一种pH响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法和应用与流程

一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及sirna靶向型药物载体技术领域，尤其涉及一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.小干扰rna(small interfering rna，sirna)是双链的小分子核酸，在转录后发挥rna干扰作用(rnai)，可特异性抑制疾病相关靶基因的rna的表达从而发挥治疗效果，因此，利用rna干扰可以起到与靶向药物相同的作用。随着sirna生物学机制的阐明和sirna合成方法的快速发展，绝大多数的基因可通过sirna技术进行沉默，而sirna则主要作用于rna，其能够特异性抑制靶基因的表达，作用位点专一，通常不影响正常基因表达，因此sirna作为靶向药物应用时，会具有更好的选择性及特异性。目前，国际上已有多个sirna药物获批fda上市许可，国内亦有多款sirna药物处于不同研发阶段。目前sirna体内应用面临的主要难题有：sirna的稳定性较差，半衰期较短，需要提高靶向性，以达到高效递送，以及缺少细胞内涵体的逃逸能力等。
3.脂质纳米粒(lnp)是一种具有均匀脂质核心的脂质囊泡，具有很高的生物相容性和生物可降解性，因此被用来递送多种活性成分。阳离子聚合物可以通过其正电荷属性负载负电荷的药物和基因，递送其进入靶细胞，发挥药物或基因的功能，达到治疗疾病的目的。含有阳离子材料的脂质纳米粒已在世界范围内广泛用于研究sirna递送，因为这些载体可以通过静电相互作用保持带负电荷的sirna；此外，带正电的载体还与带负电的细胞表面相互作用，并将其sirna输送到细胞中。尽管带正电荷的脂质体能够在低浓度的sirna下诱导高细胞溶质sirna递送和高效的基因沉默，但它们的正电荷会引起与生理环境中细胞膜的非特异性相互作用并诱导细胞发生毒性活动，例如产生活性氧物种、能量代谢中断和细胞死亡，因此，开发ph响应型聚合物对于减少非特异性互作及提高sirna递送效率很重要。
4.糖尿病作为非传染性疾病，在自然病程中，胰岛β细胞功能随着病程的延长而逐渐下降，胰岛素分泌量日益减少，因而对降糖药物的需求和依赖程度会逐渐增大，长时间用药机体产生耐药性，加大用药剂量的同时，药物的毒副作用也增加，因此迫切需要开发能提高药效、毒副作用小且药物递送效率高的靶向递送载体。
5.聚集诱导发光(aggregation-induced emission，aie)，是指一类有机分子在溶液中溶解状态下发光很弱或者不发光，但当分子聚集时能发出强的荧光的发光现象。aie分子在水中形成聚集体后仍能发射强的荧光，不会因聚集而荧光淬灭，因而在生物领域具有显著的应用优势。材料作为新型的有机荧光材料具有一系列独特的优势，包括灵敏度高、聚集态发射效率高、光稳定性好、斯托克斯(stokes)位移大、背景噪声低、长期无创及生物可视化能力强等，已被成功用于细胞荧光追踪探针，为基于影像指导的疾病临床治疗。


技术实现要素：

6.针对现有技术中脂质体的正电荷引起的细胞膜非特异性互作、诱导细胞发生毒性
活动以及缺乏高效递送糖尿病药物的载体的问题，本发明提供了一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法和应用。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种阳离子聚合物，所述阳离子聚合物的结构式如下所示：
[0009][0010]
本发明还提供了上述阳离子聚合物的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)将聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺混合，超声助溶，待1/2～3/4的固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解；
[0012]
(2)对上述溶解完成的溶液依次进行透析、离心，然后取上清液进行冻干，得阳离子聚合物。
[0013]
优选的，步骤(1)中所述的聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺的混合比例为1～3g:1～3g:1～2g:0.05～0.15g:28～32ml，所述超声的功率为450～550w，所述磁力搅拌的温度为50～100℃，所述磁力搅拌的转速为250～350rpm；
[0014]
步骤(2)中所述透析的截留分子量为3000～4000d，所述透析的时间为12～24h，所述离心的转速为3500～4500rpm，所述离心的时间为25～35s，所述冻干的温度为-45～-55℃，所述冻干的时间为40～50h。
[0015]
本发明还提供了一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，包括上述的阳离子聚合
物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子。
[0016]
优选的，所述阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子的质量比为23～30:5～8:13～15.6:3.2～3.7；
[0017]
所述靶向分子包括胆固醇-聚乙二醇-半乳糖、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-半乳糖和氨基-聚乙二醇-半乳糖中的一种；
[0018]
所述药物递送载体还包括近红外二区发光染料，所述近红外二区发光染料包括4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物，所述4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物与所述阳离子聚合物的质量比为0.8～1:23～30。
[0019]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
(1)将上述阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇、靶向分子与乙醇溶液混合，得混合液1；
[0021]
(2)将sirna与tris-hclbuffer混合，得混合液2；
[0022]
(3)采用乙醇注射沉淀法将所述混合液1与混合液2混合，得混合液3；
[0023]
(4)对所述混合液3进行透析，得ph响应型的肝靶向的药物递送载体。
[0024]
优选的，步骤(1)中所述乙醇溶液与所述阳离子聚合物的体积质量比为7～9ml:23～30mg，所述乙醇溶液的体积浓度为70～80％；
[0025]
步骤(1)中所述阳离子聚合物中总氮元素的物质的量与步骤(2)中所述sirna中总磷元素的物质的量之比为1:1～10；
[0026]
步骤(2)中所述sirna的核苷酸序列如seq id no.1所示；
[0027]
步骤(2)中所述sirna与tris-hclbuffer的混合比例为100～120μg：20～30ml。
[0028]
优选的，步骤(4)中所述透析的截留分子量为3000～4000d，所述透析的时间为20～25h。
[0029]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用。
[0030]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0032]
1、本发明提供的阳离子聚合物，可与带负电荷的sirna通过电荷吸引作用复合后，使得药物递送载体更稳定，粒径分布更集中，有利于药物递送载体在药物输送方面的应用。
[0033]
2、经实验表明，本发明制备的药物递送载体能将sirna包裹递送至人肝癌细胞，并成功进入细胞，实现sirna的内涵体逃逸，实现了良好的递送及释放效果；且活体成像结果表明，小鼠肝脏荧光强度最强，即阳离子脂质体复合物纳米颗粒在对小鼠尾静脉注射24h后富集在肝脏，说明了本发明制备的药物递送载体在活体内的肝脏靶向作用。
附图说明
[0034]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。
[0035]
图1为本发明实施例1制备阳离子聚合物的化学反应式；
[0036]
图2为本发明实施例1制备的肝靶向的药物递送载体；
[0037]
图3为本发明实施例1制备的肝靶向的药物递送载体的粒径和表面电位(zetapotential)的测定结果；
[0038]
图4为本发明实施例2制备的肝靶向的药物递送载体的粒径和表面电位(zetapotential)的测定结果；
[0039]
图5为本发明实施例3制备的肝靶向的药物递送载体的粒径和表面电位(zetapotential)的测定结果；
[0040]
图6为本发明实施例1制备的阳离子聚合物与sirna吸附实验检测结果；
[0041]
图7为本发明实施例1制备的肝靶向的药物递送载体的递送效果检测结果(注：左图表示在荧光倒置显微镜观测下，明场的视野；右图表示在荧光倒置显微镜观测下，绿光激发通道的视野)；
[0042]
图8为本发明实施例2制备的肝靶向的药物递送载体的转染效果检测结果；
[0043]
图9为本发明实施例2半乳糖修饰的靶向效果验证结果；
[0044]
图10为本发明实施例3制备的肝靶向的药物递送载体的肝靶向效果验证结果。
具体实施方式
[0045]
本发明提供了一种阳离子聚合物，所述阳离子聚合物的结构式如下所示：
[0046][0047]
本发明还提供了上述阳离子聚合物的制备方法，包括如下步骤：
[0048]
(1)将聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺混合，超声助溶，待1/2～3/4的固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解；
[0049]
(2)对上述溶解完成的溶液依次进行透析、离心，然后取上清液进行冻干，得阳离子聚合物。
[0050]
在本发明中，步骤(1)中所述待1/2～3/4的固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解，进一步优选为待2/3的固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解。
[0051]
在本发明中，步骤(1)中所述的聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺的混合比例优选为1～3g:1～3g:1～2g:0.05～0.15g:28～32ml，进一步优选为2g:2g:1.5g:0.1g:30ml；所述超声的功率优选为450～550w，进一步优选为480～520w，更进一步优选为500w；所述磁力搅拌的温度优选为50～100℃，进一步优选为55～70℃，更进一步优选为60℃；所述磁力搅拌的转速优选为250～350rpm，进一步优选为280～320rpm，更进一步优选为300rpm。
[0052]
在本发明中，步骤(2)中所述透析的截留分子量优选为3000～4000d，进一步优选为3300～3700d，更进一步优选为3500d；所述透析的时间优选为12～24h，进一步优选为16～20h，更进一步优选为18h；所述离心的转速优选为3500～4500rpm，进一步优选为3800～
4200rpm，更进一步优选为4000rpm；所述离心的时间优选为25～35s，进一步优选为28～32s，更进一步优选为30s；所述冻干的温度优选为-45～-55℃，进一步优选为-48～-52℃，更进一步优选为-50℃；所述冻干的时间优选为40～50h，进一步优选为45～49h，更进一步优选为48h。
[0053]
在本发明中，步骤(2)中进行透析的目的是除去4-二甲氨基吡啶、多余的组胺二盐酸盐和溶剂n,n二甲基甲酰胺。
[0054]
本发明还提供了一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，包括上述的阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子。
[0055]
在本发明中，所述阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子的质量比优选为23～30:5～8:13～15.6:3.2～3.7，进一步优选为25:7.9:15:3.5。
[0056]
在本发明中，所述靶向分子优选包括胆固醇-聚乙二醇-半乳糖、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-半乳糖和氨基-聚乙二醇-半乳糖中的一种。
[0057]
在本发明中，所述药物递送载体还优选包括近红外二区发光染料，所述近红外二区发光染料优选包括4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物，所述4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物与所述阳离子聚合物的的质量比优选为0.8～1:23～30，进一步优选为0.9:30。
[0058]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备方法，包括如下步骤：
[0059]
(1)将上述阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇、靶向分子与乙醇溶液混合，得混合液1；
[0060]
(2)将sirna与tris-hclbuffer混合，得混合液2；
[0061]
(3)采用乙醇注射沉淀法将所述混合液1与混合液2混合，得混合液3；
[0062]
(4)对所述混合液3进行透析，得ph响应型的肝靶向的药物递送载体。
[0063]
在本发明中，步骤(1)中所述乙醇溶液与所述阳离子聚合物的体积质量比优选为7～9ml:23～30mg，进一步优选为8ml:25mg；所述乙醇溶液的体积浓度优选为70～80％，进一步优选为72～78％，更进一步优选为75％。
[0064]
在本发明中，步骤(1)中所述阳离子聚合物中总氮元素的物质的量与步骤(2)中所述sirna中总磷元素的物质的量之比优选为1:1～10，进一步优选为1:8。
[0065]
在本发明中，步骤(2)中所述sirna的核苷酸序列优选如seq id no.1所示。
[0066]
在本发明中，步骤(2)中所述sirna与tris-hclbuffer的混合比例优选为100～120μg：20～30ml，进一步优选为105～115μg：22～28ml，更进一步优选为110μg：25ml。
[0067]
在本发明中，步骤(3)中采用乙醇注射沉淀法有助于将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与sirna在tris-hclbuffer中快速混合。
[0068]
在本发明中，步骤(4)中所述透析的截留分子量优选为3000～4000d，进一步优选为3200～3800d，更进一步优选为3500d；所述透析的时间优选为20～25h，进一步优选为23～25h，更进一步优选为24h。
[0069]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用。
[0070]
本发明还提供了上述一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
[0071]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0072]
以下实施例中所称的“阳离子脂质体复合物纳米颗粒”即为本发明所述“一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体”；以下实施例中的各原料均为市售可得。
[0073]
实施例1
[0074]
(1)阳离子聚合物的制备(化学反应式如图1所示)：
[0075]
取聚琥珀酰亚胺psi粉末2g、油胺oam2g、组胺二盐酸盐1.5g和4-二甲氨基吡啶0.1g置于圆底烧瓶中，在瓶中加入30ml n,n二甲基甲酰胺(dmf)，超声破碎仪超声助溶(超声的功率为500w)；待2/3的聚合物溶解于n,n二甲基甲酰胺后，在圆底烧瓶中加入磁珠，将圆底烧瓶置于磁力搅拌油浴锅中，上端连接冷凝管，60℃、300rpm下加热搅拌过夜至聚合物全部溶解；将溶解后的溶液置于3500d透析袋内透析18h，除去4-二甲氨基吡啶、多余的组胺二盐酸盐和溶剂n,n二甲基甲酰胺；透析后，将透析袋中的液体转移至离心管中，4000rpm，30s；取离心液体部分用冻干机在-50℃下冻干48h，得到产物阳离子聚合物。
[0076]
(2)一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备：
[0077]
精密称取25mg上述阳离子聚合物，7.9mg dspc(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，15mg chol(胆固醇)，3.5mg cholesterol-peg-galactose(胆固醇-聚乙二醇-半乳糖)；
[0078]
其中，dspc的结构式如下所示：
[0079][0080]
chol的结构式如下所示：
[0081][0082]
cholesterol-peg-galactose的结构式如下所示：
[0083][0084]
将上述称取的各组分溶于8ml体积浓度为70％的乙醇溶液，将100μgsirna(所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt)溶解在20mltris-hclbuffer中，采用乙醇注射沉淀法组装负载sirna的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与sirna在tris-hcl buffer中快速混合，然后将混合物用超纯水透析(截留分子量3000d，20h)，除去乙醇，得到最终的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。
[0085]
实施例2
[0086]
一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备：
[0087]
精密称取23mg实施例1制备的阳离子聚合物，5mg dspc(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，13mg chol(胆固醇)，3.2mg dspe-peg-galactose(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-半乳糖)；
[0088]
其中，dspe-peg-galactose的结构式如下所示：
[0089][0090]
将上述称取的各组分溶于8ml体积浓度为75％的乙醇溶液，将110μgsirna(所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt)溶解在25mltris-hclbuffer中，采用乙醇注射沉淀法组装负载sirna的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与sirna在tris-hclbuffer中快速混合，然后将混合物
用超纯水透析(截留分子量3500d，24h)，除去乙醇，得到最终的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。
[0091]
实施例3
[0092]
一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备：
[0093]
精密称取30mg实施例1制备的阳离子聚合物，8mg dspc(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，15.6mg chol(胆固醇)，3.7mgnh
2-peg-galactose(氨基-聚乙二醇-半乳糖)，0.9mg 4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物；
[0094]
其中，nh
2-peg-galactose的结构式如下所示：
[0095][0096]
4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物的结构式如下所示：
[0097][0098]
将上述称取的各组分溶于8ml体积浓度为80％的乙醇溶液，将120μgsirna(所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt)溶解在30mltris-hclbuffer中，采用乙醇注射沉淀法组装负载sirna的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，该方法将溶解在乙醇溶液中的脂质组分与sirna在tris-hcl buffer中快速混合，然后将混合物用超纯水透析(截留分子量4000d，25h)，除去乙醇，得到最终的阳离子脂质体复合物纳米颗粒。
[0099]
实验例1
[0100]
阳离子脂质体复合物纳米颗粒的粒径和表面电位(zetapotential)的测定：
[0101]
使用malvern zetasizernano zs90纳米粒径电位分析仪进行分析。具体步骤如下：
[0102]
(1)分别准备实施例1、实施例2、实施例3所制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒三组样本，其中lnps/sirna的混合比例按照n/p＝1：8计算；
[0103]
(2)将上述三组样本分别取15μl，滴入马尔文微量样品池中，放入仪器，进行粒径
的测定，每个样本测定五次取平均值；
[0104]
(3)将上述三组样本分别取50μl，定容至1ml，滴入马尔文电位样品池，放入仪器，进行zeta电位的测定，每个样本测定三次取平均值。
[0105]
阳离子脂质体复合物纳米颗粒的平均粒径和分布是通过dls在25℃检测得到。每个样本重复测试三次，取平均值。实施例1、实施例2和实施例3的检测结果分别如图3、图4和图5所示。由图3、图4和图5可知，三组样本制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒的平均粒径介于50nm到200nm之间，电位介于30mv到36mv之间。由于纳米颗粒需要进入细胞释放sirna，所以纳米颗粒的粒径在200nm以下利于其进入细胞；样本的zeta电位大小决定液体中的粒子是稳定存在还是趋向于絮凝，zeta电位＜-30mv或＞30mv通常足以维持颗粒间排斥和颗粒的稳定悬浮。本发明的纳米颗粒中含有阳离子聚合物，其可与带负电荷的sirna通过电荷吸引作用复合后，使得纳米颗粒更稳定，粒径分布更集中，有利于脂质体复合物纳米颗粒在药物输送方面的应用。
[0106]
实验例2
[0107]
阳离子聚合物与sirna的吸附实验检测：
[0108]
(1)将实施例1制备的阳离子聚合物与一段靶向gfp的sirna(所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt)分别按照一定的n/p摩尔比进行混合，分别为1：1、1：2、1：4、1：6、1：8、1：10，n代表含阳离子聚合物中的总氮元素的物质的量，p代表乱序sirna中总磷元素的物质的量；
[0109]
(2)称取0.5g琼脂糖，加入5ml 10x电泳缓冲液，再加入45ml蒸馏水，加热溶解，配制成1％琼脂糖凝胶，稍凉后加入显色荧光核酸染色剂gelstain，将琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，电泳槽加入新配置的电泳缓冲液；
[0110]
(3)将dnamarker与样品滴加至琼脂糖凝胶泳道中，220v，100a电泳40分钟，凝胶显影仪显影检测。
[0111]
检测结果如图6所示。由图6可知，在n/p为1：10时，出现游离sirna的条带，即阳离子聚合物无法再吸附的sirna，表明1：10不可取。故在n/p为1：8左右时，阳离子聚合物与sirna的结合率是最高的。
[0112]
实验例3
[0113]
阳离子脂质体复合物纳米颗粒递送效果检测：
[0114]
(1)选取染料cy3修饰一段靶向gfp的sirna，所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt，利用本发明实施例1制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，将乱序sirna包裹在内，向人肝癌细胞hepg2中转染；
[0115]
(2)将生长状态良好的人肝癌细胞系hepg2用胰蛋白酶消化，以1
×
104cells/孔的密度接种于8孔板，添加含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素与链霉素)的dmem培养基，37℃，5％co2过夜培养，培养24h细胞贴壁后，更换含有制备的包含sirna的阳离子脂质体复合物纳米颗粒的dmem培养基，温育24h；
[0116]
(3)在sirna转染hepg2细胞24h后，利用荧光倒置显微镜观测。
[0117]
实验结果如图7所示。由图7可知，利用本发明制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，向人肝癌细胞hepg2中转染，在sirna转染hepg2细胞24h后，采用荧光倒置显微镜观测到cy3分布在细胞质中。说明本发明的纳米颗粒负载sirna后，成功将sirna递送至靶细胞，并
进入细胞膜，完成靶向递送。
[0118]
实验例4
[0119]
阳离子脂质体复合物纳米颗粒转染效果检测：
[0120]
(1)gfp标记人肝癌细胞系hepg2：
[0121]
选取美国维多利亚西海岸的绿色水母荧光蛋白(gfp)的mrna作为靶基因，利用慢病毒颗粒使人肝癌细胞系hepg2稳定表达gfp，再利用本发明实施例2制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒，向hepg2中转染靶向gfp的sirna，所述sirna的5
’‑3’
的序列如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt。
[0122]
(2)检测hepg2细胞中gfp表达水平：
[0123]
将hepg2细胞按照1
×
104cells/孔的密度接种于96孔板，每孔添加100μl含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的dmem培养基，37℃、5％co2条件培养箱培养24h后，弃去培养基，pbs清洗两次，加入无血清的dmem，一组为实验组(inp)，每孔加入20μl本发明实施例2制备的脂质体复合物纳米颗粒(含sirna(序列5
’‑3’
如seq id no.1所示：gcaccaucuucuucaaggadtdt))；另一组为对照组(裸sirna)，以无脂质体载体的裸sirna在其他条件相同情况下进行转染，另一组为空白对照组，即不添加脂质体载体和sirna在其他条件相同情况下进行转染；继续在培养箱中培养5h后吸去培养液，用pbs洗两次，加入预热的含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基；所述37℃、5％co2条件培养箱分别培养24h、48h后，放入多功能酶标仪biotek中，振板10s后，设置激发488nm，发射510nm检测荧光强度。
[0124]
实验结果如图8所示。由图8可知，培养24h后，实验组(inp)荧光强度最弱，对照组(裸sirna)荧光强度次之，空白对照组荧光强度最强(图8中的左图)；培养48h后，实验组(inp)荧光强度最弱，空白对照组荧光强度最强，对照组(裸sirna)荧光强度略低于空白对照组(图8中的右图)；培养24h、48h后测得的实验组(inp)荧光强度均最弱，这表明利用本发明实施例2制备的纳米颗粒能将sirna包裹递送至人肝癌细胞，并成功进入细胞，实现sirna的内涵体逃逸，实现了良好的递送及释放效果。
[0125]
实验例5
[0126]-galactose(半乳糖)修饰的靶向效果验证：
[0127]
(1)选取美国维多利亚西海岸的绿色水母荧光蛋白(gfp)的mrna作为靶基因，利用慢病毒颗粒使人肝癌细胞系hepg2和huv人脐静脉内皮细胞稳定表达gfp，将hepg2人肝癌细胞和huv人脐静脉内皮细胞分别按照1
×
104cells/孔的密度接种于96孔板，每孔加100μl含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，37℃、5％co2条件下培养箱培养24h；取上述hepg2和huv，弃去培养基，pbs清洗两次加入无血清的dmem，不添加阳离子脂质体复合物纳米颗粒的hepg2(hepg2-blank)和huv(huv-blank)，作为空白对照组；向hepg2细胞中添加负载gfp-sirna的本发明实施例2提供的阳离子脂质体复合物纳米颗粒(hepg2+lnp)，向huv细胞中添加负载gfp-sirna的本发明实施例2提供的含咪唑的阳离子脂质体复合物纳米颗粒(huv+lnp)作为实验组。
[0128]
(2)将上述不同处理的实验样品继续培养5h后吸去培养液，pbs清洗两次，加入预热的含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，37℃、5％co2条件下培养箱分别培养24h、48h后；上述待测样品置于酶标仪biotek中，振板10s后，设置激发488nm，发射510nm检测荧光强度。
[0129]
实验结果如图9所示。由图9可知，实验组hepg2+lnp荧光强度最弱，huv+lnp次之，空白组hepg2-blank及huv-blank检测荧光强度较强，但两空白对照组荧光强度差距不显著；即相比于huv人脐静脉内皮细胞，本发明实施例2制备的阳离子脂质体复合物纳米颗粒对于人肝癌细胞系hepg2的转染效果更好，说明其具有较好的肝脏靶向性。
[0130]
实验例6
[0131]
阳离子脂质体复合物纳米颗粒的肝靶向效果验证：
[0132]
选取6～8周龄雌性balb/c小鼠进行活体成像，具体实验步骤如下：
[0133]
(1)将balb/c小鼠除头部之外的毛发全部剃除，提前准备好麻醉剂水合氯醛，小鼠一般按照0.6ml/100g腹腔注射，麻醉期间用镊子捏小鼠尾尖，判断小鼠麻醉状态；
[0134]
(2)待小鼠麻醉后，使用胰岛素针吸取本发明实施例3提供的阳离子脂质体复合物纳米颗粒进行尾静脉注射，每只小鼠注射的剂量为100μl；
[0135]
(3)分别在注射前、注射后24h，将小鼠放入近红外二区小动物活体成像仪中，使用808nm激光器进行拍照，并且在24h活体成像之后，将小鼠进行解剖，对心、肝、脾、肺、肾进行成像。
[0136]
实验结果如图10所示。由图10可知，在小鼠肝脏部位可见明显的荧光；随后将小鼠解剖，将小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行拍照，结果表明小鼠肝脏的荧光强度最强，即阳离子脂质体复合物纳米颗粒在对小鼠尾静脉注射24h后富集在肝脏，这说明本发明实施例3制备的脂质体复合物纳米颗粒在活体内的肝脏靶向作用。
[0137]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种阳离子聚合物，其特征在于，所述阳离子聚合物的结构式如下所示：2.权利要求1所述的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺混合，超声助溶，待1/2～3/4的固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解；(2)对上述溶解完成的溶液依次进行透析、离心，然后取上清液进行冻干，得阳离子聚合物。3.根据权利要求2所述的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与n,n二甲基甲酰胺的混合比例为1～3g:1～3g:1～2g:0.05～0.15g:28～32ml，所述超声的功率为450～550w，所述磁力搅拌的温度为50～100℃，所述磁力搅拌的转速为250～350rpm；步骤(2)中所述透析的截留分子量为3000～4000d，所述透析的时间为12～24h，所述离心的转速为3500～4500rpm，所述离心的时间为25～35s，所述冻干的温度为-45～-55℃，所述冻干的时间为40～50h。4.一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，其特征在于，包括权利要求1所述的阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子。5.根据权利要求4所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，其特征在于，所述阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子的质量比为23～30:5～8:13～15.6:
3.2～3.7；所述靶向分子包括胆固醇-聚乙二醇-半乳糖、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-半乳糖和氨基-聚乙二醇-半乳糖中的一种；所述药物递送载体还包括近红外二区发光染料，所述近红外二区发光染料包括4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物，所述4，8-二取代苯并双噻二唑衍生物与所述阳离子聚合物的质量比为0.8～1:23～30。6.权利要求4或5所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的阳离子聚合物，二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇、靶向分子与乙醇溶液混合，得混合液1；(2)将sirna与tris-hclbuffer混合，得混合液2；(3)采用乙醇注射沉淀法将所述混合液1与混合液2混合，得混合液3；(4)对所述混合液3进行透析，得ph响应型的肝靶向的药物递送载体。7.根据权利要求6所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇溶液与所述阳离子聚合物的体积质量比为7～9ml:23～30mg，所述乙醇溶液的体积浓度为70～80％；步骤(1)中所述阳离子聚合物中总氮元素的物质的量与步骤(2)中所述sirna中总磷元素的物质的量之比为1:1～10；步骤(2)中所述sirna的核苷酸序列如seq id no.1所示；步骤(2)中所述sirna与tris-hclbuffer的混合比例为100～120μg：20～30ml。8.根据权利要求6或7所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述透析的截留分子量为3000～4000d，所述透析的时间为20～25h。9.权利要求4或5所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，或权利要求6～8任意一项所述的制备方法制备得到的ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备肝脏靶向药物中的应用。10.权利要求4或5所述的一种ph响应型的肝靶向的药物递送载体，或权利要求6～8任意一项所述的制备方法制备得到的ph响应型的肝靶向的药物递送载体在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

技术总结
本发明属于siRNA靶向型药物载体技术领域，本发明提供了一种pH响应型的肝靶向的药物递送载体及其制备方法和应用。本发明是将聚琥珀酰亚胺粉末、油胺、组胺二盐酸盐、4-二甲氨基吡啶与N,N二甲基甲酰胺混合，超声助溶，待部分固体溶解后加入磁珠进行磁力搅拌，至固体全部溶解；对上述溶解完成的溶液依次进行透析、离心，然后取上清液进行冻干，得阳离子聚合物。然后利用阳离子聚合物与二硬脂酰磷脂酰胆碱，胆固醇和靶向分子复合，再负载siRNA制成pH响应型的肝靶向的药物递送载体。经实验验证表明，本发明制备的药物递送载体具有良好的肝脏靶向作用。向作用。向作用。


技术研发人员：王卫中 蔡林涛 张鹏飞 莱昂纳多
受保护的技术使用者：深圳市华元生物技术股份有限公司
技术研发日：2023.04.03
技术公布日：2023/7/18