香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。


背景技术：

2.乳腺癌是一种严重影响全球妇女健康的疾病，据2022年癌症统计数据显示，乳腺癌已超过肺癌成为女性最常见的恶性肿瘤，发病率排行女性恶性肿瘤的第一位，死亡率居女性恶性肿瘤的第二位。乳腺癌具有多种异质性高的亚型，其中，三阴性乳腺癌(tnbc)约占25％，其特点是缺乏雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)和人表皮生长因子受体-2(her-2)。tnbc治疗选择有限且预后较差，目前常用的tnbc治疗方法有手术、放疗、化疗、靶向治疗、内分泌治疗等。然而，这些治疗方案或是价格昂贵，或是存在各种副作用，并不是所有的转移性或晚期tnbc患者都适合这些治疗方法。因此，在tnbc领域，我们迫切需要探索更多的抗耐药机制和一些非肿瘤药物的抗癌作用。
3.香石竹(dianthus caryophyllus l.)是石竹科，石竹属的多年生草本植物，是世界上最受欢迎的观赏植物之一，也是目前进行药理研究较多的植物之一。药理实验结果表明，香石竹具有抗癌、抗病毒、抗菌、杀虫、驱避、抗氧化、肾保护、麻醉和镇痛作用。香石竹传统上经常被用于药物和香料，香石竹精油可被用于愈合伤口、缓解头晕和提高食欲，而且香石竹的精油成分能够作为病媒抑制剂对蚊子幼虫具有杀伤作用。近年来研究发现，香石竹还具有良好的抗癌作用。从香石竹中分离得到的山奈酚甘油三酯(kaempferide triglycoside)被证明通过非配体结合依赖性雌激素受体激活介导的机制抑制天然雌激素受体β的过表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖，通过将hct8细胞抑制在g0/g1期从而影响其周期进程。在结肠癌异种移植模型中，石竹素(dianthin)对肿瘤组织有明显的抑制作用。在肝癌模型中，石竹乙醇提取物通过hepg2细胞中的线粒体途径和激活caspase途径来诱导细胞凋亡，但是香石竹在乳腺癌中的研究报道较少。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种香石竹水提物的提取方法，所述香石竹水提物为香石竹的根、茎、叶提取物。
7.优选的是，所述提取方法为将香石竹的根、茎、叶样品真空冷冻干燥、研磨，再利用甲醇提取得到粗提物，粗提物冷藏过夜，离心，即可得到所述香石竹水提物。
8.优选的是，所述研磨利用研磨仪进行研磨，频率为20～40hz，时间为1～2分钟。
9.优选的是，所述甲醇的体积浓度为70％，提取程序为每20～30分钟涡旋一次，每次持续20～40秒，共涡旋5～8次。
10.优选的是，所述冷藏温度为2～6℃。
11.优选的是，所述离心的转速为10000～14000rpm，时间为8～12min。
12.优选的是，所述过滤采用0.22μm微孔滤膜进行。
13.本发明还提供一种上述的提取方法制备的香石竹水提物。
14.本发明还提供一种上述的香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.本发明通过试验证明了香石竹水提物能够抑制mda-mb-231细胞的增殖，促进细胞的活性氧水平，并通过下调mda-mb-231细胞中pi3k、akt、mtor、p70、s6、4ebp1蛋白表达水平和foxo1、foxo3蛋白的磷酸化水平，调控pi3k/akt、foxo信号通路从而抑制tnbc细胞的增殖，揭示香石竹水在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中存在巨大的应用价值。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为不同浓度的香石竹水提物处理对mda-mb-231细胞增殖的影响图，其中a为培养48h后srb检测，b为培养72h后srb检测；
19.图2为ros检测香石竹水提物对mda-mb-231细胞活性氧的影响图，其中a为流式细胞仪测定的细胞氧化应激荧光强度值，其中nc为阴性对照组，ac为阳性对照组，b为a的量化结果图；
20.图3为香石竹水提物对信号通路的影响wb检测结果，其中a为香石竹水提物对pi3k/akt信号通路的影响，b为香石竹水提物对foxo信号通路的影响。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.本发明利用数据挖掘的方法筛选香石竹对tnbc的有效作用成分，并基于网络药理学的方法分析其潜在作用机制。通过网络数据库构建ppi网络，同时进行基因本体(gene ontology，go)分析和(kyoto encyclopedia of genes and genomes，kegg)信号通路分析。然后通过分子对接进一步探讨香石竹的有效成分发挥治疗tnbc的作用机制，并结合体外细胞实验，为香石竹在tnbc中的临床应用提供依据。
27.实施例
28.1.香石竹有效成分的提取与细胞培养
29.分别取香石竹根、茎、叶样品放置于冻干机(scientz-100f)中真空冷冻干燥，利用研磨仪(mm 400，retsch)研磨(30hz，1.5分钟)至粉末状，溶解于1.2ml体积分数为70％的甲醇提取液中，每30分钟涡旋一次，每次持续30秒，共涡旋6次；样本置于4℃冰箱过夜；转速12000rpm，离心10min后，吸取上清；用微孔滤膜(0.22μmpore size)过滤样品，并保存于进样瓶中，用于uplc-ms/ms分析。
30.数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)(shimadzu nexera x2)和串联质谱(tandem mass spectrometry，ms/ms)(applied biosystems 4500qtrap)。
31.2.srb实验检测对细胞增殖的影响
32.srb和细胞内碱性氨基酸结合后形成的复合物稳定性高，用tris-base溶解后可以保存较长的时间，重复性更好，同时，在srb实验过程中含有两次的清洗过程，这样可以有效地将分离组分残留清除，避免植物色素对于od值的影响。
33.人三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231(购自国家生物医学实验细胞资源库)在添加10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中培养，然后在37℃和5％ co2的环境中孵育(培养基和血清购自gibco公司)。每24小时更换一次培养基，记录对数生长细胞进行实验。
34.将细胞均匀铺于48孔板上，24h后加药。实验条件分为空白对照组和不同浓度香石竹水提物处理组(0、800、1600、2400、2800μg/ml)，每组设置五个重复孔。使用完全培养基对不同浓度组分按照比例计算，进行梯度稀释并混匀，加药后分别孵育48h、72h进行srb检测。
35.将孵育后的48孔板用20％的tca固定，于4℃放置2h；固定完毕后，使用清水洗4次并晾干；用1mm的srb溶液常温避光染色40min；染色结束后，用1％的乙酸清洗48孔板；待48孔板晾干后，再加入10mm的tris-base溶液，室温环境下500rpm摇板10-15min，以充分溶解srb染料；在510nm波长下检测各个孔的od值。
36.如图1所示，与空白对照组相比，香石竹水提物对mda-mb-231细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。
37.3.细胞活性氧(ros)检测
38.活性氧(reactive oxygen species，ros)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用dcfh-da(2,7-dichlorofuorescin diacetate)是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。用2400μg/ml的香石竹水提物处理mda-mb-231细胞48h后，去除细胞培养液，避光加入dcfh-da于无血清培养液中，工作浓度为2μm，阳性对照组预先加入h2o2处理30min，37℃孵育细胞20min-30min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh-da。用胰酶消化细胞(0.25％胰酶)，加入完全培养基终止消化，制成细胞悬液。300g离心5min(1500rpm/min)，用pbs洗涤1-2次。收集1
×
105细胞后流式细胞仪上机检测。
39.利用ros检测试剂盒分析香石竹水提物对mda-mb-231细胞活性氧的影响，如图2所示，与阴性对照组和阳性对照组相比，实验组细胞表现出明显的氧化应激，说明香石竹水提物促进了mda-mb-231细胞的活性氧水平。
40.4.western blot检测
41.用2400μg/ml的香石竹水提物处理mda-mb-231细胞48h后，收集细胞并加入ripa buffer裂解细胞提取蛋白；采用bca蛋白定量法测定蛋白浓度；用10％的sds-page胶将等量的蛋白进行sds-page电泳(140v，200ma，1h)，并转移到pvdf膜上(200v，300ma，3h)；用5％的脱脂牛奶或2％bsa进行封闭2h；用pi3k/akt、foxo一抗(1：1000)4℃过夜孵育，再用相应的二抗(1：10000)孵育2h；按照辣根过氧化物酶(hrp)显影说明书配置显影液，放入显影仪中显影。
42.western blotting实验分析mda-mb-231中pi3k/akt、foxo等信号通路的蛋白表达。如图3所示，香石竹水提物处理组中pi3k、akt、mtor及其下游蛋白p70、s6、4ebp1表达水平和p-foxo1、p-foxo3蛋白的表达水平较正常空白组略有下降。结果表明，香石竹水提物通过pi3k/akt、foxo信号通路下调mda-mb-231细胞中pi3k、akt、mtor、p70、s6、4ebp1表达水平和foxo1、foxo3蛋白的磷酸化水平，从而抑制tnbc细胞的增殖。
43.体外细胞实验结果表明，香石竹水提物能够抑制mda-mb-231细胞的增殖，促进细胞的活性氧水平，并通过下调mda-mb-231细胞中pi3k、akt、mtor、p70、s6、4ebp1蛋白表达水平和foxo1、foxo3蛋白的磷酸化水平，调控pi3k/akt、foxo信号通路从而抑制细胞增殖，揭示了香石竹水提物的抗癌作用和潜在作用机制。
44.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种香石竹水提物的提取方法，其特征在于，所述香石竹水提物为香石竹的根、茎、叶提取物。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法为将香石竹的根、茎、叶样品真空冷冻干燥、研磨，再利用甲醇提取得到粗提物，粗提物冷藏过夜，离心、过滤，即可得到所述香石竹水提物。3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述研磨利用研磨仪进行研磨，频率为20～40hz，时间为1～2分钟。4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述甲醇的体积浓度为70％，提取程序为每20～30分钟涡旋一次，每次持续20～40秒，共涡旋5～8次。5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述冷藏温度为2～6℃。6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为10000～14000rpm，时间为8～12min。7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述过滤采用0.22μm微孔滤膜进行。8.一种权利要求1～7任一项所述的提取方法得到的香石竹水提物。9.一种权利要求8所述的香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了香石竹水提物在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开了一种香石竹水提物的提取方法，所述香石竹水提物为香石竹的根、茎、叶提取物。本发明通过试验证明了香石竹水提物能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖，促进细胞的活性氧水平，并通过下调MDA-MB-231细胞中PI3K、AKT、mTOR、P70、S6、4EBP1蛋白表达水平和FoxO1、FoxO3蛋白的磷酸化水平，调控PI3K/AKT、FoxO信号通路从而抑制TNBC细胞增殖。号通路从而抑制TNBC细胞增殖。号通路从而抑制TNBC细胞增殖。


技术研发人员：盛苗苗 李慧敏 周旭红 李明 唐文如
受保护的技术使用者：云南中医药大学
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/18