物(比如小鼠、大鼠等)进行药物筛选的方法通常受限于通量小、速度慢，使其药物筛选效率极其低下。
3.斑马鱼被广泛使用于复杂疾病病理模型构建、高通量药物筛选等众多研究当中。相较于大鼠、小鼠等实验动物，斑马鱼个体小(目前唯一适用于微孔板高通量筛选的脊椎动物模型)、发育周期短(器官在约24h形成)、实验周期短(筛选结果在一周内即可得出)、研究费用低(约为鼠类的1/10～1/100)、体外受精、透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150～200枚)以及实验用药量小(为小鼠用药量的1/100～1/1000)，且与人类基因同源性高达85％等特点而被广泛应用于生命科学研究、药物研发等领域。
4.研究表明，斑马鱼大多数编码具有凝血、抗凝和血小板信号通路作用的蛋白的基因中具有人类同源性。且因其胚胎的透明性使斑马鱼胚胎的心跳和血液循环很容易被观察到，因此可以实时动态观察药物引起的血液系统变化的整个过程。因此，斑马鱼胚胎可以作为评价心血管系统疾病的理想模型，在抗血栓药物的研究方面也具有重要的意义，斑马鱼幼鱼被广泛应用于抗血栓药物的筛选和活性评价以及机制研究。
5.针对斑马鱼的操控、固定、处理和实时观测，是实现上述各项研究的重要技术之一。然而，传统的斑马鱼血栓模型是在孔板中给药，给药结束后通过邻联茴香胺等染色液对斑马鱼尾部进行染色，使用发圈等工具将斑马鱼放到载玻片上后，使用琼脂糖等固定剂将斑马鱼固定在载玻片上，并且需要逐个对斑马鱼的体位进行调整，使斑马鱼是侧面固定的。这一系列的操作费时费力；由于斑马鱼幼体透明度高，光遮断传感器通常无法准确判断斑马鱼幼体的朝向，使得固定失误；并且在实验过程中很容易损伤斑马鱼幼体，对实验造成很大的不便。因此，亟需一种能够实现斑马鱼显微成像，操作简便、不损伤斑马鱼、低成本、高通量、并进行相应的自动化方向固定和培养的微流控芯片。


技术实现要素：

6.本技术的目的在于提供一种用于心血管研究的微流控芯片，目的是以斑马鱼为实验对象，实现操作简便、不损伤斑马鱼、低成本、高通量、并进行相应的自动化方向固定和培养的斑马鱼显微成像。
7.本技术的一方面，本技术公开了一种用于心血管研究的微流控芯片，以斑马鱼为实验对象；所述微流控芯片包括：多个芯片单体、集合体，其中，所述芯片单体中的每一个包括依次连接的入口、主通道、头部固定腔室、高度梯度区域、尾部固定腔室；
8.所述入口是位于芯片单体一端的与外界连通的开口；
9.所述主通道在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；
10.所述头部固定腔室的横截面尺寸由主通道末端起始，坡度化地减小；
11.所述高度梯度区域的横截面尺寸由头部固定腔室末端起始，均匀地收缩；
12.所述尾部固定腔室的高度与所述高度梯度区域的末端相同，并在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；所述头部固定腔室、所述高度梯度区域、所述尾部固定腔室共同形成半漏斗形状；
13.所述多个芯片单体的尾部固定腔室共同连接到集合体并与所述集合体连通。
14.在一个优选例中，所述多个芯片单体排列成轮辐状。
15.在一个优选例中，所述芯片单体的数量范围为6-10个。
16.在一个优选例中，每个所述芯片单体在其延伸方向上宽度是定值，宽度范围为700-900μm。
17.在一个优选例中，每个所述芯片单体的入口的高度为定值，范围为700-1100μm。
18.在一个优选例中，每个所述芯片单体的高度梯度区域的起始高度范围250-300μm。
19.在一个优选例中，每个所述芯片单体的尾部固定腔室的高度为定值，该高度范围为160-200μm。
20.在一个优选例中，每个所述芯片单体的尾部固定腔室的长度范围为1.8-2.5mm。
21.在一个优选例中，集合体的半径为500μm。
22.在一个优选例中，微流控芯片用于血栓模型构建的用途。
23.本技术的又一方面，还公开了一种构建血栓模型的方法，包括如下步骤：
24.(s1)在一个优选例中，以注水泵连接每一个所述芯片单体的所述入口，注水充满整个芯片单体的通道；
25.(s2)将斑马鱼胚胎通过所述入口依次引入所述每个芯片单体内；
26.(s3)堵住入口，完成斑马鱼在所述微流控芯片中的装载；
27.(s4)以注射器吸取足量的待测药物溶液；以注射泵通过一定流速将其注入微流控芯片的每一个所述芯片单体内；
28.(s5)用光学显微镜观察进行斑马鱼的形态观察并拍照记录；
29.(s6)在持续给药一定时间后，获取所有所述芯片单体中的斑马鱼的红细胞和/或血小板的数量。
30.本技术至少具有以下有益的技术效果：
31.1、通过将斑马鱼固定在微流控芯片微米级别的通道中来用于药物筛选、药物的活性评价；本技术提供的装置和方法装载斑马鱼幼鱼的步骤简单，无需麻醉、染色、使用药品固定，在引入幼鱼后可以直接观察，操作简便灵活；
32.2、本技术的芯片支持在显微镜下同时观察多达10个样本；
33.3、为抗血栓药物筛选实验提供成本更低、可行度更高的实验设备和方法，为潜在的病理模型构建、表型检测、药物活性筛选需求提供了理想实验基础；
34.4、为将来的潜在药物检测应用提供经济方便的支持。
35.本技术的说明书中记载了大量的技术特征，分布在各个技术方案中，如果要罗列出本技术所有可能的技术特征的组合(即技术方案)的话，会使得说明书过于冗长。为了避免这个问题，本技术上述发明内容中公开的各个技术特征、在下文各个实施方式和例子中
公开的各技术特征、以及附图中公开的各个技术特征，都可以自由地互相组合，从而构成各种新的技术方案(这些技术方案均应该视为在本说明书中已经记载)，除非这种技术特征的组合在技术上是不可行的。例如，在一个例子中公开了特征a+b+c，在另一个例子中公开了特征a+b+d+e，而特征c和d是起到相同作用的等同技术手段，技术上只要择一使用即可，不可能同时采用，特征e技术上可以与特征c相组合，则，a+b+c+d的方案因技术不可行而应当不被视为已经记载，而a+b+c+e的方案应当视为已经被记载。
附图说明
36.图1a、1b分别是根据本技术的微流控芯片的俯视图、侧视图；
37.图1c、1d分别是图1a、1b的微流控芯片的芯片单体的俯视图、侧视图；
38.图2是根据本技术的微流控芯片的仿真示意图；
39.图3是斑马鱼在本技术的微流控芯片中固定的实物照片；
40.图4是斑马鱼在孔板中与在本技术的微流控芯片中培养的心率对比图；
41.图5是斑马鱼在微流控芯片中的运动能力检测示意图；
42.图6a-6b分别是根据斑马鱼在本技术的微流控芯片中培养后血栓形成后红细胞堆积情况图；
43.图7a-7b分别是根据斑马鱼在本技术的微流控芯片中培养后血栓形成后血小板在血液循环中个数的观察情况图。
44.附图标记说明:
45.1-芯片单体；2-主通道；3-头部固定腔室；4-高度梯度区域；5-尾部固定腔室；6-入口；7-；集合体。
具体实施方式
46.本技术的发明人经过广泛而深入的研究，提出一种高通量、可观察斑马鱼尾部血栓形成的斑马鱼血栓模型芯片。该微流控芯片可以实现一次性观察多个样本，节省实验时间，降低成本，可用于药物的抗血栓活性筛选和药物抗血栓活性评价，心血管疾病研究。且该芯片可与转基因斑马鱼相结合，无需染色等实验操作就可直接观察血栓形成和溶解的情况。这为药物的筛选和药物活性评价提供了极大的便利。本技术对药物性能的评估和疾病的研究与治疗有重大的意义且可以极大降低样品量，大幅降低药物开发成本、易于商业化。
47.术语
48.如本文所使用的，术语“幼鱼”和“幼体”可互换使用；
49.如本文所使用的，术语“芯片”和“微流控芯片”可互换使用。
50.需要说明的是，在本专利的申请文件中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。本专利的申请
文件中，如果提到根据某要素执行某行为，则是指至少根据该要素执行该行为的意思，其中包括了两种情况：仅根据该要素执行该行为、和根据该要素和其它要素执行该行为。多个、多次、多种等表达包括2个、2次、2种以及2个以上、2次以上、2种以上。
51.在本发明中，所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后等)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
52.在以下的叙述中，为了使读者更好地理解本技术而提出了许多技术细节。但是，本领域的普通技术人员可以理解，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本技术所要求保护的技术方案。下面概要说明本技术实施方式的部分创新点：
53.微流控芯片的设计
54.微流控芯片的结构的正视图和侧视图如图1a-1d所示，包括多个芯片单体1和一个集合体7。芯片单体1的数量通常在6-10个，芯片单体1以轮辐装圆周排列，所有芯片单体的一端共同连接到集合体7。小的圆锥体围绕成一个圆圈形成的。
55.每个芯片单体1由入口6、主通道2、头部固定腔室3、高度梯度区域4、尾部固定腔室5组成，从入口至尾部固定腔室的方向上高度减小，即芯片单体1在入口6处的高度高于尾部固定腔室5处的高度。每个芯片单体1的宽度范围为700-900μm，优选为700μm，以保证斑马鱼幼鱼能畅通无阻地通过。入口6为斑马鱼的入口，与主通道2连接，入口的高度范围为700-1100μm，优选为710μm。主通道2是横截面尺寸均匀的一段长通道，其高度数值与入口连续，用于固定斑马鱼的头部。因斑马鱼幼鱼呈头大身细的生理特征，因此，因此，设计了一带有圆角的头部固定腔室3，头部固定腔室3的高度在其通道延伸方向上坡度化减小，其起始高度范围等同于主通道2高度(即范围700-1100μm，优选为从710μm)，末端高度等同于高度梯度区域4的起始高度(即范围250-300μm，优选270μm)。对于用于固定其身体和尾部的腔室，设计了一个高度梯度区域作为限制部分，即高度梯度区域4。高度梯度区域4的高度进一步均匀地减小。头部固定腔室3高度梯度区域4、尾部固定腔室5一同形成一种半漏斗形状，如图1d所示。尾部固定腔室5是整个芯片单体1上高度最低的部分，如同主通道2，也是横截面尺寸均匀的一段长通道，其高度范围160-200μm，优选为180μm。因此高度梯度区域4的末端高度优选由从270μm降低到180μm。尾部固定腔室5仅允许斑马鱼幼鱼的尾部通过，这样就实现了斑马鱼幼苗的侧向固定(即鱼的侧面面向显微镜)，以便进一步观察相关器官的生长发育及药物的毒性影响。尾部固定腔室5的长度范围为1.8-2.5mm，优选2mm，以便于在显微镜下可以看到完整的斑马鱼尾部。所有芯片单体的尾部固定腔室都连接到集合体7，集合体7的半径为500μm，该种结构允许在斑马鱼尾部互不影响的情况下还能在显微镜下看到多条(6-10条)斑马鱼的尾部情况。
56.微流控芯片的制作
57.本发明采用基于高精度计算机数控(cnc)加工或者3d打印的制造方法，制作微流控芯片模具，用聚二甲基硅氧烷(pdms)通过从模具上复制微流体中空通道来制备具有流体通道的微流控芯片。
58.微流控芯片模具的制备：
59.(s1)用三维软件solidworks完成微流控芯片的内部结构设计，利用3d打印机进行
加工。主要包括以下步骤：
60.(s101)将设计得到的.sldprt格式文件改成.slt格式文件，将文件导入3d打印机中；使用3d打印机直接进行模具3d打印。
61.(s102)打印完成后，用铲子从打印座上铲去模具。
62.(s103)将模具放入装有无水酒精的清洗盒超声清洗，随后将模板放在uv固化箱中固化。
63.(s104)清洗固化好的模具上涂抹脱模剂，在表面滴加几滴脱模剂，均匀涂抹在模具表面。
64.微流控芯片的制备：
65.(s2)取pdms(a)和pdms(b)按照10:1的比例混合，充分搅拌混匀后置于室温下，抽取真空约20min除气泡；
66.(s3)将pdms混合液倒入用锡纸包好的硅板模具中再次放入冷冻干燥机中抽真空；放在恒温加热台上，烘烤4-6h。待pdms完全固化后，取出并冷却至室温，将其从模具上剥离；
67.(s4)半径为1.6mm的打孔器进行打孔；
68.(s5)将pdms芯片放入plasma等离子机器中，将pdms和玻璃基底等离子处理，将二者等离子化的面结合在一起，并在恒温台上使用重物压制过夜，完成微流控芯片的制备。
69.为了能够更好地理解本技术的技术方案，下面结合具体的例子来进行说明，以下实施例中罗列的细节主要是为了便于理解，不作为对本技术保护范围的限制。
70.实施例1、微流控芯片的内部结构
71.本实施例的微流控芯片的结构的正视图和侧视图如图1a-1d所示，是由10个芯片单体1围绕成一个半径为500μm的集合体7组成。每个芯片单体1的通道宽度为700μm，以保证斑马鱼幼鱼能畅通无阻地通过。芯片单体1的一端是斑马鱼的入口6，主通道高度为710μm，连接主通道2。斑马鱼头部固定腔室3可固定斑马鱼的头部。因斑马鱼幼鱼呈头大身细的生理特征，因此幼苗固定腔室整体呈现为一个半漏斗状，即头部固定腔室3、高度梯度区域4、尾部固定腔室5构成的区域。头部固定腔室3是半漏斗状的上半部分，该区域空间较大，可容纳斑马鱼的头部，固定尾部的区域(即高度梯度区域4、尾部固定腔室5)为半漏斗状的下半部分，该区域空间较小，仅可固定斑马鱼的尾部，以及允许液体通过。在头部固定腔室3处，芯片的高度从710μm降低到270μm，该部分仅允许斑马鱼幼鱼的尾部通过；在高度梯度区域4，芯片高度再降低到180μm，这样就实现了斑马鱼幼苗的侧向固定，以便进一步观察相关器官的生长发育及药物的毒性影响。尾部固定腔室5长度为2mm，以便于在显微镜下可以看到完整的斑马鱼尾部。圆的半径为500μm，在斑马鱼尾部互不影响的情况下还能在显微镜下同时观测10条斑马鱼的尾部，便于对比病理模型构建情况。
72.实施例2、在微流控芯片内实现斑马鱼幼苗的固定
73.在实现斑马鱼幼苗的固定前，需要依次先将芯片的入口注水充满整个芯片单体的通道，除去芯片内的气泡。通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼胚胎运输的控制系统相连，连接时，软管内应先排空气体，且出口处保留一液滴以避免将气体引入芯片通道内。将芯片如图1a中的整体俯视图所示放置，将幼鱼引入芯片单体后，使用塞子将入口6堵住。根据流体动力学的原理看，如图2所示，液体在斑马鱼尾部会有液体滞留。通过幼苗运输控制系统将其从芯片入口送入，幼苗依次被输送到芯片单体中，其身体分别与头部
固定腔室、尾部固定腔室契合，从而实现斑马鱼胚胎有序的自动化装载。胚胎装载完成后，入口6处连接的注射泵以1ml/h的流速持续性输送培养液流体，达到固定斑马鱼幼苗的目的，可在显微镜下观察到斑马鱼，如图3所示。图中可看到，来自10个芯片单体的斑马鱼的尾部都进入了集合体7内。
74.实施例3、在微流控芯片内测试斑马鱼运动能力和生存能力
75.如实施例1所述，先依次将芯片的入口6注水充满整个通道并除去芯片内的气泡。通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼幼苗运输的控制系统相连，连接时，软管内应排空气体。将芯片如图1a中的整体俯视图所示放置，把入口6利用塞子堵住后，通过幼苗运输控制系统将其从芯片入口处送入，幼苗依次有序装载进固定腔室内。注射器吸取足量的胚胎培养液，安装在入口6处连接的注射泵上。注射泵以6μl/s，间隔5min的流速持续性输送流体，从而固定斑马鱼幼鱼并实现连续给药。微流控芯片的显微观测系统配备有光学显微镜、高清摄像头及计算机，可在研究过程中对斑马鱼摄制图像。图4示出了在微流控芯片系统中与在孔板中分别培养的幼鱼，其心率的变化。实验结果表明，在芯片中分别存活12h、24h，对其心率无明显影响。
76.图5为在芯片中培养24小时后，从芯片中释放出的斑马鱼幼鱼的运动能力结果，实验结果显示在芯片中固定24h后，斑马鱼的运动能力没有受到影响。
77.实施例4、在微流控芯片内构建斑马鱼血栓模型
78.如实例1所述，先将芯片的入口注水充满整个通道并除去芯片内的气泡。通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼幼苗运输的控制系统相连，连接时，软管内应排空气体。将芯片如图1中的整体俯视图所示放置，把入口6利用塞子堵住后，通过幼苗运输控制系统将其从芯片入口6处送入，幼苗依次有序装载进固定腔室内。
79.注射器吸取足量的待检测药物溶液，安装在入口处连接的注射泵上。注射泵以1μl/s，每次注射6μl间隔5min的流速持续性输送流体，从而固定斑马鱼幼鱼并实现连续给药。微流控芯片系统配备有光学显微镜、高清摄像头及计算机，可在研究过程中对斑马鱼摄制图像。如图6所示统计了在0.5μmphz给药24h后斑马鱼红细胞血栓形成堆积情况，其中，测试中的10条幼鱼的红细胞密度以点状标示，柱状代表了10个样本个体的红细胞均值。结果显示，phz模型组与正常组相比，其红细胞堆积具有统计学差异。说明造模成功。
80.如图7所示，统计了斑马鱼在0.5μm phz给药24h后血液中血小板的情况，其中，测试中的10条幼鱼的血小板密度以点状标示，柱状代表了10个样本个体的血小板均值。实验结果显示，phz模型组与正常组相比，其血液循环中血小板数量下降，且具有统计学差异，说明在本芯片中，斑马鱼的血栓模型造模成功。
81.本说明书包括本文所描述的各种实施例的组合。对“一个实施例”或特定实施例等的单独提及不一定是指相同的实施例；然而，除非指示为是互斥的或者本领域技术人员很清楚是互斥的，否则这些实施例并不互斥。应当注意的是，除非上下文另外明确指示或者要求，否则在本说明书中以非排他性的意义使用“或者”一词。
82.在本技术提及的所有文献都被认为是整体性地包括在本技术的公开内容中，以便在必要时可以作为修改的依据。此外应理解，在阅读了本技术的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所要求保护的范围。

技术特征：
1.一种用于心血管研究的微流控芯片，其特征在于，以斑马鱼为实验对象；所述微流控芯片包括：多个芯片单体、集合体，其中，所述芯片单体中的每一个包括依次连接的入口、主通道、头部固定腔室、高度梯度区域、尾部固定腔室；所述入口是位于芯片单体一端的与外界连通的开口；所述主通道在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；所述头部固定腔室的横截面尺寸由主通道末端起始，坡度化地减小；所述高度梯度区域的横截面尺寸由头部固定腔室末端起始，均匀地收缩；所述尾部固定腔室的高度与所述高度梯度区域的末端相同，并在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；所述头部固定腔室、所述高度梯度区域、所述尾部固定腔室共同形成半漏斗形状；所述多个芯片单体的尾部固定腔室共同连接到集合体并与所述集合体连通。2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述多个芯片单体排列成轮辐状。3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片单体的数量范围为6-10个。4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述芯片单体在其延伸方向上宽度是定值，宽度范围为700-900μm。5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述芯片单体的入口的高度为定值，范围为700-1100μm。6.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述芯片单体的高度梯度区域的起始高度范围250-300μm。7.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述芯片单体的尾部固定腔室的高度为定值，该高度范围为160-200μm。8.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，每个所述芯片单体的尾部固定腔室的长度范围为1.8-2.5mm。9.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，集合体的半径为500μm。10.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，用于血栓模型构建的用途。11.一种构建血栓模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：(s1)使用如权利要求1至9任意一项所述的微流控芯片，以注水泵连接每一个所述芯片单体的所述入口，注水充满整个芯片单体的通道；(s2)将斑马鱼胚胎通过所述入口依次引入所述每个芯片单体内；(s3)堵住入口，完成斑马鱼在所述微流控芯片中的装载；(s4)以注射器吸取足量的待测药物溶液；以注射泵通过一定流速将其注入微流控芯片的每一个所述芯片单体内；(s5)用光学显微镜观察进行斑马鱼的形态观察并拍照记录；(s6)在持续给药一定时间后，获取所有所述芯片单体中的斑马鱼的红细胞和/或血小板的数量。

技术总结
本申请公开了一种用于心血管研究的微流控芯片，包括：多个芯片单体、集合体，其中，芯片单体中的每一个包括依次连接的入口、主通道、头部固定腔室、高度梯度区域、尾部固定腔室；入口是位于芯片单体一端的与外界连通的开口；主通道在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；头部固定腔室的横截面尺寸坡度化地减小；高度梯度区域的横截面尺寸均匀地收缩；尾部固定腔室的高度与高度梯度区域的末端相同，并在其延伸的方向上横截面尺寸为定值；头部固定腔室、高度梯度区域、尾部固定腔室共同形成半漏斗形状；多个芯片单体的尾部固定腔室共同连接到集合体并与集合体连通。体并与集合体连通。体并与集合体连通。


技术研发人员：朱丽丽 贺丽娟 李洪林
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/18