一株输卵管炎鸡杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株输卵管炎鸡杆菌及其应用。


背景技术：

2.随着物质生活水平的提升，公众对禽蛋的需求日益旺盛，蛋禽养殖业也呈现蓬勃发展的态势。由细菌性病原微生物原发、继发或者协同感染引起的输卵管炎则是蛋禽养殖业的重要危害。正常情况下，输卵管内是一个无菌环境，当输卵管黏膜因产蛋或者其他原因造成机械损伤后，细菌通过血液或者通过泄殖腔逆行侵入输卵管，从而引发炎症。输卵管炎会导致蛋禽输卵管机能紊乱，蛋清、蛋壳形成异常，薄壳蛋、畸形蛋、沙壳蛋破壳蛋比例上升，甚至会阻断成熟的卵泡正常坠落，引发卵黄性腹膜炎，使蛋禽死亡率上升。引起蛋禽鸡输卵管炎症细菌病原主要有大肠杆菌、支原体、鸡杆菌等。
3.鸡杆菌为两端钝圆、无芽孢，不运动的革兰阴性球杆菌，主要侵害鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸡、鸽、孔雀和鹧鸪等鸟类宿主，是禽类消化道、呼吸道内的常在菌，致病性与宿主的日龄、免疫状况、环境应激、异种病原感染压力以及黏膜完整性等因素密切相关。鸡杆菌属生物学分类为巴氏杆菌科，主要包括：鸭源鸡杆菌(gallibacterium anatis)、输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)、虎皮鹦鹉鸡杆菌(gallibacterium melopsittaci)和海藻糖发酵鸡杆菌(gallibacterium trehalosifermen tans)4个已命名的种。当前研究表明，鸡杆菌作为一种机会性致病菌主要引起蛋鸡出现血性卵巢炎、卵巢滤泡破裂、输卵管炎、腹膜炎、肝周炎、肝坏死、心包炎、气囊炎，造成产蛋率和蛋品质下降、死亡率上升等表观症状，国内外报道的输卵管炎鸡杆菌的分离部位主要在上呼吸道(鼻腔、气管)、生殖道(泄殖腔、输卵管)、消化道(直肠)等体腔外环境。目前，还未见从蛋鸭中分离出输卵管炎鸡杆菌的相关报道，且关于鸡杆菌引发蛋鸭疾病的相关研究也极少。
4.就鸡杆菌病防治而言，一方面，鸡杆菌对氟喹诺酮类、四环素类、青霉素类及磺胺类等口服吸收良好的抗菌药物具有普遍的耐药性，在临床治疗过程中可供选择的药物较少。另一方面，目前关于该病的疫苗研究和产品极少，远不能满足蛋禽养殖业对鸡杆菌防控的需要。因此，开发一种安全、有效的鸡杆菌病疫苗对蛋禽的鸡杆菌病防治具有积极意义。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一株蛋鸭来源的输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)强毒株，是发明人从蛋鸭体腔内环境(肝脏)中分离鉴定到一株具有代表性输卵管炎鸡杆菌，为深入研究蛋鸭中输卵管炎鸡杆菌致病机制提供了良好的素材。该强毒株可以引起本源动物产生输卵管炎症状，进而可用于构建蛋鸭攻毒模型，并初步应用于输卵管炎鸡杆菌灭活疫苗研究，旨在解决蛋鸭输卵管炎鸡杆菌病防控难题。
6.本发明的第一个目的是提供一株输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株。
7.本发明的第二个目的是提供输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株的应用。
8.本发明的第三个目的是提供一种鸡杆菌病灭活疫苗。
9.本发明的第四个目的是提供一种构建鸡杆菌病感染动物模型的方法。
10.本发明的第五个目的是提供鸡杆菌病感染动物模型的应用。
11.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
12.本发明从具有典型输卵管炎、腹膜炎全身症状的病鸭肝脏中分离并鉴定得到一株输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株，该菌株已于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20221076。本发明提供的输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株具有以下特征：
13.(1)细菌形态特征：在含5％新生牛血清的tsa平板上，有氧条件下37℃孵育24-48h，产生直径1-2mm的卵圆形、光滑、淡蓝色、不透明、有光泽的菌落；革兰氏染色阴性，显微镜下可见粉红色呈团分布短杆菌；分辨率为5μm的电镜下，出现呈丛分布的棒状短杆菌。
14.(2)细菌生化特征：gs fc22菌株能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，磷酸酶、过氧化氢酶阳性，在绵羊血平板上产生界限清晰、完全透明的β溶血环。
15.本发明研究显示采用输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株对血清学及病原学检测双阴性高产母鸭进行攻毒，产蛋母鸭输卵管黏膜出血、萎缩，输卵管干酪样物质堵塞，卵黄性腹膜炎病理变化，对蛋鸭生殖系统的具有致病能力，未发现感染蛋鸡时出现的肝周炎、肝坏死、心包炎、气囊炎等病变，表现出与蛋鸡鸡杆菌病差异化的临床症状，由此成功构建出感染输卵管炎鸡杆菌的鸡杆菌病蛋鸭感染模型。进一步将输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株制备成油乳佐剂灭活疫苗并免疫蛋鸭，结果显示该疫苗不会影响蛋鸭采食量、精神状态、产蛋性能等指标，表明无生物安全隐患。进一步采用gs fc22菌株灭活疫苗对蛋鸭进行首次免疫和二次免疫，再用同源菌株gs fc22菌株进行攻毒。结果显示，两次免疫gs fc22菌株灭活疫苗后，蛋鸭对同源毒株gs fc22菌株攻击具有明显的保护作用，能明显改善蛋鸭产蛋性能、临床症状，有效避免产蛋率的下降、残次蛋数量的上升等临床症状，表明本发明提供的利用输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株制备的输卵管炎鸡杆菌灭活疫苗具备较好的免疫保护作用。
16.因此，本发明提供输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株菌株在制备蛋鸭鸡杆菌病疫苗、或在构建蛋鸭感染鸡杆菌病的动物模型中的应用。
17.进一步地，所述疫苗为灭活疫苗。
18.本发明提供一种鸡杆菌病灭活疫苗，含输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株。
19.优选地，所述疫苗还含有疫苗佐剂。
20.更优选地，所述疫苗佐剂为水包油包水佐剂；本发明采用的水包油包水佐剂为本领域常规佐剂，能够通过现有技术公开方法自行制备，本发明使用的w/o/w佐剂主要成分为：白油、卵磷脂、tween-80和span-80。
21.本发明提供一种构建感染鸡杆菌病的蛋鸭模型的方法，采用输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株感染蛋鸭，获得感染鸡杆菌病的蛋鸭模型。
22.优选地，所述感染方法为胸部肌肉注射法。
23.优选地，所述gs fc22菌株的半数感染量为2
×
106cfu/ml。
24.本发明还提供通过构建感染鸡杆菌病的蛋鸭模型的方法获得的蛋鸭模型在药物筛选、疫苗效果评价或致病机理研究中的应用。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明从具有典型输卵管炎、腹膜炎全身症状的病鸭肝脏中首次分离并鉴定得到一株输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株，采用gs fc22菌株能成功构建出感染鸡杆菌病的蛋鸭模型，证实了输卵管炎鸡杆菌对产蛋鸭生殖系统的致病性，进一步丰富了鸡杆菌病的临床资料，为蛋鸭的生殖道疾病的诊断提供了新方向。
27.本发明将gs fc22菌株制备成油乳佐剂灭活疫苗，具有生产成本低、安全性好、免疫效果佳等特点，不会影响蛋鸭采食量、精神状态、产蛋性能等指标，剖检后也未发现有输卵管炎症，无生物安全隐患；采用gs fc22菌株灭活疫苗对蛋鸭进行免疫后能明显改善蛋鸭产蛋性能、临床症状，能明显减少产蛋率的下降、残次蛋数量的上升，具备较好的免疫保护作用，有良好的市场前景。
28.本发明为深入研究输卵管炎鸡杆菌的感染与致病机制提供了优良的科研素材，为蛋鸭生殖道疾病的防控提供了新思路，为鸡杆菌病的应用研究提供了新方法，对有效防控蛋鸭生殖系统疾病具有重要价值。
附图说明
29.图1为病原学鉴定实验中菌株革兰氏染色镜检图。
30.图2为病原学鉴定实验中菌株在电镜下的形态。
31.图3为动物回归实验中不同处理组的输卵管剖检形态图。
32.图4为动物回归实验中实验组攻毒7天后出病理变化图。
33.图5为免疫保护实验中攻毒后3周内各组每天产蛋量情况。
34.图6为免疫保护实验中各组攻毒后蛋品质统计图(其中“残次蛋”为沙壳蛋、畸形蛋、条纹蛋，不包括人为损伤的破壳蛋；“7d”表示1-7d内产蛋累积数、“14d”表示8-14d内产蛋累积数、“21d”表示15-21d内产蛋累积数)。
35.图7为免疫保护实验中各组攻毒后蛋壳外观图。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.本发明采用的固态培养基配制方法：将40g胰蛋白胨大豆琼脂tsa，溶于950ml去离子水中，121℃灭菌15分钟，加入胎牛血清50ml，分装于无菌平皿中制成平板。
39.本发明采用的液态培养基配制方法：将30g蛋白胨大豆肉汤tsb，溶于950ml去离子水中，121℃灭菌15分钟，加入无菌胎牛血清50ml，4℃保存。
40.本发明采用的鲜血琼脂培养基配制方法：将40g胰蛋白胨大豆琼脂tsa，溶于950ml去离子水中，121℃灭菌15分钟，加入无菌脱纤维绵羊血50ml，分装于无菌平皿中制成平板。
41.本发明采用的疫苗佐剂为水包油包水佐剂，为本领域常规佐剂，能够通过现有技术公开方法自行制备，本发明使用的水包油包水佐剂(w/o/w佐剂)主要成分为：白油、卵磷脂、tween-80和span-80。
42.实施例1菌株的分离与鉴定
43.1、分离培养
44.样本来源于江西省内某鸭场母鸭爆发腹膜炎和输卵管疾病，产畸形蛋、沙壳蛋，产蛋率骤降。剪取患病母鸭肝脏组织块，置于75％乙醇溶液中浸泡1min，去除肝脏表面病原微生物；将肝脏组织块置于无菌ep管中，用1.5ml灭菌生理盐水清洗两遍；将肝脏组织块研磨后涂布于含5％胎牛血清的tsa平板上，37℃恒温静置培养24h；挑取经纯化后的单菌落划线含5％绵羊血的tsa平板，37℃恒温静置培养24h。
45.在含5％胎牛血清的tsa平板上，有氧条件下37℃孵育24-48h，产生直径1-2mm的卵圆形、光滑、淡蓝色、不透明、有光泽的单菌落；在含5％绵羊血的tsa平板上形成2-3倍菌落直径大小的界限清晰、完全透明β-溶血环。
46.2、病原学鉴定
47.用接菌环刮取多个经纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检。挑取经纯化后的单菌落置于ep管中，用0.5ml生理盐水重悬后，涂布5％胎牛血清的tsa平板，并用盖玻片轻轻覆盖在平板琼脂上，37℃恒温静置培养24h后，送转印在盖玻片上的菌体进行电镜分析，挑取经纯化后的单菌落分别接种葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、果糖、过氧化氢酶、磷酸酶和氧化酶微量生化鉴定管中，37℃培养24h-48h，按照试剂盒说明书进行判定。
48.结果如图1所示，在油镜1000倍视野下可见粉红色短杆菌，革兰氏染色阴性；在分辨率为5μm的电镜视野下，如图2所示，可见呈丛分布的棒状短杆菌；分离菌能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇；过氧化氢酶、磷酸酶、氧化酶、靛基质试验呈阳性。
49.3、生物学鉴定
50.挑取经纯化后的单菌落接种于含5％胎牛血清的tsb液态培养基中，37℃恒温、180r/min震荡培养24h后，取2ml菌液5000r/min离心5min，去掉上清液，于液氮中冻存2-4h后，干冰运输保存，送广州基迪奥生物科技有限公司进行全基因组测序分析，将测序文件注释出的16s rrna序列进行blast同源性比对分析。
51.经ncbi数据库blast比对分析发现，分离的菌与gallibacterium salpingitidis strain ccug 15564菌株(sequence id:nr_044612.1)同源性最高：98％。结合其菌落形态特征、生理生化特性，以及分子生物学特征，并参照《bergey’s manual of systematic bacteriology》(第二版)，确定该菌株为鸡杆菌属(gallibacterium)-输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)，ncbi登录号为：cp103875，将该菌株鉴定并命名为输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株，并于2022年07月11日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：m 20221076，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学。
52.实施例2动物回归实验
53.将分离纯化后的gs fc22菌株接种于加有5％胎牛血清的tsb培养基中，37℃、180r/min震荡培养24h。取培养菌液5000r/min离心5min，去除上清，用无菌磷酸缓冲盐溶液将菌体重悬。分别按照2
×
104cfu/ml、2
×
105cfu/ml、2
×
106cfu/ml、2
×
107cfu/ml、2
×
108cfu/ml的浓度，采取胸部肌肉注射法，攻毒160日龄血清学及病原学检测双阴性高产母鸭，每羽注射1ml，设置生理盐水对照组，连续观察记录7d。
54.结果显示，与对照组相比，不同浓度gs fc22菌株处理组攻毒3d后，均出现不同程
度的产蛋量下降、劣质蛋增多现象；实验组剖检可见输卵管黏膜出血、黏膜萎缩，如图3所示。7d后剖检可见，输卵管干酪性物质堵塞，卵黄性腹膜炎等病理变化，出现输卵管黏膜出血、输卵管子宫部褶皱消失、泄殖腔红肿出血等病理变化，如图4所示。同时得到此菌株的半数感染量(eid 50)为2
×
106cfu/ml。证实gs fc22菌株对蛋鸭生殖系统的致病能力，成功构建出感染输卵管炎鸡杆菌的鸡杆菌病蛋鸭感染模型。
55.实施例3灭活抗原的制备
56.将分离纯化后的gs fc22菌株接种于加有5％胎牛血清的tsb培养基中，37℃、180r/min震荡培养24h。取培养菌液5000r/min离心5min，去除上清，用无菌磷酸缓冲盐溶液将菌体重悬至2
×
108cfu/ml，加终浓度为0.4％甲醛，37℃静置灭活48h，期间每隔4h搅拌1次。
57.取灭活后的菌液涂布于含5％胎牛血清的tsa平板上，37℃培养24h，进行活菌检验，确保灭活彻底，平板上未长出菌落。然后与水包油包水佐剂充分混匀，使得输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株的终浓度为2
×
108cfu/ml，得到gs fc22菌株灭活疫苗。
58.选取160日龄、均重2.5kg的产蛋鸭30羽，随机分成3组，每组10羽，分别注射2ml gs fc22菌株灭活疫苗、2ml佐剂、2ml无菌生理盐水，对蛋鸭的采食量、精神状态、产蛋性能进行记录，7d后剖检查看输卵管健康状况。
59.结果显示，与对照组相比，疫苗免疫组和佐剂免疫组蛋鸭采食量、精神状态、产蛋性能等指标没有差异，剖检后未发现有输卵管炎症现象。由此可见，疫苗免疫无生物安全隐患。
60.实施例4免疫保护试验
61.将60羽120日龄未开产血清学及病原学检测的阴性蛋鸭平均分为灭活疫苗免疫组、佐剂免疫组和空白对照组，灭活疫苗免疫组、佐剂免疫组和空白对照组的制备同实施例3。
62.首免每羽胸部肌肉免疫0.5ml(1
×
108cfu/ml)；间隔14天后，进行二免，每羽胸部肌肉免疫1ml(2
×
108cfu/ml)。二免21天后，灭活疫苗免疫组、佐剂组和空白对照组同时腿部肌肉注射1ml(2
×
109cfu/ml)输卵管炎鸡杆菌gs fc22活菌。在首免前、攻毒前和攻毒后7d分别采集鸭输卵管拭子进行病原检测，攻毒后持续监测蛋鸭健康状况、产蛋性能，攻毒3周后取各组鸭输卵管进行临床病理分析。
63.结果显示，首免前和攻毒前，免疫组、佐剂组及对照组的输卵管拭子输卵管炎鸡杆菌检测均为阴性；攻毒后7d，灭活疫苗免疫组为阴性，佐剂免疫组及空白对照组为阳性。在攻毒后3周内各组每天产蛋量情况如图5所示，与免疫组相比，佐剂组和对照组蛋鸭均出现不同程度的产蛋下降；进一步统计产蛋的品质，发现残次蛋的数量明显增多，如图6所示，14d时佐剂组和对照组的薄壳蛋、沙壳蛋、畸形蛋等残次蛋数量明显上升；并且合格蛋的蛋壳品质也会变差，其表观症状如图7所示。同时，攻毒后21d，剖检发现佐剂免疫组有8羽、空白对照组有5羽出现了输卵管炎系列病理变化，免疫组鸭群输卵管形态结构均正常，剖检后也未发现有输卵管炎症。由此可见，采用gs fc22菌株制备灭活疫苗，对蛋鸭进行首次免疫和二次免疫，可以有效预防gs fc22菌株感染，避免gs fc22菌株对蛋鸭采食量、精神状态、产蛋性能等指标的影响。可见，本发明提供的输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株制备的灭活疫苗对蛋鸭具备较好的免疫保护作用。
64.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一株输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株，其特征在于，所述菌株已于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20221076。2.权利要求1所述输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株在制备蛋鸭鸡杆菌病疫苗中的应用。3.权利要求1所述输卵管炎鸡杆菌(gallibacterium salpingitidis)gs fc22菌株在构建蛋鸭感染鸡杆菌病的动物模型中的应用。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。5.一种蛋鸭鸡杆菌病灭活疫苗，其特征在于，含权利要求1所述输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株。6.根据权利要求5所述灭活疫苗，其特征在于，还含有疫苗佐剂，优选地佐剂为水包油包水佐剂。7.一种构建感染鸡杆菌病的蛋鸭模型的方法，其特征在于，采用权利要求1所述输卵管炎鸡杆菌gs fc22菌株感染蛋鸭，获得感染鸡杆菌病的蛋鸭模型。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述感染方法为胸部肌肉注射法。9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述gs fc22菌株的半数感染量为2
×
106cfu/ml。10.权利要求7～9中任一所述方法获得的蛋鸭模型在药物筛选、疫苗效果评价或致病机理研究中的应用。

技术总结
本发明公开了一株输卵管炎鸡杆菌(Gallibacterium salpingitidis)GS FC22菌株及其应用。所述输卵管炎鸡杆菌GS FC22菌株于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221076。本发明采用GS FC22菌株成功构建感染鸡杆菌病的蛋鸭模型，证实了GS FC22菌株对产蛋鸭生殖系统的致病性；将GS FC22菌株制备成灭活疫苗，具有生产成本低、安全性好、免疫效果佳等特点，进行免疫后能明显改善蛋鸭产蛋性能、临床症状，减少产蛋率的下降、残次蛋数量的上升，具备较好的免疫保护作用，为蛋鸭生殖道疾病防控提供新思路和方法。和方法。和方法。


技术研发人员：谭佳 谭美芳 宋文静 康昭风 黄江南 韦启鹏
受保护的技术使用者：江西省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/18