引物，试剂盒和检测方法及其应用与流程

1.本发明涉及分子生物学的技术领域，具体涉及一种检测cd16a基因rs396991位点多态性的引物，试剂盒和检测方法及其应用。


背景技术：

2.nk细胞在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力，其应用包括检查点阻断、adcc增强型抗体、激动剂抗体和多特异性nk细胞激动剂，以及过继nk细胞疗法等，这显著扩大了患者临床选择治疗方法的范围。人igg fcγiiia(又称fcgr3a或cd16a)是nk细胞表达的唯一fcγr受体，该受体结合附着在靶细胞的igg上，促进抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，adcc)。cd16a 158val/phe的多态性(rs396991位点)影响fcγr受体结合igg的亲和力，cd16a 158v比cd16a 158f编码的受体对igg1的亲和力高，表达高亲和力cd16a 158v(缬氨酸)等位基因的患者比表达低亲和力cd16a 158f(苯丙氨酸)等位基因和f/f基因型的患者有更好的临床疗效。目前，人群中低亲和力变异体为优势等位基因，cd16a 158v人群占比仅占31％，亚洲人群中其占比低至19.2％(数据源于ncbi-snp数据库rs396991)。
3.由于fcγr iiia(又称fcgr3a或cd16a)和fcγr iiib(又称fcgr3b或cd16b)之间的高度同源，cd16a有两个显性等位基因(158v或158f)；cd16b有两个主要等位基因即人中性粒细胞抗原1(na1)和na2，具有四个多态氨基酸。仅有两个氨基酸的差异用以区分cd16a和cd16b。其中，cd16a-158v和cd16b-na2的序列同一性大于97％，在细胞外抗体结合域中只有四个氨基酸残基不同。
4.因此，利用操作简便、准确度高、特异性好检测手段对cd16a基因rs396991位点多态性鉴定，对于推进nk细胞产品研发与临床应用至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的上述问题，提供了检测cd16a基因rs396991位点多态性的引物，含有该引物的试剂盒和检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法。利用本发明的检测cd16a基因rs396991位点多态性的引物，只需通过一次pcr反应(即一步法)，即可从pcr产物的电泳图中的特异性条带快速判断基因型cd16a158f/f、cd16a158f/v和cd16a158v/v，具有操作简便、准确度高、特异性好等优点。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种引物，所述引物包括检测cd16a基因rs396991位点多态性的第一引物组；
7.所述第一引物组包括：
8.cd16a-158f：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcttt-3’(seq id no:1)，
9.cd16a-158v：5
’‑
tctctgaagacacatttttactcccaac-3’(seq id no:2)，
10.所述cd16a-158f和所述cd16a-158v中，在靠近3’端的5个碱基内除第一个碱基外引入至少1个错配碱基。
11.cd16a基因编码的第158位氨基酸可以为val或phe，即rs396991位点的多态性。其中，val(缬氨酸，简称v)对应的密码子为gtt，phe(苯丙氨酸，简称f)对应的密码子为ttt。
12.本发明中，所述“cd16a-158f”是检测rs396991位点为ttt的引物，也可以称为“内引物-f(inner-f)”；所述“cd16a-158v”是检测rs396991位点为gtt的引物，也可以称为“内引物-r(inner-r)”。
13.所述的检测cd16a基因rs396991位点多态性的两条引物cd16a-158f和cd16a-158v中，引物的3’末端位于cd16a基因rs396991位点上，两条引物方向相反，且分属于不同基因型。
14.本发明的发明人发现，在检测cd16a基因rs396991位点多态性引物的靠近3’端的5个碱基内除第一个碱基外引入至少1个错配碱基，能够降低非靶标序列的扩增效率，提高pcr扩增的特异性，进而提高检测cd16a基因rs396991位点多态性的准确度。
15.在一实例中，引入错配碱基的位点不相邻。
16.本发明中，所述cd16a-158f和所述cd16a-158v引物中，当引入的错配碱基的位点不相邻时脱靶风险较小，检测准确性较高。
17.在一实例中，所述第一引物组包括：
18.cd16a-158f：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcv1tt-3’(seq id no:3)，
19.cd16a-158v：5
’‑
tctctgaagacacatttttactcd1cb1ac-3’(seq id no:4)和/或5
’‑
tctctgaagacacatttttactcccb2ac-3’(seq id no:5)，
20.其中，所述v1为a、c或g中的至少一种；所述b1为t、c或g中的至少一种；所述d1为a、t或g中的至少一种；所述b2为t、c或g中的至少一种。v1，b1，d1和b2为引入的错配碱基。
21.需要说明的是，所述v1为a、c或g中的至少一种，是指v1为a，v1为c和v1为g三种核苷序列不同的引物可以只存在一种，也可以存在两种的混合，或者可以存在三种的混合。
22.需要说明的是，所述b2为t、c或g中的至少一种，是指b2为t，b2为c和b2为g三种核苷序列不同的引物可以只存在一种，也可以存在两种的混合，或者可以存在三种的混合。
23.需要说明的是，当引入两个错配碱基时，所述b1为t、c或g中的至少一种，所述d1为a、t或g中的至少一种，可以指只存在一条引物序列，也可以指存在多种核酸序列不同的引物组合，根据随机排列组合选择核苷序列不同的引物组合即可。
24.在一实例中，所述第一引物组中，cd16a-158f和cd16a-158v可以为分别独立地包括1种、2种、3种或多于3种的核酸序列不同的引物组合。例如均引入一个错配碱基时，可以有以下几种组合：
25.(1)cd16a-158f引物中v1是c碱基，cd16a-158v引物中b2是c碱基；
26.(2)cd16a-158f引物为v1是c碱基和a碱基的两种引物组合，cd16a-158v引物为b2是c碱基和t碱基的两种引物组合；
27.(3)cd16a-158f引物为v1是c碱基、a碱基和g碱基的三种引物组合，cd16a-158v引物为b2是c碱基、t碱基和g碱基的三种引物组合。
28.其余引入两个错配碱基和引入三个错配碱基的情况与上述引入一个错配碱基的情况类似，cd16a-158f和cd16a-158v都可以为核酸序列不同的引物组合，对引物序列如何组合不作具体限定，只要引物或引物组合扩增的目的条带相同即可。
29.在一实例中，检测cd16a基因rs396991位点多态性的第一引物组包括：
30.cd16a-158f-f1：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcctt-3’(seq id no:6)，cd16a-158v-r1：5
’‑
gtctctgaagacacatttttactctcgac-3’(seq id no:7)；和/或cd16a-158v-r1’：5
’‑
tctctgaagacacatttttactccccac-3’(seq id no:8)；上述引物中，大写字母(加下划线)代表的碱基为引入错配的碱基。
31.在一优选实例中，检测cd16a基因rs396991位点多态性的第一引物组包括：cd16a-158f-f1：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcctt-3’(seq id no:6)，和cd16a-158v-r1：5
’‑
gtctctgaagacacatttttactctcgac-3’(seq id no:7)，上述引物中，大写字母(加下划线)代表的碱基为引入错配的碱基。
32.在一实例中，检测cd16a基因rs396991位点多态性的第一引物组包括：cd16a-158f-f1：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcctt-3’(seq id no:6)，和cd16a-158v-r1’：5
’‑
tctctgaagacacatttttactccccac-3’(seq id no:8)，上述引物中，大写字母(加下划线)代表的碱基为引入错配的碱基。
33.本发明还提供了扩增含rs396991位点多态性的cd16a基因序列的第二引物对；所述第二引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物与rs396991位点多态性的距离不等于所述反向引物与rs396991位点多态性的距离。
34.在一实例中，所述正向引物与rs396991位点多态性的距离，与所述反向引物与rs396991位点多态性的距离相差不小于50bp，优选不小于100bp。
35.通过限定正向引物和反向引物与cd16a基因rs396991位点多态性的距离不同，可以使采用第一引物组和第二引物对扩增的pcr产物大小不同，更容易在pcr产物的电泳条带中区分，方便判断cd16a基因rs396991位点的基因型。
36.在一实例中，所述第二引物对包括：
37.cd16a-f1：5
’‑
gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)，
38.cd16a-r1：5
’‑
gcacctcggttacttcatctgta-3’(seq id no:10)；和/或，
39.cd16a-f2：5
’‑
gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)，
40.cd16a-r2：5
’‑
ctttgatgtgaccttagggaaact-3’(seq id no:11)；和/或，
41.cd16a-f3：5
’‑
gccaccgtcaccttattcct-3’(seq id no:12)，
42.cd16a-r3：5
’‑
ttgcaggttccacacacagg-3’(seq id no:13)；和/或，
43.cd16a-f4：5
’‑
ggtcttggtatgacttcagttc-3’(seq id no:14)，
44.cd16a-r4：5
’‑
ttgcaggttccacacacagg-3’(seq id no:13)；
45.其中，所述“cd16a-f”代表正向引物的核苷酸序列；“cd16a-r”代表反向引物的核苷酸序列。上述4组引物对均可以特异性地扩增出包含rs396991位点的cd16a基因序列。所述“cd16a-f”和“cd16a-r”也可以分别称为“外引物-f”和“外引物-r”。
46.在一实例中，所述第二引物对为cd16a-f1：5
’‑
gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)和cd16a-r1：5
’‑
gcacctcggttacttcatctgta-3’(seq id no:10)。该引物对能够特异性地扩增出包含rs396991位点的cd16a基因序列，扩增获得的pcr产物片段全长为1583bp。
47.在一实例中，检测cd16a基因rs396991位点多态性的引物包括：
48.扩增cd16a基因序列的第二引物对：cd16a-f1：5
’‑
gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)和cd16a-r1：5
’‑
gcacctcggttacttcatctgta-3’(seq id no:10)；
49.以及检测rs396991位点多态性的第一引物组：cd16a-158f-f1：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcctt-3’(seq id no:6)，和cd16a-158v-r1：5
’‑
gtctctgaagacacatttttactctcgac-3’(seq id no:7)。
50.参见图1的反应原理示意图，在pcr反应过程中，若四条引物均与模板完全匹配，则可扩增出三种长度不一的产物(若两条内引物位于同一位点上，则无长片段扩增产物形成)；而如果两条内引物中有一条引物与模板不匹配，则能形成两种不同长度的pcr产物。因此，根据电泳后pcr产物大小即可判断rs396991位点的基因型。
51.本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的引物在检测cd16a基因rs396991位点多态性中的应用。
52.所述应用中，可以利用本发明第一方面提供的引物，结合本领域内常规使用的分子生物学方法(例如pcr、基因测序等)判断cd16a基因rs396991位点的基因型。
53.本发明第三方面提供了一种检测cd16a基因多态性的试剂盒，包含本发明第一方面所述的检测cd16a基因多态性的引物。
54.在一实例中，所述试剂盒还包括不具有3’端校正修饰功能的dna聚合酶。在利用所述的检测cd16a基因多态性的引物进行pcr扩增时，同时搭配使用不具有3’端校正修饰功能的dna聚合酶，可以避免引物中引入的错配碱基被修复，保留错配碱基的功能，提高引物的特异性。
55.在一实例中，所述不具有3’端校正修饰功能的dna聚合酶可以为不具有碱基错配修饰功能的taq酶。
56.在一实例中，所述试剂盒还包括pcr扩增所使用的试剂，例如dntp混合物、mgcl2和缓冲体系等。
57.本发明第四方面提供了一种检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，包括以下步骤：利用本发明第一方面所述的引物，或本发明第三方面所述的试剂盒进行pcr反应，依据pcr产物判断cd16a基因rs396991位点多态性。
58.本发明中，利用所述的引物或所述的试剂盒进行pcr反应后，获得的pcr产物可以直接进行凝胶电泳，并根据电泳条带的大小直接判断rs396991位点的基因型；也可以直接将pcr产物进行基因测序判断rs396991位点的基因型。
59.在一实例中，所述检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，包括以下步骤：
60.s1：准备待测样品；
61.s2：将所述待测样品作为模板，采用所述的引物或所述的试剂盒进行pcr反应，得到pcr产物；
62.s3：将所述pcr产物进行电泳，依据电泳条带判断cd16a基因多态性。
63.依据电泳条带判断cd16a基因多态性具体为：
64.pcr电泳结果如果出现了三条带，且与158f/v基因型的条带大小结果基本一致，则判断rs396991位点的基因型为f/v；
65.若pcr电泳结果出现了两条带，且与cd16a 158f/f基因型的条带大小结果基本一致，则判断rs396991位点的基因型为f/f；
66.若pcr电泳结果出现了两条带，且与cd16a 158v/v基因型的条带大小结果基本一致，则判断rs396991位点的基因型为v/v。
67.在一实例中，所述待测样品可以为提取的基因组dna，或其他可能含有dna的样品。
68.在一实例中，所述pcr反应为扩增阻滞突变系统pcr(tetra-primer amplification refractory mutation system pcr，tetra-primer arms-pcr)。
69.本发明基于四引物tetra-primer arms-pcr，建立了“一步法”快速检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，可以通过一次pcr反应(即“一步法”)，以及电泳图中的特异性dna条带，快速判断rs396991位点的基因型。
70.上述检测cd16a基因多态性的方法，通过一次普通的pcr反应程序，只需耗时90分钟，就可以同时进行96个样品检测，非常适用于大量样品cd16a基因筛查，不受限于高昂的仪器设备，具有成本低、耗时短和效率高的优点。
71.所述检测cd16a基因多态性的方法中，pcr反应条件可以根据实际需要进行调整，不作具体限定。
72.在一实例中，所述pcr体系如下表所示：
73.组分 pcr master mix(2
×
)5μl模板1μl(基因组dna：20-50ng)引物预混液1.5-2.5μlddh2o补足至10μl体系
74.其中，所述“pcr master mix”中含有不具有3’端校正修饰功能的dna聚合酶。
75.在一实例中，所述pcr反应的程序如下表所示：
[0076][0077]
其中，“/”代表没有循环数。
[0078]
在一实例中，所述引物的浓度为0.3μm-0.6μm。例如可以为0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm和0.6μm。
[0079]
在一优选实例中，所述引物的浓度为0.4μm-0.5μm。
[0080]
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
[0081]
(1)本发明提供的检测cd16a基因rs396991位点多态性的引物，只需通过一次pcr反应，即可从电泳图中的特异性dna条带，快速判断rs396991位点的基因型，具有操作简便、准确度高和特异性好等优点；
[0082]
(2)本发明提供的检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，通过一次普通的pcr反应程序，可以同时进行96个样品检测，非常适用于大量样品cd16a基因筛查，不受限于
高昂的仪器设备，成本低，耗时短，效率高。
[0083]
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
附图说明
[0084]
图1所示为本发明检测cd16a基因rs396991位点多态性的pcr反应原理示意图；
[0085]
图2所示为本发明实施例1的琼脂糖凝胶电泳图；
[0086]
图3所示为本发明实施例2-4的琼脂糖凝胶电泳图；
[0087]
图4所示为本发明实施例5和6的琼脂糖凝胶电泳图；
[0088]
图5所示为本发明验证例中编号01-05样品的pcr产物测序的部分结果示意图；
[0089]
图6所示为本发明验证例中编号06-10样品的pcr产物测序的部分结果示意图。
具体实施方式
[0090]
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0091]
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0092]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0093]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0094]
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
[0095]
实验例测序检测样品基因型
[0096]
设计一对引物，扩增出包含rs396991位点的cd16a基因序列，扩增获得的片段全长为800bp，正向引物核苷酸序列为：5
’‑
gccaccgtcaccttattcct-3’(seq id no:12)，反向引物核苷酸序列为：5
’‑
ttgcaggttccacacacagg-3’(seq id no:13)。
[0097]
以编号01-11的dna基因组样品为模板，参照下述实施例1的条件进行pcr扩增，pcr产物送测序，测序结果如图5和6所示。最终判断编号01-11的样品的基因型如下表1所示：
[0098]
表1
[0099][0100]
其中，158f/v基因型代表rs396991位点的等位基因是t/g型，158f/f基因型代表rs396991位点的等位基因是t/t型，158v/v基因型代表rs396991位点的等位基因是g/g型。
[0101]
实施例1
[0102]
一种检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，包括以下步骤：
[0103]
(1)以上述实验例测试后已知基因型且编号01-11的样品为模板：
[0104]
(2)配制引物预混合溶液，各组分比例如下表2所示：
[0105]
表2
[0106][0107]
(3)准备pcr预混合溶液(货号：翌圣10103es03)，含有taq dna polymerase、dntp混合物、mgcl2以及优化的缓冲体系。pcr反应时只需加入模板dna和引物预混合液，即可进行扩增，大大简化实验的操作步骤，pcr反应体系如下表3所示：
[0108]
表3
[0109]
组分 hieff unicon taqman pcr master mix(2
×
)5μl模板dna1μl(基因组dna：20-50ng)引物预混液1.9μlddh2o补足至10μl体系
[0110]
(4)进行pcr扩增，扩增程序如下表4所示：
[0111]
表4
[0112][0113]
(5)结果
[0114]
pcr产物的理论条带大小如下表5所示：
[0115]
表5
[0116][0117]
11个样品的pcr产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳的结果如图2所示。
[0118]
从图2的电泳结果可以看出，01，02，05和08泳道均出现了三条带，与表5中cd16a 158f/v基因型的条带大小结果基本一致。03，04，09和11泳道均出现了两条带，与表5中cd16a 158f/f基因型的条带大小结果基本一致。06，07和10泳道均出现了两条带，与表5中cd16a 158v/v基因型的条带大小结果基本一致。
[0119]
实施例2
[0120]
参照实施例1进行，主要不同之处在于，使用的引物不同，如下表6所示：
[0121]
表6
[0122][0123]
实施例3
[0124]
参照实施例1进行，主要不同之处在于，使用的引物不同，如下表7所示：
[0125]
表7
[0126][0127]
实施例4
[0128]
参照实施例1进行，主要不同之处在于，使用的引物不同，如下表8所示：
[0129]
表8
[0130][0131]
以已知基因型的3个样品(编号3：基因型为158f/f；编号4：基因型为158f/v；编号9：基因型为158v/v)的全基因组dna为模板，采用实施例2-4中提供的三组引物对进行pcr扩增反应，pcr反应体系与pcr反应条件与实施例1相同。
[0132]
实施例2-4的pcr产物的理论条带大小如下表9所示：
[0133]
表9
[0134][0135]
实施例2-4的电泳结果如图3所示(图中的编号
①
，
②
和
③
分别对应实施例2-4的引物)，电泳图显示只有实施例2提供的引物有疑似目的扩增条带，但明显可看到，实施例2提供的引物存在扩增特异性不够的问题。
[0136]
实施例2-4中，只有扩增cd16a基因的正向引物和反向引物不同，电泳条带的结果差异较大，表明特异性的扩增cd16a基因的引物与特异性的检测rs396991位点多态性的引物相互配合才能更准确地检测cd16a基因的rs396991位点多态性。
[0137]
实施例5
[0138]
参照实施例2进行，主要不同之处在于，使用的引物不同(检测rs396991位点为gtt的引物cd16a-158v进行了优化，引入2个错配碱基)，如下表10所示：
[0139]
表10
[0140][0141][0142]
实施例6
[0143]
参照实施例5进行，主要不同之处在于，使用的引物不同(扩增cd16a基因的反向引物cd16a-r进行了优化)，如下表11所示：
[0144]
表11
[0145][0146]
以已知基因型的4个样品(编号4：基因型为158f/v；编号5：基因型为158f/f；编号10：基因型为158v/v；编号ms05：基因型为158v/v)的全基因组dna为模板，根据实施例5和6中提供的两组引物对进行pcr反应，pcr反应体系与pcr反应条件与实施例1相同。
[0147]
实施例5和6的pcr产物的理论条带大小如下表12所示：
[0148]
表12
[0149][0150]
为提高引物扩增的特异性，实施例5中检测rs396991位点多态性的下游引物进行
了优化，在实施例2对应引物的基础上，再引入一个错配碱基得到cd16a-158v-r1引物(与实施例1相同)；实施例6中扩增cd16a基因序列的下游引物进行了优化，得到与实施例1相同的下游引物cd16a-r1。
[0151]
实施例5和6的电泳结果如图4所示(图4中的编号
①
和
②
分别对应实施例5和6的引物)，电泳图显示优化后的实施例6的引物的扩增特异性最佳。
[0152]
实施例7
[0153]
参照实施例1进行，主要不同之处在于，使用的引物不同。其中，cd16a-158f-f1的引物序列为：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcv1tt-3’(seq id no:3)，v1是c碱基、a碱基和g碱基三种引物的组合；
[0154]
cd16a-158v-r1的引物序列为：5
’‑
tctctgaagacacatttttactcd1cb1ac-3’(seq id no:4)，b1为t碱基，d1为g碱基；b1为c碱基，d1为a碱基；b1为g碱基，d1为t碱基三种引物的组合。
[0155]
本实施例pcr产物的电泳结果图与实施例1基本一致，不再重复提供。本实施例采用多种不同错配碱基的引物组合也能实现目的条带的扩增，这证明了引入不同错配碱基的引物均能够通过一次pcr反应快速判断rs396991位点的基因型，验证了引入不同错配碱基的引物成功鉴定rs396991位点基因型的可行性。
[0156]
对比例1
[0157]
参照实施例1进行，主要不同之处在于，检测rs396991位点多态性的引物组不同(未引入错配碱基)，如下表13所示：
[0158]
表13
[0159]
组分(浓度)引物序列cd16a-158f-f’(10μm)5
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acagcggctcctacttctgcagggggcttt-3’(seq id no:1)cd16a-158v-r’(10μm)5
’‑
tctctgaagacacatttttactcccaac-3’(seq id no:2)
[0160]
由于表13的引物与rs396991位点非完全互补时仅有3’末端一个碱基的错配，使得非完全互补片段也能扩增出来，会有非特异性条带的出现，很难通过pcr结果判断rs396991位点的基因型，因此未引入错配的引物无法采用“一步法”判断rs396991位点多态性。
[0161]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.引物，其特征在于，所述引物包括检测cd16a基因rs396991位点多态性的第一引物组；所述第一引物组包括：cd16a-158f：5
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acagcggctcctacttctgcagggggcttt-3’(seq id no:1)，cd16a-158v：5
’‑
tctctgaagacacatttttactcccaac-3’(seq id no:2)，所述cd16a-158f和所述cd16a-158v中，在靠近3’端的5个碱基内除第一个碱基外引入至少1个错配碱基。2.根据权利要求1所述的引物，其中，引入错配碱基的位点不相邻。3.根据权利要求1所述的引物，其中，所述第一引物组包括：cd16a-158f：5
’‑
acagcggctcctacttctgcagggggcv1tt-3’(seq id no:3)，cd16a-158v：5
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tctctgaagacacatttttactcd1cb1ac-3’(seq id no:4)和/或5
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tctctgaagacacatttttactcccb2ac-3’(seq id no:5)，其中，所述v1为a、c或g中的至少一种；所述b1为t、c或g中的至少一种；所述d1为a、t或g中的至少一种；所述b2为t、c或g中的至少一种。4.根据权利要求3所述的引物，其中，所述第一引物组包括：cd16a-158f-f1：5
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acagcggctcctacttctgcagggggcctt-3’(seq id no:6)，cd16a-158v-r1：5
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gtctctgaagacacatttttactctcgac-3’(seq id no:7)；和/或cd16a-158v-r1’：5
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tctctgaagacacatttttactccccac-3’(seq id no:8)。5.根据权利要求1-4任一项所述的引物，其中，所述引物还包括扩增含rs396991位点的cd16a基因序列的第二引物对，所述第二引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物与rs396991位点的距离不等于所述反向引物与rs396991位点的距离；所述第二引物对包括：cd16a-f1：5
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gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)，cd16a-r1：5
’‑
gcacctcggttacttcatctgta-3’(seq id no:10)；和/或，cd16a-f2：5
’‑
gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)，cd16a-r2：5
’‑
ctttgatgtgaccttagggaaact-3’(seq id no:11)；和/或，cd16ar-f3：5
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gccaccgtcaccttattcct-3’(seq id no:12)，cd16a-r3：5
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ttgcaggttccacacacagg-3’(seq id no:13)；和/或，cd16a-f4：5
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ggtcttggtatgacttcagttc-3’(seq id no:14)，cd16a-r4：5
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ttgcaggttccacacacagg-3’(seq id no:13)。6.根据权利要求5所述的引物，其中，所述第二引物对包括：cd16a-f1：5
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gagaataagctctggcgatac-3’(seq id no:9)和cd16a-r1：5
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gcacctcggttacttcatctgta-3’(seq id no:10)。7.权利要求1-6中任一项所述的引物在检测cd16a基因rs396991位点多态性中的应用。8.检测cd16a基因rs396991位点多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的引物。9.一种检测cd16a基因rs396991位点多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1-6中任一项所述的引物，或权利要求7或8所述的试剂盒进行pcr反应，依据pcr产物判断cd16a基因rs396991位点多态性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：s1：准备待测样品；s2：将所述待测样品作为模板，采用所述的引物或所述的试剂盒进行pcr反应，得到pcr产物；s3：将所述pcr产物进行电泳，依据电泳条带判断cd16a基因rs396991位点多态性。

技术总结
本发明涉及分子生物学的技术领域，提供了一种检测CD16A基因rs396991位点多态性的引物，试剂盒和检测方法及其应用。该引物包括：检测rs396991位点多态性的第一引物组：5


技术研发人员：李华顺 黎军 徐绮嫔
受保护的技术使用者：苏州因特药物研发有限公司
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/18