鉴定蒙古羊与非蒙古羊的SNP位点组合及其应用的制作方法

鉴定蒙古羊与非蒙古羊的snp位点组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及动物品种鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定蒙古羊与非蒙古羊snp位点组合及其应用。


背景技术：

2.蒙古羊(mongolia sheep)(ovis aries)是我国三大粗毛羊品种之一，主要分布在内蒙古、东北、华北和西北等地，蒙古羊是包括苏尼特羊、乌珠穆沁羊、呼伦贝尔羊、滩羊、巴音布鲁克羊、小尾寒羊、多浪羊和湖羊等中国短尾、肥尾羊品种的共同祖先。蒙古羊具有生活力强、适于游牧、耐寒、耐旱等特点，并有较好的产肉、脂性能，是我国宝贵的绵羊遗传资源。在内蒙古自治区，蒙古羊主要分为苏尼特羊、乌珠穆沁羊和呼伦贝尔羊三大群体，总存栏约2000万只。近年来，内蒙古牧区以蒙古羊为主的羊肉作为一种天然绿色食品受到国内市场的广泛认可。然而，最近出现的蒙古羊和其他羊类品种的杂交后代，以及大量区外的育肥羊进入内蒙古自治区屠宰加工产业链，冒充“内蒙羊”返销内地市场的情况，严重破坏了内蒙古自治区“草原绿色生态”羊肉制品的金字招牌。为稳定蒙古羊品质，重树蒙古羊品牌形象，将蒙古羊打造成为全国乃至全球驰名品牌，我们通过对蒙古羊与非蒙古羊的鉴定，为今后蒙古羊的鉴定保种以及遗传育种奠定基础。
3.近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在生物物种鉴定中也取得了长足的进展。基因检测技术以其几乎可以对所有的生物类材料进行鉴定而被广泛应用于动植物物种鉴定。基因检测技术鉴定动植物物种是物种识别中发展最快、准确率最高的技术手段。
4.全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行全基因组范围的测序，随着测序成本降低和已知基因组序列的物种增多，重测序已经成为动植物育种研究中最为有效的方法之一。sequenom snp分型技术通过引物延伸反应原理进行，将灵敏的pcr扩增和可靠的maldi-tof质谱技术相结合，实现基因分型检测，此技术特别适合对全基因组研究发现的结果进行验证。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种用于鉴定蒙古羊与非蒙古羊的snp位点组合。
6.本发明的目的在于检测待测羊基因组中的snp位点组合的基因型的物质的用途。
7.根据本发明具体实施方式的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的snp位点组合，其包括：chr1_173513588、chr3_121675363、chr4_76823333、chr4_113093619、chr6_106334764、chr7_89308288、chr10_29752387、chr14_14157542、chr14_57000150、chr16_55975168、chr21_33513100、chr23_23278786和/或chr23_60100530。
8.本发明的提供的上述snp位点中任意一个snp位点即可用于鉴定蒙古羊与非蒙古羊，或者，将上述snp位点进行组合后进行鉴定蒙古羊与非蒙古羊，例如，组合任意两个snp位点，组合任意三个或多个snp位点，均可用于蒙古羊与非蒙古羊的鉴定。
9.其中，本发明的优选方式为将上述13个snp组合一起，共同用于鉴定蒙古羊与非蒙
古羊。
10.本发明提供了检测待测羊基因组中的如下snp位点组合的基因型的物质在鉴定待测羊是否为蒙古羊或非蒙古羊中的应用；所述snp位点组合包括13个位点，各位点的位置及多态性如下：chr1_173513588位于1号染色体第173513588位，其脱氧核苷酸为t或c；chr3_121675363位于3号染色体第121675363位，其脱氧核苷酸为t或c；chr4_76823333位于4号染色体第76823333位，其脱氧核苷酸为a或g；chr4_113093619位于4号染色体第113093619位，其脱氧核苷酸为t或c；chr6_106334764位于6号染色体第106334764位，其脱氧核苷酸为a或g；chr7_89308288位于7号染色体第89308288位，其脱氧核苷酸为t或c；chr10_29752387位于10号染色体第29752387位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_14157542位于14号染色体第14157542位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_57000150位于14号染色体第57000150位，其脱氧核苷酸为a或g；chr16_55975168位于16号染色体第55975168位，其脱氧核苷酸为a或g；chr21_33513100位于21号染色体第33513100位，其脱氧核苷酸为a或t；chr23_23278786位于23号染色体第23278786位，其脱氧核苷酸为t或c；chr23_60100530位于23号染色体第60100530位，其脱氧核苷酸为t或g；所述羊基因组序列为羊基因组oar_v4.0（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ assembly/gcf_000298735.2/）版本参考序列。
11.本发明提供上述snp位点的应用，其具体应用可以为用于检测上述snp位点的试剂盒、检测方法或者检测平台，此处不一一列举。
12.根据本发明具体实施方式的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，所述方法包括检测蒙古羊基因组中snp位点基因型的步骤。
13.在上述应用中，所述检测待测羊基因组中的如下snp位点组合基因型的物质包括如下生物材料：1）成套引物，所述成套引物包括扩增snp位点的多重引物；2）含有1）的试剂；3）含有1）或2）的试剂盒。
14.上述应用中，所述成套引物还包括单碱基延伸引物，扩增snp位点的多重引物由以下序列所示的单链dna分子组成：
根据本发明具体实施方式的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，所述方法包括以下步骤：（1）提取待测羊的基因组dna：（2）检测基因组dna中所述snp位点的基因型；（3）根据snp位点的基因型的分型结果，计算出每个snp位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，其中，“是”表示“是蒙古羊”，“非”表示“非蒙古羊”；将13个snp位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值；若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为蒙古羊；若“是”的总和鉴定概率值小于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为非蒙古羊。
15.其中，所述13个位点的各分型在不同品种间出现的概率值如下：
对于位点概率的计算，获取盲测样本各位点的分型结果，统计各分型在蒙古羊和非蒙古羊中出现的后验概率值，具体结果见上表。
16.根据计算得出的后验概率，使用贝叶斯公式进行建模，关联分型与品种信息，公式如下：其中，p代表概率、a、b分别代表snp的2种分型。
17.依据建模结果，后续可以根据未知样本的分型结果，使用上述公式反推获取该样
本是蒙古羊及非蒙古羊的概率。在最终品种判定阶段，选择概率最大的品种作为样本的品种信息。
18.本发明的有益效果：本发明首次提出了用于鉴定蒙古羊及非蒙古羊13个差异位点，首次提出了用于鉴定蒙古羊及非蒙古羊参考群数据模型，本发明为今后蒙古羊与非蒙古羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供了有力的技术支持。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
20.本发明中所用蒙古羊与非蒙古羊来源如下：苏尼特羊：内蒙古自治区苏尼特左旗；乌珠穆沁羊：内蒙古自治区东乌珠穆沁旗；呼伦贝尔羊：内蒙古自治区新巴尔虎右旗；滩羊：宁夏自治区盐池县；草原短尾羊：内蒙古自治区鄂温克旗；小尾寒羊：山东省嘉祥县。
21.实施例 1确定鉴定蒙古羊和非蒙古羊的snp位点组合1. 确定鉴定蒙古羊和非蒙古羊的snp位点对94只蒙古羊组（54只苏尼特羊、20只乌珠穆沁羊和20只呼伦贝尔羊）及80只非蒙古羊组（20只湖羊、20只滩羊、20只草原短尾羊和20只小尾寒羊）进行基因组dna提取。
22.对基因组dna进行全基因组重测序，获得上述174只羊的重测序数据，包含73,045,697个位点。
23.为了获得蒙古羊与非蒙古羊高质量的差异位点，首先对样本及位点进行过滤，在此基础之上进行差异位点的筛选，后进行gwas分析与fst分析，从而进行蒙古羊与非蒙古羊差异位点筛选。
24.样本及位点的过滤过程中，本发明结合亲缘关系、最小等位基因频率、样本缺失率、基因缺失率等内容，并分配优化不同的阈值，其中，样本及位点的过滤，具体如下：根据gwas与fst的结果，筛选出组间显著差异最大的13个snp位点，分别为：chr1_173513588位于1号染色体第173513588位，其脱氧核苷酸为t或c；
chr3_121675363位于3号染色体第121675363位，其脱氧核苷酸为t或c；chr4_76823333位于4号染色体第76823333位，其脱氧核苷酸为a或g；chr4_113093619位于4号染色体第113093619位，其脱氧核苷酸为t或c；chr6_106334764位于6号染色体第106334764位，其脱氧核苷酸为a或g；chr7_89308288位于7号染色体第89308288位，其脱氧核苷酸为t或c；chr10_29752387位于10号染色体第29752387位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_14157542位于14号染色体第14157542位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_57000150位于14号染色体第57000150位，其脱氧核苷酸为a或g；chr16_55975168位于16号染色体第55975168位，其脱氧核苷酸为a或g；chr21_33513100位于21号染色体第33513100位，其脱氧核苷酸为a或t；chr23_23278786位于23号染色体第23278786位，其脱氧核苷酸为t或c；chr23_60100530位于23号染色体第60100530位，其脱氧核苷酸为t或g；实施例 2建立鉴定蒙古羊和蒙古羊的snp位点分析模型提取192只蒙古羊（92只苏尼特羊、100只乌珠穆沁羊）和192只非蒙古羊（100只湖羊、40只滩羊、52只小尾寒羊）的基因组dna，然后进行sequenom检测。
25.其中，sequenom检测具体操作步骤如下：1. 引物设计设计待测snp位点的pcr扩增引物及单碱基延伸引物，如表1所示，2.dna质检待实验样本用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组dna电泳条带通常不
小于20kb。质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至96孔板，-20℃储存备用。
26.3. 引物稀释（1）每个snp，有三条引物（表1），将这三条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。
27.（2）forward pcr引物、reverse pcr引物先离心空甩后加水，加水量与od值相关（引物管和引物设计表均有标识），每1od加36μl水。加水后室温放置30min后震荡混匀备用。
28.（3）每个well中多重snp的forward pcr引物、reverse pcr引物混合时计算方法：每个snp的forward pcr引物、reverse pcr引物各取2.5μl加水量（μl）= 500-重数
×
2.5
×
2（重数：well中snp个数）。
29.4. pcr扩增pcr扩增采用多重pcr技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl.（1）在一个新的2.0ml ep管中配制pcr master mix溶液，具体如下表2所示。
30.pcr primer mix由表1中每个snp位点的forward pcr引物和reverse pcr引物组成，且每条引物在最终反应体系pcr master mix溶液中的浓度均为0.0039μm。
31.（2）将配制好的pcr master mix溶液震荡混匀后分置8连排的pcr管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcr master mix液。该384孔板即为pcr反应板。
32.（3）取出已经制备好的dna样品96孔板，使用8通道加样器，调节加样体积为1μl，加至相对应的384 pcr反应板，贴上封口膜，震荡混匀后空甩。
33.（4）在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件如下表3所示。
34.5. pcr产物碱性磷酸酶处理（1）在pcr反应结束后，384反应板取出并空甩。（2）配制碱性磷酸酶处理反应液，sap mix，具体如下表4所示。
35.（3）将配制好的sap mix溶液震荡混匀后，分置8连排的pcr管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将sap mix加入384孔pcr反应板。贴上封口膜，震荡混匀后空甩。反应体系总体积为7μl（其中pcr产物5μl，sap混合液2μl）。（4） 将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件如下表5所示。
36.启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理反应。
37.6. 单碱基延伸反应（1） 在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
38.（2） 配制单碱基延伸反应液，extend mix，如下表6所示。（注意：extend primer mix与well数一定要对应正确）
上述extend primer mix由表1中每个snp位点的单碱基延伸引物组成，且每条引物在最终反应体系extend mix中的浓度均为0.019μm。
39.（3）将配制好的extend mix溶液震荡混匀后分置8连排的pcr管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将extend mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含sap处理后pcr产物7μl及 extend mix液2μl，总体系9μl。（4） 将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件，如下表7所示。
40.7. 树脂纯化将反应产物加16μl水进行稀释，稀释后使用树脂进行脱盐。
41.8. 芯片点样将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
42.9. 质谱检测上机（agena bioscience公司的sequenom-核酸质谱分析平台）进行质谱检测，并收集数据；获得13个位点的基因分型。
43.10. snp位点对应品种的计算通过参考群体的表型值和迭代条件期望算法，计算出参考群贝叶斯模型中的每个snp位点的对应羊品种的概率值；计算公式为：p(a|b)=p(b|a)*p(a)/p(b)，其中，p代表概率、a、b代表snp的2种分型。
44.根据检测到的分型结果，计算每个位点各分型在不同品种之间的差异。通过计算得出的概率值为实际概率值取自然对数后的结果，该数值越大，说明出现的概率越大。表8
为以参考群数据构建的模型。
45.根据snp位点的基因型的分型结果，计算出每个snp位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，其中，“是”表示“是蒙古羊”，“非”表示“非蒙古羊”；将13个snp位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值；若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为蒙古羊；若“是”的总和鉴定概率值小于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为非蒙古羊。
46.实施例 3盲测验证本方法的准确率检测待测羊基因组中上述13个snp位点的分型结果，将所得13个snp位点的分型结果带入以参考群数据构建的模型中，计算出每一个snp位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，“是”表示“是蒙古羊”，“非”表示“非蒙古羊”，将13个snp位点的概率值求和，
获得“是”和“非”的总和鉴定概率值，若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为蒙古羊；反之，若“是”的总和鉴定概率值小于“非”，则该待测羊鉴定为非蒙古羊。
47.选取370只羊个体进行品种鉴定盲测，将鉴定结果与专家给出的真实结果进行比对，检验鉴定准确率。具体统计结果见表9。
48.实验结果：盲测共鉴定出330份蒙古羊样本和240份非蒙古羊样本，与专家给定的样本实际品种进行对比，其中541样本鉴定成功，准确率94.91%。
49.其中，具体的样本的判定方式如表10-13所式：表11如下：表12如下：
表13如下：注：在计算中获得的概率值为(ln)，因此为负数。
50.在计算中将所有的位点概率值进行相加，得到的蒙古羊概率值总和与非蒙古羊概率值总和进行对比，数值大的对应结果即判定的最终结果。
51.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.鉴定蒙古羊与非蒙古羊的snp位点组合，其特征在于，所述snp位点包括：chr1_173513588、chr3_121675363、chr4_76823333、chr4_113093619、chr6_106334764、chr7_89308288、chr10_29752387、chr14_14157542、chr14_57000150、chr16_55975168、chr21_33513100、chr23_23278786和/或或chr23_60100530。2.根据权利要求1所述的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的snp位点组合，其特征在于，chr1_173513588位于1号染色体第173513588位；chr3_121675363位于3号染色体第121675363位；chr4_76823333位于4号染色体第76823333位；chr4_113093619位于4号染色体第113093619位；chr6_106334764位于6号染色体第106334764位；chr7_89308288位于7号染色体第89308288位；chr10_29752387位于10号染色体第29752387位；chr14_14157542位于14号染色体第14157542位；chr14_57000150位于14号染色体第57000150位；chr16_55975168位于16号染色体第55975168位；chr21_33513100位于21号染色体第33513100位；chr23_23278786位于23号染色体第23278786位；chr23_60100530位于23号染色体第60100530位。3.权利要求1所述的snp位点组合在鉴定蒙古羊与非蒙古羊中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述snp位点的位置及多态性如下：chr1_173513588位于1号染色体第173513588位，其脱氧核苷酸为t或c；chr3_121675363位于3号染色体第121675363位，其脱氧核苷酸为t或c；chr4_76823333位于4号染色体第76823333位，其脱氧核苷酸为a或g；chr4_113093619位于4号染色体第113093619位，其脱氧核苷酸为t或c；chr6_106334764位于6号染色体第106334764位，其脱氧核苷酸为a或g；chr7_89308288位于7号染色体第89308288位，其脱氧核苷酸为t或c；chr10_29752387位于10号染色体第29752387位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_14157542位于14号染色体第14157542位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_57000150位于14号染色体第57000150位，其脱氧核苷酸为a或g；chr16_55975168位于16号染色体第55975168位，其脱氧核苷酸为a或g；chr21_33513100位于21号染色体第33513100位，其脱氧核苷酸为a或t；chr23_23278786位于23号染色体第23278786位，其脱氧核苷酸为t或c；chr23_60100530位于23号染色体第60100530位，其脱氧核苷酸为t或g。5.鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，其特征在于，所述方法包括检测待测羊基因组中的权利要求1所述的snp位点的基因型的步骤。6.根据权利要求5所述的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，其特征在于，所述snp位点的位置及多态性如下：chr1_173513588位于1号染色体第173513588位，其脱氧核苷酸为t或c；chr3_121675363位于3号染色体第121675363位，其脱氧核苷酸为t或c；
chr4_76823333位于4号染色体第76823333位，其脱氧核苷酸为a或g；chr4_113093619位于4号染色体第113093619位，其脱氧核苷酸为t或c；chr6_106334764位于6号染色体第106334764位，其脱氧核苷酸为a或g；chr7_89308288位于7号染色体第89308288位，其脱氧核苷酸为t或c；chr10_29752387位于10号染色体第29752387位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_14157542位于14号染色体第14157542位，其脱氧核苷酸为t或c；chr14_57000150位于14号染色体第57000150位，其脱氧核苷酸为a或g；chr16_55975168位于16号染色体第55975168位，其脱氧核苷酸为a或g；chr21_33513100位于21号染色体第33513100位，其脱氧核苷酸为a或t；chr23_23278786位于23号染色体第23278786位，其脱氧核苷酸为t或c；chr23_60100530位于23号染色体第60100530位，其脱氧核苷酸为t或g。7.根据权利要求5所述的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）提取待测羊的基因组dna：（2）检测基因组dna中所述snp位点的基因型；（3）根据snp位点的基因型的分型结果，计算出每个snp位点的分型结果所对应的“是”和“非”的概率值，其中，“是”表示“是蒙古羊”，“非”表示“非蒙古羊”；将13个snp位点的概率值求和，获得“是”和“非”的总和鉴定概率值；若“是”的总和鉴定概率值大于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为蒙古羊；若“是”的总和鉴定概率值小于“非”的总和鉴定概率值，则该待测羊鉴定为非蒙古羊。8.根据权利要求7所述的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，其特征在于，snp位点的各分型在不同品种间出现的概率值如下：
。9.根据权利要求7所述的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的方法，其特征在于，扩增所述snp位点的引物如下：
。

技术总结
本发明涉及动物品种鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定蒙古羊与非蒙古羊SNP位点组合及其应用。本发明的鉴定蒙古羊与非蒙古羊的13个SNP位点组合，包括：Chr1_173513588、Chr3_121675363、Chr4_76823333、Chr4_113093619、Chr6_106334764、Chr7_89308288、Chr10_29752387、Chr14_14157542、Chr14_57000150、Chr16_55975168、Chr21_33513100、Chr23_23278786或Chr23_60100530。本发明首次提出了用于鉴定蒙古羊及非蒙古羊13个差异位点，首次提出了用于鉴定蒙古羊及非蒙古羊参考群数据模型，本发明为今后蒙古羊与非蒙古羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供了有力的技术支持。以及遗传育种提供了有力的技术支持。


技术研发人员：佟彬 傅博
受保护的技术使用者：内蒙古科基芯生物科技有限责任公司
技术研发日：2023.03.28
技术公布日：2023/7/18