一种体外脂肪肝类器官模型及其制备方法与在药物测试中的应用

1.本发明涉及器官模型技术领域，具体涉及一种体外脂肪肝类器官模型及其制备方法与在药物测试中的应用。


背景技术：

2.世界卫生组织的统计数据表明，全球有3.5亿人患有肝病，每年有100多万人因此死亡，与肝病相关的死亡人数还在逐步增加。当肝脏中脂肪含量超过5％时，即可认为患有脂肪肝。脂肪变性是脂肪肝最重要的标志，脂肪肝可以从脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎，在更严重的情况下，可发展为肝纤维化和肝硬化，最终可能导致肝细胞癌。因此，脂肪肝需要及早诊断和治疗。
3.目前的脂肪肝临床治疗方法有药物治疗、介入治疗、手术治疗等方法。药物治疗是最方便且对机体副作用最小的治疗方式，但是治疗脂肪肝并没有很强针对性的或者疗效较好的药物，所以开发疗效好的、副作用小的新药就尤为重要。在过去的几年中，研究人员采取了不同的方法来开发nafld动物模型，如：专利cn114916497a、专利cn112352739a构建一种非酒精性脂肪肝小鼠模型用于科学研究。使用动物模型进行实验研究存在一些问题，如伦理纠纷、耗时长、成本高等，且动物模型在理化微环境与代谢能力方面与人体存在着显著性差异。因此，迫切希望能够研发出一种在形态、理化微环境及代谢能力等方面与人体高度相似的脂肪肝类器官模型，并能够有效的代替动物用于研究脂肪肝的病理机制及相关药物测试。
4.类器官属于三维细胞培养物，含有单一成体干细胞或者通过多能干细胞的定向诱导分化都能够产生类器官，其包含其代表器官的一些关键特性，并能够在许多系统中进行无限期传代和长期培养。到目前为止，类器官培养已用于各种组织器官，其中包括肠道、肝脏、胰腺、肾脏等。3d生物打印技术在生命科学领域的应用日益广泛，现已成为21世纪最具发展潜力的前沿技术之一。现已有研究人员使用功能细胞和水凝胶的聚合物利用3d生物打印技术在体外成功构建了肝类器官样结构，在疾病病理学、精准医疗以及药物毒性测试等领域发挥巨大作用。如yang等人用明胶和海藻酸钠利用挤压式打印构建了体外肝组织模型，显示出良好的细胞-细胞、细胞-细胞基质之间的相互作用，结构具有高度完整性，且肝组织的生物学表征高度表达。然而，构建成熟的血管样通道向肝细胞供应氧气和营养仍然是一项技术挑战。
5.目前尚未见到有关3d生物打印技术用于构建脂肪肝类器官模型的报道。3d打印脂肪肝类器官模型的关键因素是用于3d生物打印的原材料，即生物墨水。然而，基于生物打印技术构建个性化定制的脂肪肝类器官模型还处于初级阶段，目前用于生物打印的墨水，不具有良好的生物相容性，稳定性差且细胞存活率较低，很难模拟相应的生物结构的组织样结构，实现细胞与微环境之间的信息交换，达到高度仿生，无法很好应用于后续的研究。公布号为cn108310463a的专利申请公开一种3d打印生物墨水及其制备方法，但该墨水很难进
行脂肪肝类器官模型的打印，且很难维持后期培养。
6.有鉴于此，我们提出一种生物打印脂肪肝类器官模型的制备方法，解决现有类器官系统的一些局限，填补利用肝类器官研究脂肪肝的疾病机制和药物测试方面的空白，为药物研究和肝组织工程领域提供了一种新的工具。
7.现有的脂肪肝模型都是依赖动物模型来进行病理机制研究，鉴于人类疾病的复杂性，迄今为止，没有任何一种动物模型能够完全概括人类疾病的状态。与人体具有显著性代谢差异是动物模型的主要缺点。诱导动物产生脂肪肝的致病性刺激是人工的，通常与人类发病机理无关。不同脂肪肝动物模型的诱导方式的不一致，这也会导致实验结果的不准确，如公布号为cn114503955a，采用敲除小鼠的nr4a1-/-基因敲除的小鼠来构建脂肪肝小鼠模型，公布号为cn113796324a采用高果糖饮食来诱导构建脂肪肝小鼠模型。此外，出于道德伦理的考虑，越来越不鼓励使用实验动物。目前大部分的生物墨水均具有一定的机械性以及生物相容性，但对于体外3d细胞模型培养，如何提高细胞活力成为了亟待解决的问题。现有的一些研究人员将一些细胞生长因子加入生物墨水，来提高细胞活力，但是水凝胶组分配比与生长因子浓度的不同会导致细胞活力的不同，所以，很多体外3d细胞模型的培养都不能很好的模拟人体内的细胞复杂的功能，导致研究效率低下。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题在于如何解决现有的很多体外3d细胞模型的培养都不能很好的模拟人体内的细胞复杂的功能，导致研究效率低下的问题。
9.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
10.本发明的第一方面提供一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)dmem完全培养基的制备：高糖dmem培养基中添加抗生素、非必需氨基酸溶液、胰岛素、谷氨酰胺、氢化可的松琥珀酸酯和胎牛血清；
12.(2)水凝胶制备：将一定量的明胶粉末、海藻酸钠粉末置于紫外灯下照射后，溶解于dmem完全培养基(h-dmem，gibco)中，然后把悬浮液放到烘箱中，使海藻酸钠和明胶充分溶解，溶剂完成后高压蒸汽灭菌，放入培养箱中备用；
13.(3)细胞悬浮液制备：将heparg细胞置于dmem完全培养基(h-dmem，gibco)中，在细胞培养箱中培养，当heparg细胞在培养皿内增殖后，先用移液枪吸出培养皿中的原培养基，用pbs清洗，洗去残留的培养基，其次加入胰蛋白酶在培养箱内消化；待细胞漂浮时，加入dmem完全培养基(h-dmem，gibco)终止消化；接着，将胰蛋白酶与dmem完全培养基混合均匀，轻轻吹打从而使细胞从皿底脱落；将混合液体移入离心管，在离心机中进行离心，弃去上清液；再加入层粘连蛋白溶液、纤维蛋白原溶液与dmem完全培养基进行细胞重悬，得到细胞悬浮液；
14.(4)生物墨水制备：将步骤(3)获得的细胞悬浮液与水凝胶混合物混合，吹打，即得。
15.有益效果：本发明使用新型生物墨水，即在一定比例的明胶海藻酸钠混合溶液中加入纤连蛋白、层粘连蛋白一系列生长因子以提高细胞活力。本发明提供了网格状结构，模拟了体内肝脏的血管样通道，营养物质和氧气可以在网格结构中进行充分扩散，高度仿生细胞动态代谢过程与肝脏组织结构。该打印方式可以层层堆叠，依照用户个性化需求定制
打印结构，为脂肪肝类器官模型的的制备提供新的技术方案。本发明提出的脂肪肝类器官模型，有效的提升药物肝毒性评价的可靠性、准确性及全面性，可作为有前景的体外药物筛选药物测试平台。
16.优选的，所述步骤(1)中高糖dmem培养基中添加1％(v/v)抗生素、1％(v/v)非必需氨基酸溶液、5μg/ml胰岛素、2mm谷氨酰胺、50μm氢化可的松琥珀酸酯和10％胎牛血清。
17.优选的，所述步骤(2)中明胶的终浓度为5％(wt％)，海藻酸钠的终浓度为1％(wt％)。
18.优选的，所述步骤(4)中细胞悬浮液与水凝胶混合物的体积比为1:1。
19.优选的，该生物墨水中的明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、层粘连蛋白及其细胞的最终浓度为：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1
×
107cells/ml。
20.本发明的第二方面提供一种采用上述方法制备的生物墨水。
21.本发明的第三方面提供一种采用上述方法制备的生物墨水的应用。
22.本发明的第四方面提供一种体外脂肪肝类器官模型的制备方法，包括以下步骤：
23.(1)将上述生物墨水加入一个带有针头的消毒注射器中，装载至打印机的针筒中，调整针筒温度，打印机形成室温度，以保持在打印过程中细胞活力达到条件；
24.(2)使用计算机软件设置打印轨迹，将培养皿放置在打印台，来收集打印出的结构；以层层堆叠的方式按照预设的打印轨迹制作一个立体网格结构；
25.(3)将步骤(2)获得的立体网格结构转移到cacl2溶液中浸没交联，然后生理盐水冲洗；再加入dmem完全培养基培养，后转移至脂肪肝类器官诱导培养基中，置于细胞培养箱中培养，定期更换脂肪肝类器官诱导培养基；
26.(4)在将培养后的肝组织模型中添加dmso进行诱导分化；完成诱导后，观察其结构，肝细胞呈类器官样结构，即得。
27.本发明的第五方面提供一种采用上述方法制备的体外脂肪肝类器官模型。
28.本发明的第六方面提供一种脂肪肝药物的体外测试方法，包括以下步骤：
29.(1)在上述的体外脂肪肝类器官模型中，加入脂肪肝药物，使用dmem完全培养基培养脂肪肝类器官模型；
30.(2)然后转入elafibanor预防培养基培养；
31.(3)评估脂肪肝类器官模型中的脂滴积累和白蛋白分泌情况。
32.本发明的优点在于：
33.1、本发明使用新型生物墨水，即在一定比例的明胶海藻酸钠混合溶液中加入纤连蛋白、层粘连蛋白一系列生长因子以提高细胞活力。本发明提供了网格状结构，模拟了体内肝脏的血管样通道，营养物质和氧气可以在网格结构中进行充分扩散，高度仿生细胞动态代谢过程与肝脏组织结构。
34.2、该打印方式可以层层堆叠，依照用户个性化需求定制打印结构，为脂肪肝类器官模型的的制备提供新的技术方案。本发明提出的脂肪肝类器官模型，有效的提升药物肝毒性评价的可靠性、准确性及全面性，可作为有前景的体外药物筛选药物测试平台。
35.3、本发明提供的肝打印生物墨水具有良好的机械性能和生物相容性，能获得稳定的打印结构，高细胞存活率。
36.4、本发明提供的人源脂肪肝类器官模型更能够体外模拟人体微环境，成为一种有
效的体外脂肪肝类器官模型。
37.5、对应生物墨水而言，很难既具有良好的机械性能又具备良好的生物相容性，为了优化打印肝组织的生物墨水，本发明提供了一种生物墨水的配比，能够具有良好的机械性能和生物相容性
38.6、目前常用的脂肪肝模型多为动物模型，由于动物与人的差异，不能很好预测人体的生理状态，本发明提供的人源脂肪肝类器官模型能够体外模拟人体微环境，且不存在动物伦理问题，有望成为一种有效的体外脂肪肝类器官模型。
39.7、目前药物测试多用动物模型，而动物模型与人体存在差异，且会遇到动物伦理问题，本发明提供一种简便有效的治疗脂肪肝药物测试的方法，能够提高前期药物测试的效率，减少动物的使用量。
附图说明
40.图1为本发明实施例3中使用的生物3d打印机的结构示意图；
41.图2为本发明实施例3中实验ⅰ明胶浓度不同时细胞存活率的对比图；
42.图3为本发明实施例3中实验ⅱ纤维蛋白浓度不同时细胞存活率的对比图；
43.图4为本发明实施例3中实验ⅲ层粘连蛋白原浓度不同时细胞存活率的对比图；
44.图5为本发明实施例5中的脂肪肝类器官图；
45.图6为本发明实施例5中细胞存活染色结果图；
46.图7为本发明实施例5中细胞存活率结果图；
47.图8为本发明实施例6中的脂滴积累染色结果图；
48.图9为本发明实施例6中相对脂质含量结果图；
49.图10为本发明实施例9预防作用中评估模型中的白蛋白分泌情况图；
50.图11为本发明实施例9预防作用中评估模型中的脂滴积累情况图；
51.图12为本发明实施例9逆转作用中评估模型中的白蛋白分泌情况图；
52.图13为本发明实施例9逆转作用中评估模型中的脂滴积累情况图。
具体实施方式
53.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
54.实例1：
55.一种脂肪肝类器官模型的生物墨水的制备方法，制备流程如下：
56.(1)dmem完全培养基的制备：500ml高糖dmem培养基(高糖培养基即塞维尔公司的高糖dmem，是厂家配制好的)中添加5ml的1％(v/v)抗生素、5ml的1％(v/v)非必需氨基酸溶液、835μl的5μg/ml胰岛素、500μl的2mm谷氨酰胺、5ml的50μm氢化可的松琥珀酸酯和50ml的10％(v/v)胎牛血清；
57.(2)水凝胶制备：将1g明胶粉末和0.2g海藻酸钠粉末置于紫外灯下照射40min后，溶解于10ml dmem完全培养基(h-dmem，gibco)中，明胶的终浓度为5％(wt％)，海藻酸钠的
终浓度为1％(wt％)，然后把悬浮液放到60℃烘箱中1h使海藻酸钠和明胶充分溶解，溶剂完成后高压蒸汽灭菌，37℃培养箱中备用；
58.(3)细胞悬浮液制备：将heparg细胞置于10ml dmem完全培养基(h-dmem，gibco)中，在5％co2的细胞培养箱中37℃培养；当heparg细胞在培养皿内增殖至95％左右后，首先，用移液枪吸出培养皿中的原培养基，用pbs清洗3次，每次3min，洗去残留的培养基；其次，加入2ml胰蛋白酶(0.25％trypsin-edta)在培养箱内消化4min；待细胞漂浮时，加入2ml dmem完全培养基(h-dmem，gibco)终止消化；接着，将胰蛋白酶与dmem完全培养基混合均匀，轻轻吹打从而使细胞从皿底脱落；把4ml液体移入离心管，在离心机中进行离心(130g，3min)，弃去上清液；再加入100μg/ml的层粘连蛋白溶液、5mg/ml纤维蛋白原溶液与dmem完全培养基进行细胞重悬，得到细胞悬浮液；
59.(4)生物墨水制备：将含有层粘连蛋白、纤维蛋白、dmem完全基培养的细胞悬浮液与水凝胶混合物按体积比1：1混合，吹打(轻轻吹打，避免产生气泡，影响打印结果)，形成最终用于脂肪肝类器官模型制备的生物打印墨水。该墨水明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、层粘连蛋白及其细胞的最终浓度为：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1
×
107cells/ml。配制2.0％的cacl2溶液，作为生物墨水的偶联剂。
60.实例2：脂肪肝类器官诱导培养基配制
61.首先，将棕榈酸(1m)和油酸(2m)溶解在dmso中以制备游离脂肪酸(ffas)储备溶液，-20℃储存；然后，向dmem完全培养基中添加牛血清白蛋白(终浓度为1％w/v)游离脂肪酸储备溶液(终浓度为900μm)和葡萄糖(终浓度为55mm)，将培养基在37℃下水浴加热2小时，使游离脂肪酸与白蛋白结合；最后，调整培养基中dmso浓度，使含有不同浓度游离脂肪酸的脂肪肝类器官诱导培养基最终的dmso浓度为0.045％。
62.实例3：3d打印脂肪肝类器官模型
63.本实例设有三组实验，实验ⅰ设有1个实验组，6个对照组。
64.实验ⅱ、ⅲ均设有一个实验组、4个对照组。
65.实验ⅰ：
66.实验组本实验组采用实例1中制备的生物墨水
67.对照组1本对照组采用最终浓度3％(w/v)，0.5％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同制备的生物墨水；
68.对照组2本实施例采用最终浓度3％(w/v)，1％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
69.对照组3本实施例采用最终浓度3％(w/v)，1.5％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
70.对照组4本实施例采用最终浓度3％(w/v)，2％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
71.对照组5本实施例采用最终浓度5％(w/v)，0.5％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
72.对照组6本实施例采用最终浓度5％(w/v)，1.5％(w/v)的明胶、海藻酸钠，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
73.实验ⅱ：
74.实验组本实验组采用实例1中制备的生物墨水
75.对照组1本对照组采用最终浓度0mg/ml的纤维蛋白原，其余组份与实施例1相同制备的生物墨水；
76.对照组2本实施例采用最终浓度0.5mg/ml的纤维蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
77.对照组3本实施例采用最终浓度1.5mg/ml的纤维蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
78.对照组4本实施例采用最终浓度3mg/ml的纤维蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
79.实验ⅲ：
80.实验组本实验组采用实例1中制备的生物墨水
81.对照组1本对照组采用最终浓度0μg/ml的层粘连蛋白原，其余组份与实施例1相同制备的生物墨水；
82.对照组2本实施例采用最终浓度10μg/ml的层粘连蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
83.对照组3本实施例采用最终浓度50μg/ml的层粘连蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
84.对照组4本实施例采用最终浓度70μg/ml的纤维蛋白原，其余组份与实施例1相同的生物墨水；
85.我们使用瑞士regenhμ3d discovery生物3d打印机(900002700))，如图1a所示，将实例1制备的生物墨水加入一个带有0.33mm针头的消毒注射器中(如图1b所示)，装载至生物3d打印机的针筒中(如图1c所示)，调整针筒温度至7℃，打印机形成室温度至27℃，以保持在打印过程中细胞活力达到条件。
86.使用计算机软件设置打印轨迹：长宽均为8mmx8mm的正方形，层数为2层，线间距为2mm。将直径为50mm的培养皿放置在打印台，来收集打印出的结构。在0.178kpa的挤压压力下以3mm/s的速度以层层堆叠的方式按照预设的打印轨迹制作一个立体网格结构(如图1d所示)。
87.随后将打印出的网格结构立即转移到2.0％cacl2溶液中浸没交联5min，生理盐水冲洗；再加入5mldmem完全培养基培养两天，后转移至实例2制备的脂肪肝类器官诱导培养基中，置于细胞培养箱中培养，每隔两天换一次脂肪肝类器官诱导培养基。
88.在将培养7天后肝组织模型中添加2％dmso进行诱导分化；完成诱导后，观察其结构，肝细胞呈类器官样结构，即得到本发明所述的脂肪肝类器官。
89.实例4：3d肝类器官活死细胞染色
90.在培养第1天和7天后，进行细胞死活染色，评估实例2中实验ⅰ、ⅱ、ⅲ的实验组与对照组的细胞存活率。采用荧光死活染色法来检测细胞存活率，采用calcein-am和pi分别鉴定活细胞、死细胞和细胞核。将打印出的组织结构在37℃下浸没到2μmcalcein-am和10μg/mlpi的混合溶液中避光孵育30min。然后，用pbs溶液轻轻洗涤细胞3次，每次3min。最后，在荧光显微镜下进行观察，随后拍摄观察到的图像。使用imagej计数细胞，依照(活细胞数/细胞总数)
×
100％来计算细胞活力。每个样本采集5个随机场，计数5个样本。
device.plos one,11(7),e0159729.)。说明本脂肪肝类器官模型达到高度仿生体内肝脏功能。
103.实例7：elafibanor预防培养基的配制
104.将dmso加入elafibanor粉末中，充分溶解得到浓度为120mm的母液，放在-20℃保存，工作液浓度为30μm(1：4000添加到实例2中的脂肪肝类器官诱导培养基中)。最后调整培养基中dmso浓度，使含有elafibanor的脂肪肝类器官诱导培养基最终的dmso浓度为0.045％。
105.实例8：elafibanor预防培养基的配制
106.将dmso加入elafibanor粉末中，充分溶解得到浓度为120mm的母液，放在-20℃保存，工作液浓度为30μm(1：4000添加到实例2中的脂肪肝类器官诱导培养基中)。最后调整培养基中dmso浓度，使含有elafibanor的脂肪肝类器官诱导培养基最终的dmso浓度为0.045％。
107.实例9：药物测试
108.在实例3中制备的脂肪肝类器官模型中，加入30μm的elafibanor(一种过氧化物酶体增殖物激活受体pparα和pparδ的双重激动剂，具有控制脂质代谢和消除炎症作用)来评估药物对脂肪肝类器官模型的预防和逆转作用。
109.预防作用:
110.实验组在第0-4天，使用dmem完全培养基培养脂肪肝类器官模型，持续4天。第4天，转入实例7中制备的elafibanor预防培养基培养(持续3天)。第七天，评估脂肪肝类器官模型中的脂滴积累情况(如图11所示)和白蛋白分泌情况(如图10所示)。脂滴积累通过尼罗红染色计算荧光归一化面积，白蛋白分泌通过人白蛋白elisa试剂盒定量检测，用酶标仪测量吸光度。
111.对照组1与实验组不同之处在于构建的肝组织模型用dmem完全培养基培养7天。
112.对照组2在0-4天(持续4天)用dmem完全培养基进行培养,第4天转入实例2中的脂肪肝类器官诱导培养基培养(持续3天)。
113.逆转作用：
114.实验组在第0-4天，dmem完全培养基培养肝组织模型，第4天转入脂肪肝类器官诱导培养基培养(持续2天)，第6天转入实例8中制备的elafibanor逆转培养基培养(持续1天)。第7天，评估脂肪肝类器官模型中的脂滴积累和白蛋白分泌情况。
115.对照组1与实验组不同之处在于构建的肝组织模型用dmem完全培养基培养7天。
116.对照组2在0-4天(持续4天)用dmem完全培养基进行培养，第4天转入实例2中制备的脂肪肝类器官诱导培养基培养(持续2天)，第6天转入dmem完全培养基培养(持续1天)。
117.结果如图10、11、12、13显示，预防实验中，实验组与对照组相比，实验组中脂滴积累量明显降低。逆转实验中，实验组中脂滴积累量显著降低，并且使细胞内脂滴积累恢复正常水平。两组实验中，实验组与对照组的白蛋白含量没有明显差异，表明，该药物在预防和逆转脂肪肝中未对肝功能造成显著的损伤。综合ela药物预防和逆转实验结果可知，本发明构建的脂肪肝类器官模型成功测试了elafibanor的预防和逆转作用。
118.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施
例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)dmem完全培养基的制备：高糖dmem培养基中添加抗生素、非必需氨基酸溶液、胰岛素、谷氨酰胺、氢化可的松琥珀酸酯和胎牛血清；(2)水凝胶制备：将一定量的明胶粉末、海藻酸钠粉末置于紫外灯下照射后，溶解于dmem完全培养基中，然后把悬浮液放到烘箱中，使海藻酸钠和明胶充分溶解，溶剂完成后高压蒸汽灭菌，放入培养箱中备用；(3)细胞悬浮液制备：将heparg细胞置于dmem完全培养基中，在细胞培养箱中培养，当heparg细胞在培养皿内增殖后，先用移液枪吸出培养皿中的原培养基，用pbs清洗，洗去残留的培养基，其次加入胰蛋白酶在培养箱内消化；待细胞漂浮时，加入dmem完全培养基终止消化；接着，将胰蛋白酶与dmem完全培养基混合均匀，轻轻吹打从而使细胞从皿底脱落；将混合液体移入离心管，在离心机中进行离心，弃去上清液；再加入层粘连蛋白溶液、纤维蛋白原溶液与dmem完全培养基进行细胞重悬，得到细胞悬浮液；(4)生物墨水制备：将步骤(3)获得的细胞悬浮液与水凝胶混合物混合，吹打，即得。2.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中高糖dmem培养基中添加1％(v/v)抗生素、1％(v/v)非必需氨基酸溶液、5μg/ml胰岛素、2mm谷氨酰胺、50μm氢化可的松琥珀酸酯和10％胎牛血清。3.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中明胶的终浓度为5％(wt％)，海藻酸钠的终浓度为1％(wt％)。4.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中细胞悬浮液与水凝胶混合物的体积比为1:1。5.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，该生物墨水中的明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、层粘连蛋白及其细胞的最终浓度为：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1
×
107cells/ml。6.采用权利要求1-3任一项的制备方法制备的生物墨水。7.采用权利要求1-3任一项的制备方法制备的生物墨水的应用。8.一种体外脂肪肝类器官模型的制备方法，包括以下步骤：(1)将权利要求6的生物墨水加入一个带有针头的消毒注射器中，装载至打印机的针筒中，调整针筒温度，打印机形成室温度，以保持在打印过程中细胞活力达到条件；(2)使用计算机软件设置打印轨迹，将培养皿放置在打印台，来收集打印出的结构；以层层堆叠的方式按照预设的打印轨迹制作一个立体网格结构；(3)将步骤(2)获得的立体网格结构转移到cacl2溶液中浸没交联，然后生理盐水冲洗；再加入dmem完全培养基培养，后转移至脂肪肝类器官诱导培养基中，置于细胞培养箱中培养，定期更换脂肪肝类器官诱导培养基；(4)在将培养后的肝组织模型中添加dmso进行诱导分化；完成诱导后，观察其结构，肝细胞呈类器官样结构，即得。9.采用权利要求8的制备方法制备的体外脂肪肝类器官模型。10.一种脂肪肝药物的体外测试方法，包括以下步骤：(1)在如权利要求9的体外脂肪肝类器官模型中，加入脂肪肝药物，使用dmem完全培养基培养脂肪肝类器官模型；
(2)然后转入elafibanor预防培养基培养；(3)评估脂肪肝类器官模型中的脂滴积累和白蛋白分泌情况。

技术总结
本发明公开了一种体外脂肪肝类器官模型及其制备方法与在药物测试中的应用，具体涉及生物墨水、器官模型技术领域。生物墨水由细胞悬浮液和水凝胶混合、吹打获得，该墨水明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、层粘连蛋白及其细胞的最终浓度为：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1


技术研发人员：刘婧 明紫贝 阮班锋 唐新宇 彭玮
受保护的技术使用者：合肥学院
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/18