同时测定人血中11种苯甲酸酯类物质和含氯抗菌剂含量的试剂盒、方法及组合物用途与流程

1.本发明属于化学分析技术领域，涉及同时测定人血中11种苯甲酸酯类物质和含氯抗菌剂含量的试剂盒、方法及组合物用途。


背景技术：

2.对羟基苯甲酸酯类化合物属于防腐剂，三氯生和三氯卡班属于抗菌剂，多用于各种食品、药品以及化妆品中，因而在日常环境中普遍存在，极易通过皮肤接触和日常饮食进入人体，对羟基苯甲酸酯类化合物在体内的主要代谢物为对羟基苯甲酸，而对羟基苯甲酸会进一步经过氧化代谢再次引入一个羟基成为双羟基苯甲酸，该类化合物属于内分泌干扰物质，具有雌激素活性，对生殖功能具有一定的影响，因而近年来研究尿液和血液中该类化合物的浓度与各类激素异常之间的相关性成为热点。
3.目前该类物质常用固相萃取或多次液液萃取的方法进行检测，如文献qiong luo , hongna zhang, zongwei cai, et al. simultaneous determination of triclosan, triclocarban, triclocarban metabolites and byproducts in urine and serum by ultra-high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry [j]. rapid commun mass spectrom, 2021,35(14):136390中，取样量为500 μl，采用waters oasis hlb板进行spe固相萃取，该方法取样量大，需要使用spe板，成本高且前处理比较复杂。又如专利cn113671093a，该专利中的样本类型为尿液，尿液中羟基苯甲酸酯类化合物会与葡萄糖醛酸结合，通过酶解后使用液液萃取的方法，共需进行三次萃取，尿液中羟基苯甲酸酯类化合物的含量与血清中相比较高，因而尿液样本的检测难度较血清样本的检测难度低，但是专利中提供的对羟基苯甲酸（4-hb）的回收率仅60%左右。
[0004]
此外，该类化合物作为防腐剂和抗菌剂日常运用广泛，因而在检测过程中塑料管、溶剂和仪器管路中常有本底，根据文献中报道的三氯生（tcs）的定量下限为0.9 ng/ml，对痕量检测造成了很大干扰。
[0005]
因此，目前亟需一种对苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂进行检测的新技术，能提高该类化合物从样本中提取的效率，检测指标的回收率，以及降低定量下限以增加灵敏度。


技术实现要素：

[0006]
为解决上述问题，本发明的目的在于提供同时测定人血中11种苯甲酸酯类物质和含氯抗菌剂含量的试剂盒、方法及组合物用途；通过液相色谱串联质谱同时测定人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂。
[0007]
所述的11种苯甲酸酯类物质和含氯抗菌剂是指11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂；所述11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂为：对羟基苯甲酸丁酯（bup），对羟基苯甲酸甲酯（mep），对羟基苯甲酸乙酯（etp），3,4-二羟基苯甲酸乙酯（oh-etp），3,4-二羟基苯甲
酸（3,4-dhb），对羟基苯甲酸苯甲酯（bzp），对羟基苯甲酸庚酯（hep），对羟基苯甲酸（4-hb）和3,4-二羟基苯甲酸甲酯（oh-mep），三氯卡班（tcc），三氯生（tcs）。
[0008]
首先， 本发明创造主要使用了znso4溶液和乙腈共沉淀血清中的蛋白，液液萃取使用的试剂是乙酸乙酯（含1%甲酸（fa）），提高了3，4-二羟基苯甲酸（3，4-dhb）和对羟基苯甲酸（4-hb）的提取回收率。这11种检测指标中两种苯甲酸的水溶性较好，剩余的9种化合物脂溶性较好，性质差异较大，因而在多数文献中提取这几种化合物的方法多采用spe，液液萃取无法保证水溶性好的两种苯甲酸的提取回收率。
[0009]
而本发明通过前处理的改进保证了每种化合物的提取回收率，尤其是保证了两种水溶性好的苯甲酸的提取回收率。先进行蛋白沉淀再液液萃取，在萃取溶剂乙酸乙酯中加入1%的甲酸，使两种水溶性苯甲酸在溶液中呈现分子状态，提高萃取效率，而加入的甲酸会使乙腈沉淀蛋白不完全，导致提取效率降低，所以在蛋白沉淀一步我们使用znso4溶液和乙腈进行共沉淀，可使蛋白沉淀后提高提取效率，从而提高回收率。与文献中的spe前处理相比，本前处理方法提取效率更高，效果更好，成本更低。
[0010]
其次，本发明在流动相混合器和六通阀之间连接了trap柱，避免了流动相和仪器前端管路中本底峰对三氯生（tcs）的干扰，使本底干扰出峰时间后延，与样品中该化合物出峰错开，显著降低本底峰面积35倍，进而可以降低三氯生（tcs）的定量下限。
[0011]
一方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱同时测定人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量的试剂盒，所述试剂盒含有内标工作液、硫酸锌溶液和萃取剂；所述内标工作液包括乙腈，所述萃取剂包括乙酸乙酯。
[0012]
所述11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂为：对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸苯甲酯，对羟基苯甲酸庚酯，对羟基苯甲酸，3,4-二羟基苯甲酸甲酯，三氯卡班，三氯生。
[0013]
进一步地，所述硫酸锌溶液浓度为30~89mg/ml，所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1-1:1。
[0014]
进一步的，所述萃取剂中还含有甲酸。
[0015]
在一些方式中，萃取剂为含有1%甲酸的乙酸乙酯。
[0016]
从原理上看，在萃取溶剂乙酸乙酯中加入1%的甲酸，可以使两种苯甲酸在溶液中呈现分子状态，提高萃取效率，而加入的甲酸会使乙腈沉淀蛋白不完全，导致提取效率降低，所以在蛋白沉淀一步我们使用znso4溶液和乙腈进行共沉淀，可使蛋白沉淀后提高提取效率，从而提高回收率。
[0017]
进一步的，所述萃取剂用于液液萃取。
[0018]
进一步的，所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1-1:1。
[0019]
进一步的，所述硫酸锌溶液浓度为89mg/ml，其中还含有维生素c。
[0020]
在一些方式中，硫酸锌与维生素c的质量比为89:1，维生素c的浓度为1mg/ml。
[0021]
从原理上看，本发明中3，4-二羟基苯甲酸（3,4-dhb）和对羟基苯甲酸（4-hb）两种检测指标在提取过程中易氧化，加入抗氧化剂维生素c能有效避免其氧化，增加提取效率和回收率。
[0022]
另一方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱同时测定人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量的方法，所述方法采用了上述试剂盒进行样品前处理。
[0023]
所述11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂为：对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸苯甲酯，对羟基苯甲酸庚酯，对羟基苯甲酸，3,4-二羟基苯甲酸甲酯，三氯卡班，三氯生。
[0024]
进一步的，所述方法包括以下步骤：
[0025]
（1）样品中加入内标工作液和硫酸锌溶液，所述内标工作液含有乙腈；
[0026]
（2）加入萃取剂进行液液萃取，所述萃取剂包括乙酸乙酯；
[0027]
（3）吹干并复溶；
[0028]
（4）液相色谱串联质谱检测。
[0029]
进一步的，步骤（1）所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1-1:1。
[0030]
优选的，步骤（1）所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1。
[0031]
进一步的，步骤（1）所述硫酸锌溶液还含有维生素c（vc），维生素c的加量为0.2~1mg/ml。
[0032]
进一步的，步骤（2）所述萃取剂还含有甲酸，甲酸含量为0.5%~2%。
[0033]
本方法主要采取的是液液萃取，较spe操作便利性强且成本低，同时提高了两种苯甲酸类化合物（4-hb和3,4-dhb）的提取率。
[0034]
进一步的，步骤（4）所述液相色谱串联质谱时，需在流动相混合器和进样器六通阀之间连接trap柱。
[0035]
从原理上看，在流动相混合器和六通阀之间连接了trap柱，避免了流动相和仪器前端管路中本底峰对三氯生（tcs）的干扰，使本底干扰出峰时间后延，与样品中该化合物出峰错开，显著降低本底峰面积35倍，进而可以降低tcs的定量下限。
[0036]
在一些方式中，步骤（4）所述液相色谱串联质谱时，流动相为：流动相a：水（含0.05%hac），流动相b：乙腈（0.05% hac）。
[0037]
在流动相中加入少量的乙酸能优化3,4-dhb的峰形，解决羧酸拖尾的问题；在上述流动相下，11种检测指标化合物提取峰分离度高，能全部检出且同时检出。
[0038]
另一方面，本发明提供了一种组合物用于制备提高3，4-二羟基苯甲酸（3,4-dhb）和对羟基苯甲酸（4-hb）的提取回收率的制剂的用途，所述组合物包括乙腈和硫酸锌。
[0039]
在一些方式中，乙腈和硫酸锌溶液的体积比为9:1。
[0040]
在一些方式中，硫酸锌溶液中还含有维生素c，用于对抗3，4-二羟基苯甲酸（3,4-dhb）和对羟基苯甲酸（4-hb）的氧化。
[0041]
本发明的有益效果为：
[0042]
1. 通过本发明提供的检测人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量的方法，实现同时检测人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量。
[0043]
2. 通过蛋白沉淀剂和萃取剂的改进和创新性组合，显著提高了11种检测指标化合物的回收率，使得11种检测指标化合物提取峰面积显著增加，尤其是解决了其中两种水溶性苯甲酸类化合物（4-hb和3,4-dhb）经液液萃取难提取、难检测的问题。
[0044]
3. 本方法主要采取的是液液萃取，较spe操作便利性强，取代了使用spe板的萃取技术，降低了成本，并且同时提高了两种苯甲酸类化合物（4-hb和3,4-dhb）的提取率。
[0045]
4. 在液相-质谱联用系统中加入trap柱，在流动相混合器和进样器六通阀之间增加trap柱的连接，错开流动相和仪器前端管路中本底峰与样品中的三氯生（tcs）保留时间，
明显降低空白中干扰峰对定量结果的影响，可以有效降低流动相和管路中本底对tcs的干扰，降低tcs的定量下限至0.05 ng/ml，实现了检测指标的痕量检测。
附图说明
[0046]
图1 未使用trap柱+空白溶剂50%ch3oh的色谱图
[0047]
图2 使用trap柱+空白溶剂50%ch3oh的色谱图
[0048]
图3 未使用trap柱+tcs校准品c1的色谱图
[0049]
图4 使用trap柱+tcs校准品c1的色谱图
[0050]
图5 液相色谱串联质谱检测mep的色谱图
[0051]
图6 液相色谱串联质谱检测tcc的色谱图
[0052]
图7 液相色谱串联质谱检测tcs的色谱图
[0053]
图8 液相色谱串联质谱检测etp的色谱图
[0054]
图9 液相色谱串联质谱检测bup的色谱图
[0055]
图10 液相色谱串联质谱检测hep的色谱图
[0056]
图11 液相色谱串联质谱检测bzp的色谱图
[0057]
图12 液相色谱串联质谱检测oh-mep的色谱图
[0058]
图13 液相色谱串联质谱检测oh-etp的色谱图
[0059]
图14 液相色谱串联质谱检测3,4-dhb的色谱图
[0060]
图15 液相色谱串联质谱检测4-hb的色谱图
具体实施方式
[0061]
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用，本发明的实施例中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均能够以任何方式组合。
[0062]
实施例1：样品制备、前处理、检测、分析
[0063]
一．样品制备
[0064]
1. 校准品和质控样品的配制
[0065]
将三氯卡班（tcc），三氯生（tcs），对羟基苯甲酸丁酯（bup），对羟基苯甲酸甲酯（mep），对羟基苯甲酸乙酯（etp），3,4-二羟基苯甲酸乙酯（oh-etp），3,4-二羟基苯甲酸（3,4-dhb），对羟基苯甲酸苯甲酯（bzp），对羟基苯甲酸庚酯（hep），对羟基苯甲酸（4-hb）和3,4-二羟基苯甲酸甲酯（oh-mep）标准品配制成混合溶液，作为标准工作液和质控工作液的储备液，标准工作液的储备液与甲醇按1:19的体积比混合，质控工作液的储备液与混合空白血清1:99的体积比混合，分别配制校准曲线和质控样品。校准曲线配制8个系列浓度（c1~c8），质控样品配制3个系列浓度（lqc，mqc和hqc），分别如下表1和表2所示。
[0066]
表1：校准曲线中的8个系列浓度（c1~c8）
[0067][0068]
表2：质控样品中的3个系列加标浓度（lqc，mqc和hqc）
[0069][0070]
2. 内标溶液的配制
[0071]
（1）内标标准品储备液的配制
[0072]
配制混合内标标准品工作液，tcc-13c6，tcs-d3， bup-d4，mep-d4，etp-d4，oh-etp-13c，3,4-dhb-d3，bzp-d7，hep-d4，4-hb-d4的浓度分别为10 μg/ml，40 μg/ml，20 μg/ml，20 μg/ml，16 μg/ml，10 μg/ml，40 μg/ml，20 μg/ml，20 μg/ml，80 μg/ml。
[0073]
（2）内标次级储备液的配制
[0074]
移取内标标准品储备液15 μl, 向其中加入1485 μl甲醇，各化合物内标tcc-13c6，tcs-d3， bup-d4，mep-d4，etp-d4，oh-etp-13c，3,4-dhb-d3，bzp-d7，hep-d4，4-hb-d4的浓度分别为100 ng/ml，400 ng/ml，200 ng/ml，200 ng/ml，160 ng/ml，100 ng/ml，400 ng/ml，200 ng/ml，200 ng/ml，800 ng/ml。
[0075]
（3）内标工作液的配制
[0076]
移取内标标准品储备液0.5 ml, 向其中加入99.5 ml乙腈，得到最终的内标工作液，各化合物内标tcc-13c6，tcs-d3， bup-d4，mep-d4，etp-d4，oh-etp-13c，3,4-dhb-d3，bzp-d7，hep-d4，4-hb-d4的终浓度分别为0.5 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml，1 ng/ml，0.8 ng/ml，0.5 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml，1 ng/ml和4 ng/ml。
[0077]
3. znso4溶液配制
[0078]
用天平称取890 mg znso4，10 mg vc，向其中加入10 ml水溶解配制得到89 mg/ml的znso4溶液(含1mg/ml的vc)。
[0079]
二．样品前处理
[0080]
待测人血清样品，校准品和质控品采用如下方法进行前处理。
[0081]
（1） 依次吸取200μl 双空白（甲醇），单空白（甲醇），标准曲线和血清（包括质控），分别加入到96孔板中；单空白是不加标品只加内标的溶剂，双空白不加标品和内标的溶剂，单空白和双空白都经过前处理，双空白看溶剂前处理后的本底，单空白看溶剂加入内标后的本底；
[0082]
（2） 向所有样本中加入60 μl 的znso4溶液（89 mg/ml），向双空白中加入540 μl乙腈，其余样本中加入540μl内标液，涡旋震荡5 min；
[0083]
（3） 加入800 μl乙酸乙酯（含1% fa），涡旋震荡15min；
[0084]
（4）在4000rpm下离心10min，取上层有机相900μl；
[0085]
（5）在残余溶液中再次加入900μl乙酸乙酯（含1%fa），涡旋震荡15min；
[0086]
（6）在4000rpm下离心10min，取上层有机相900μl，合并两次有机相；
[0087]
（7）氮气吹干，残渣中加入150μl复溶液（80%甲醇）复溶；
[0088]
（8）在4000rpm下离心5min，进样5μl上机检测。
[0089]
三．样本检测
[0090]
液相色谱串联质谱系统：absciexlc-ms/ms系统triplequad6500系统
[0091]
色谱柱：luna
@
omegapolarc18（3μm,3.0
×
50mm，phenomenex）
[0092]
流动相a：水（含0.05%hac），流动相b：乙腈（0.05%hac）
[0093]
流速：0.5ml/min，柱温：40℃
[0094]
进样器温度：15℃
[0095]
进样体积：5μl
[0096]
梯度洗脱条件如下表3所示
[0097]
表3：梯度洗脱条件
[0098][0099]
质谱检测条件：离子源为电喷雾离子源（esi），负离子模式，离子源参数为：离子源加热温度为500
°
c，气帘气（curtaingas，cur）为30psi，碰撞气（collisiongas，cad）为9psi，脱溶剂气（gs1）为55psi，辅助加热气为（gs2）45psi。扫描方式为多反应监测（multiplereactionmonitoring，mrm）模式。
[0100]
化合物的质谱参数如表4所示：
[0101]
表4：化合物的质谱参数
[0102][0103]
[0104]
四．数据处理及分析
[0105]
绘制标准曲线
[0106]
标准曲线以各化合物校准品的浓度为横坐标，以各化合物峰面积与其各自对应的内标峰面积比为纵坐标，进行线性拟合，获得线性回归方程。线性方程及相关系数r如表5所示。线性较好，相关系数r均大于0.9900
[0107]
表5：线性方程及相关系数r
[0108][0109]
五、准确度、精密度、加标回收率
[0110]
1、准确度和精密度
[0111]
本发明中的11个检测指标化合物的准确度和精密度通过分析分布在线性范围内的低，中，高3个浓度点的质控品得到。接受标准为测定值均值和理论值间的准确度在85%~115%之间，精密度由变异系数（cv%）表示，精密度（cv）≤15%符合要求。精密度五批测试，低中高三个浓度准确度在91.8%~110.7%之间，批间精密度（cv）在2.14%~5.56%之间，符合要求。
[0112]
2、加标回收率
[0113]
取混合标准工作液的储备液配制成低、中和高3个浓度的血清质控样品，按照最佳实施例的方法进行前处理，各化合物的加标回收率和精密度数据见表6所示。
[0114]
表6：各化合物加标回收率统计结果
[0115]
[0116][0117]
试验结果：各化合物的加标回收率均在85%-115%范围内，精密度cv均小于15%，满足生物样本分析定量要求。
[0118]
实施例2：不同前处理方案对检测结果的影响
[0119]
不同的前处理方案对检测结果的影响巨大，在本实施例中，我们综合考虑前处理方案，寻找一个最为方便实用、经济快捷、效果优异的前处理方案。
[0120]
我们设置了如表7所示的七种方案，选取实施例1中所述的质控品lqc作为待测样品，采用表7中所述的1~7前处理方案进行前处理，由于待测的11种化合物按其物理性质主要分为脂溶性和水溶性两类，脂溶性的为tcs、tcc、mep、etp、bup、hep、bzp、oh-etp、oh-mep九种化合物，上述九种化合物的检测结果呈现同一趋势，我们挑选tcs作为代表；水溶性的为3，4-dhb和4-hb，在其他技术方案中很难进行检测，是我们重点解决的对象，我们单独进行考虑；检测结果如表7所示。
[0121]
表7：不同前处理方案对检测结果的影响
[0122][0123]
n/a表示未检测到色谱峰。
[0124]
结果显示：在上述前处理方案中，乙腈、硫酸锌（含vc）蛋白沉淀+乙酸乙酯（含甲酸）液液萃取为最优的前处理方案。
[0125]
我们通过不同方案的对比，不难看出：
[0126]
（1）对比方案1和方案3：蛋白沉淀使用乙腈相较于使用甲醇，检测指标化合物提取峰面积更高。
[0127]
（2）对比方案1和方案5：蛋白沉淀时额外添加硫酸锌溶液，能显著增加蛋白沉淀效率，更易于化合物提取，检测指标化合物提取峰面积更高。
[0128]
（3）对比方案1和方案4：添加vc相比于不添加vc，检测指标化合物提取峰面积更高，尤其是两种水溶性化合物3，4-dhb和4-hb，原因在于加入vc可以抵抗3，4-dhb和4-hb的氧化。
[0129]
（4）对比方案1和方案2：在液相萃取剂乙酸乙酯中添加甲酸，能显著提高检测指标化合物提取峰面积，其原因在于，加入甲酸，可以使两种苯甲酸在溶液中呈现分子状态，提高萃取效率。
[0130]
（5）对比方案1和方案6、方案7：缺少蛋白沉淀和液液萃取两个步骤时检测结果差，峰面积很小，为实现所述11种检测指标的检测，蛋白沉淀和液液萃取两个步骤为必须。
[0131]
由此可见，方案1为优选，此方案中任何一个化合物的选择都是经过重重筛选，缺一不可，仅在此组合中，我们选取的11种检测指标化合物提取效率最高，回收率最高，检测
峰面积最大，尤其是对两种水溶性化合物3，4-dhb和4-hb的提取效率、回收率和检测峰面积有较大提升，它们在现有技术下很难被检测，而通过本发明提供的方法可以方便高效地进行检测。
[0132]
实施例3：蛋白沉淀剂对检测结果的影响
[0133]
本实施例采用如实施例1提供的前处理方法，讨论不同的蛋白沉淀剂对检测结果的影响。我们选取实施例1中所述的质控品lqc作为待测样品，使用四组蛋白沉淀剂（meoh+znso
4 、meoh 、acn+znso
4 、acn）进行蛋白沉淀，其中znso4和有机溶剂的比例均为1:9，随后处理检测过程同实施例1，根据化合物提取峰面积来优选有机溶剂，十一种化合物用不同的蛋白沉淀剂后提取峰面积如表8所示。
[0134]
表8：不同蛋白沉淀剂对检测结果的影响
[0135][0136]
结果显示：综合比较11种化合物的提取峰面积，乙腈作为蛋白沉淀剂时，提取峰面积远大于甲醇作为蛋白沉淀剂；当使用znso4和acn共同沉淀蛋白时，3，4-二羟基苯甲酸（3，4-dhb）和对羟基苯甲酸（4-hb）提取率得到显著提高；其中3，4-二羟基苯甲酸（3，4-dhb）峰面积较仅使用acn进行沉淀蛋白时提高了12倍，对羟基苯甲酸（4-hb）峰面积较仅使用acn进行沉淀蛋白时提高了8倍。
[0137]
乙腈和硫酸锌组合作为蛋白沉淀剂时，对11种检测指标中9种脂溶性的化合物的提取效率有提升，也有部分如etp和bup的峰面积轻微降低，但是对2种水溶性的化合物3，4-dhb和4-hb的提取效率提高了数倍，出于这个考虑，我们选择了乙腈和硫酸锌作为蛋白沉淀剂。也正是这个蛋白沉淀剂能够使得本方法能够同时对这11种进行检测，且检测效果较好。
[0138]
实施例4：蛋白沉淀剂中硫酸锌和乙腈配比对检测结果的影响
[0139]
在实施例3中我们确定了在蛋白沉淀剂中加入硫酸锌能显著提高两种羟基苯甲酸的提取效率，在本实施例中我们进而考虑硫酸锌和乙腈的不同配比对检测结果的影响，待测样品为实施例1中所述的质控品lqc，结果如表9所示。
[0140]
表9：硫酸锌溶液和乙腈不同配比的蛋白沉淀剂对化合物提取峰面积的影响
[0141][0142]
综合比较可得：配方为znso4和acn的蛋白沉淀剂，其对各个化合物提取效率综合来看好于配方为znso4和meoh的蛋白沉淀剂；综合比较不同配比的蛋白沉淀剂，可得蛋白沉淀剂配方为znso4: acn=1:9时对各个化合物提取效率最佳，此时检测效果为最佳。
[0143]
实施例5：萃取条件对检测结果的影响
[0144]
本发明的11种检测指标中两种苯甲酸的水溶性较好，剩余的9种化合物脂溶性较好，性质差异较大，因而在多数文献中提取这几种化合物的方法多采用固相萃取（spe），液液萃取（lle）无法保证水溶性好的两种苯甲酸的提取回收率。而本发明通过前处理的改进提高了每种化合物的提取峰面积。
[0145]
经过实施例1中所述的前处理，待测样品为实施例1中所述的质控品lqc，我们首先对前处理后的样本分别使用固相萃取、液液萃取两种萃取方式进行萃取。其中固相萃取选择两种离子交换机理的96孔板，分别为pax（阴离子交换96孔板）和pwax（弱阴离子交换96孔板）。
[0146]
固相萃取的方法如下：
[0147]
（1）样品制备：将待测物质加入到样品中，然后加入内标物质，混合均匀。
[0148]
（2）固相萃取96孔板的准备：将固相萃取96孔板放入支架中，分别用甲醇和纯化水进行活化。
[0149]
（3）样品处理：将预处理好的样品上样至固相萃取96孔板中，用含不同比例的溶剂进行洗脱。
[0150]
（4）洗脱：将洗脱液收集起来，然后进行进一步的分析
[0151]
本发明使用的液液萃取的方法如下：
[0152]
（1）依次吸取200μl 双空白（甲醇），单空白（甲醇），标准曲线和血清（包括质控），分别加入到96孔板中；
[0153]
（2）向所有样本中加入60 μl 的znso4溶液（89 mg/ml），向双空白中加入540 μl乙腈，其余样本中加入540μl内标液，涡旋震荡5 min；
[0154]
（3）加入800 μl乙酸乙酯（含1% fa），涡旋震荡15min；
[0155]
（4）在4000rpm下离心10min，取上层有机相900 μl；
[0156]
（5）在残余溶液中再次加入900 μl乙酸乙酯（含1% fa），涡旋震荡15min；
[0157]
（6）在4000rpm下离心10min，取上层有机相900μl，合并两次有机相；
[0158]
（7）氮气吹干，残渣中加入150μl复溶液（80%甲醇）复溶；
[0159]
（8）在4000rpm下离心5min，进样5 μl上机检测。
[0160]
固相萃取和液相萃取两种方法下进行萃取，其他步骤同实施例1，测定化合物的提取后峰面积，结果如表10所示。
[0161]
表10：固相萃取和液液萃取下检测指标化合物的提取峰面积
[0162][0163]
结果显示：固相萃取对tcc，bup，mep，3,4-dhb，bzp，4-hb的提取峰面积均低于本发明中的液液萃取；综合考虑，本发明选用的液液萃取方法效果更好，可以使得现有技术较难实现检测的3,4-dhb和4-hb提取峰面积增加，操作便利性强，成本也更低。
[0164]
根据上述试验结果，在实施例1所述的前处理方法处理后，进行萃取应优选液液萃取的方法，于是，我们接下来开展液液萃取中液相萃取剂的筛选试验。我们分别使用甲基叔丁基醚，乙酸乙酯和异辛烷：甲基叔丁基醚=1：1来进行液液萃取，11中检测指标化合物的提取峰面积的结果如表11所示。
[0165]
表11：不同的萃取剂对检测指标化合物的提取峰面积的影响
[0166][0167]
n/a表示未检测到色谱峰。
[0168]
结果显示：甲基叔丁基醚作为萃取剂时提取峰面积较小；异辛烷：甲基叔丁基醚=1：1作为萃取剂时，无法检测到3,4-dhb的色谱峰，无法完成全部检测指标的检测，且提取峰面积小；乙酸乙酯作为萃取剂时，综合来看11种检测指标化合物的提取峰面积最大，为优选。
[0169]
实施例6：抗氧化剂对检测结果的影响
[0170]
本发明所选取的11种检测指标中，有两种水溶性的苯甲酸在提取过程中易被氧化，本实施例采用实施例1所述的前处理方法，对抗氧化剂做调整，研究抗氧化剂对检测结果的影响，进而筛选出最合适用于检测本发明选取的11种检测指标的抗氧化剂。
[0171]
本实施例选取了2,6-二叔丁基对甲酚（bht）和维生素c（vc）作为抗氧化剂，分别配成1mg/ml加入硫酸锌溶液，待测样品为实施例1中所述的质控品lqc，并按照实施例1中的前处理方法进行处理，并额外增加空白对照组，分别测定不同抗氧化剂下检测指标化合物的回收率，结果如表12所示。
[0172]
表12：抗氧化剂对检测指标化合物的回收率的影响
[0173][0174]
结果显示：在硫酸锌溶液中加入抗氧化剂能增加检测指标化合物的回收率，并且对两种水溶性的苯甲酸3,4-dhb和4-hb的回收率有显著的增加作用；在不同的抗氧化剂中，vc为优选，能最大幅度增加回收率。
[0175]
实施例7：增加trap柱对检测结果的影响
[0176]
tcs在管道内均存在，在液相系统中tcs本底峰较高，本发明在流动相混合器和进样器六通阀之间连接了一个trap柱，使流动相和系统前端管路中本底峰与样品中的tcs色谱峰保留时间错开，降低本底对定量带来的干扰，降低了定量下限。
[0177]
基于实施例1中所述的样本检测方法，待测样品为实施例1中所述的质控品lqc，分别做如下试验：未使用trap柱+空白溶剂50%ch3oh、使用trap柱+空白溶剂50%ch3oh、未使用trap柱+tcs校准品c1、使用trap柱+tcs校准品c1 ，结果分别如图1、图2、图3、图4所示。
[0178]
由图中可以看出：在流动相混合器和六通阀之间增加trap柱的连接，能将流动相和仪器前端管路中的三氯生（tcs）本底峰与样品中的三氯生（tcs）目标峰分开，显著降低了本底峰带来的干扰，提高定量准确度，降低定量下限。根据文献中报道的tcs的定量下限为0.9 ng/ml，而本发明通过在流动相混合器和进样器六通阀之间增加trap柱的连接，可以有效降低流动相和管路中本底对tcs的干扰，降低tcs的定量下限至0.05 ng/ml。
[0179]
实施例8：液相色谱流动相对检测结果的影响
[0180]
为同时检出11种检测指标，确保11种检测指标化合物提取峰不重叠，我们对液相色谱流动相进行了研究，我们设置了以下几组流动相：
[0181]
1组：流动相a：水（含0.05%hac），流动相b：乙腈（0.05% hac）
[0182]
2组：流动相a：水，流动相b：乙腈
[0183]
待测样品为实施例1中所述的质控品lqc，按照实施例1中所述的检测方法进行检测，只对流动相进行更改，我们发现：在流动相中加入少量的乙酸能优化3,4-dhb的峰形，解决羧酸拖尾的问题，色谱图如图5~图15所示。
[0184]
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅
为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种液相色谱串联质谱同时测定人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有内标工作液、硫酸锌溶液和萃取剂；所述内标工作液包括乙腈，所述萃取剂包括乙酸乙酯和甲酸；所述11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂为：对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸苯甲酯，对羟基苯甲酸庚酯，对羟基苯甲酸，3,4-二羟基苯甲酸甲酯，三氯卡班，三氯生。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硫酸锌溶液浓度为30~89mg/ml，所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1-1:1。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述硫酸锌溶液中还含有维生素c。4.一种液相色谱串联质谱同时测定人血中11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂含量的方法，其特征在于，采用如权利要求1~3任一项所述的试剂盒进行样品前处理；所述11种苯甲酸酯及其代谢物、含氯抗菌剂为：对羟基苯甲酸丁酯，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸乙酯，3,4-二羟基苯甲酸，对羟基苯甲酸苯甲酯，对羟基苯甲酸庚酯，对羟基苯甲酸，3,4-二羟基苯甲酸甲酯，三氯卡班，三氯生。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1） 样品中加入内标工作液和硫酸锌溶液，所述内标工作液含有乙腈；（2） 加入萃取剂进行液液萃取，所述萃取剂包括乙酸乙酯；（3） 吹干并复溶；（4） 液相色谱串联质谱检测。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述内标工作液和硫酸锌溶液的体积比为9:1-1:1。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述萃取剂还含有甲酸，甲酸含量为0.5%~1%。8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述硫酸锌溶液还含有维生素c，维生素c的加量为0.2 ~ 1mg/ml 。9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（4）所述液相色谱串联质谱时，需在流动相混合器和六通阀之间连接trap柱。10.一种组合物用于制备提高3，4-二羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸的提取回收率的制剂的用途，其特征在于，所述组合物包括乙腈和硫酸锌。

技术总结
本发明提供了同时同时测定人血中11种苯甲酸酯类物质和含氯抗菌剂含量的试剂盒、方法及组合物用途；采用乙腈和硫酸锌(含抗氧化剂VC)溶液进行蛋白沉淀，再使用含甲酸的乙酸乙酯进行液液萃取的方式进行前处理，收集洗脱液，吹干复溶后即可进行液相色谱串联质谱检测，并通过trap柱降低定量下限。本发明提供的方法实现了两种难检测的水溶性苯甲酸的检测，对检测指标化合物提取效率高，回收率高，检测的定量下限低，操作便利，效果更好，成本更低。成本更低。成本更低。


技术研发人员：罗稳 孔子青 顾祁昕 刘楚 刘华芬
受保护的技术使用者：湖南凯莱谱生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/7/18