一种酸性α-半乳糖苷酶KAG、及其编码基因和应用的制作方法

一种酸性
α-半乳糖苷酶kag、及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性α-半乳糖苷酶kag、及其编码基因和应用。


背景技术：

2.α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，ec3.2.1.22)能特异性水解半乳糖苷类的非还原性未端α-1，6-半乳糖苷键。该酶水解底物主要包括棉籽糖类寡糖，如水苏糖、棉籽糖等，在饲料、食品和医药等领域中有着良好的应用前景。
3.豆粕、杂粕等饲料原料中通常含有α-半乳糖苷类物质，由于单胃动物不能产生分解α-半乳糖苷的酶，这些α-半乳糖苷类物质的存在，一方面增加了小肠内容物的持水力和渗透性，降低了营养成分的消化吸收率,另一方面，α-半乳糖苷类物质在动物消化道后段被厌氧菌所代谢，产生二氧化碳、氢气及少量的甲烷气体，会引起动物消化不良、腹胀和腹泻等症状。通过外源添加α-半乳糖苷酶，可有效地去除这些α-半乳糖苷类物质的不利影响。α-半乳糖苷酶作为一种新型的饲料用酶制剂，可有效地促进饼、粕类饲料原料中α-半乳糖苷物质的分解，提高饲料利用率，消除这些物质由引起的抗营养作用，在饲料工业中具有良好的应用前景。
4.α-半乳糖苷酶作为食品用酶制剂应用于豆奶发酵，可水解豆奶中引起胃胀的蜜三糖和水苏糖等物质，获得低α-半乳糖苷基寡糖含量的豆奶制品，有利于人体消化吸收。
5.在临床中，半乳糖苷酶可用于治疗法布里(fabry's)病和血型转换。
6.目前，α-半乳糖苷酶主要通过微生物发酵制取，但目前α-半乳糖苷酶的发酵水平较低，酶的稳定性也较差，因此，急需提高该酶的发酵水平以及酶的稳定性。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种酸性α-半乳糖苷酶kag。
8.本发明的另一目的是提供编码上述酸性α-半乳糖苷酶的基因kgal。
9.本发明的另一目的是提供包含上述酸性α-半乳糖苷酶的重组载体。
10.本发明的另一目的是提供包含上述酸性α-半乳糖苷酶基因kgal的重组菌株。
11.本发明的另一目的是提供制备上述酸性α-半乳糖苷酶kag的方法。
12.本发明的另一目的是提供上述酸性α-半乳糖苷酶kag的应用。
13.根据本发明的酸性α-半乳糖苷酶kag，其氨基酸序列如seq id no:1所示：
[0014][0015]
该酸性α-半乳糖苷酶酶蛋白由431个氨基酸组成，其分子量为47.48kd，等电点为4.68。
[0016]
本发明的编码上述酸性α-半乳糖苷酶的基因kgal的核苷酸序列如seq id no:2所示：
[0017][0018]
本发明还提供了包含上述酸性α-半乳糖苷酶基因kgal的重组载体，优选为kgal-ppiczαa。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明经优化后的酸性α-半乳糖苷酶基因kgal插入到质粒ppiczαa上的ecor i和noti限制性酶切位点之间，使该基因序列位于aox1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒kgal-ppiczαa。
[0019]
本发明还提供了包含上述酸性α-半乳糖苷酶基因kgal的重组菌株，优选表达宿主为野生型毕赤酵母菌株x33。
[0020]
根据本发明的高效表达上述酸性α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：
[0021]
1)用上述重组载体转化毕赤酵母感受态细胞x33，得到重组菌株kgal-ppiczαa-x33；
[0022]
2)采用筛选获得的重组菌株进行发酵，诱导该酸性α-半乳糖苷酶的表达；以及
[0023]
3)发酵结束后，回收、纯化所表达的该酸性α-半乳糖苷酶。
[0024]
其中，重组菌株的发酵过程可分为3个阶段：
[0025]
第一阶段为菌体培养阶段，按10％的比例接入种子，培养18-24小时，以补完甘油、ph及do上升为标志；
[0026]
第二阶段为饥饿阶段，甘油补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；
[0027]
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，整个培养时间为180-200小时之间。
[0028]
发酵结束后，发酵液去除菌体及超滤膜浓缩后得到粗酶液，再进行后继处理。
[0029]
利用本发明的方法高效表达上述的酸性α-半乳糖苷酶，在发酵液中可达到1552u/ml，大幅高于国内采用天然菌种的发酵水平，而且酶的稳定性能好，大大降低了α-半乳糖苷酶的生产成本，有利于α-半乳糖苷酶的推广应用。该α-半乳糖苷酶的有效作用ph为1.5～7.0，最适反应ph为4.0，而且稳定性能良好。同市场上出现的一些α-半乳糖苷酶产品存在易失活、稳定性较差相比，该突变株所产的α-半乳糖苷酶具有很大的优势，可适用于饲料、食品、医药等领域，具有良好的市场应用前景。
附图说明
[0030]
图1为重组酸性α-半乳糖苷酶在50l罐中的发酵过程曲线；
[0031]
图2为重组酸性α-半乳糖苷酶sds-page电泳图谱；
[0032]
图3为重组酸性α-半乳糖苷酶的最适反应温度曲线；
[0033]
图4为重组酸性α-半乳糖苷酶的最适反应ph曲线；
[0034]
图5显示重组酸性α-半乳糖苷酶在常温下贮存稳定性测定结果；
[0035]
图6显示各种离子对重组酸性α-半乳糖苷酶酶活力的影响。
具体实施方式
[0036]
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0037]
实验材料和试剂：
[0038]
1、菌株与载体
[0039]
大肠杆菌菌株topl0、毕赤酵母x33、载体ppiczαa均购自invitrogen公司。
[0040]
2、酶与试剂盒
[0041]
rna提取试剂盒、逆转录酶superscript
tm
iii购自invitrogen公司。质粒dna提取试剂盒、胶回收试剂盒、pcr纯化试剂盒、连接酶、限制性内切酶购自上海生工公司。
[0042]
3、培养基
[0043]
基础盐培养基(bsm)：磷酸二氢铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。
[0044]
0.1mpa、121℃灭菌30min，冷却后每升加4.4毫升无机盐溶液(ptm1)。
[0045]
微量元素(ptm1)配制：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。
[0046]
实施例1、α-半乳糖苷酶天然生产菌种的诱变及发酵培养
[0047]
选取产α-半乳糖苷酶的黑曲霉菌株an0803(菌种保藏编号：accc30132)，划线于pda平板，32℃培养2-3天至长出大量黑色孢子后，用无菌水洗出孢子，然后采用紫外线、亚硝基胍、高能离子束、硫酸二乙酯(des)等进行多次单一及复合诱变处理，筛选获得一株高产α-半乳糖苷酶突变株an0803-m。
[0048]
采用该突变株进行摇瓶发酵培养，培养基组成如下：
[0049]
蛋白胨0.5％、豆粕粉2.5％、葡萄糖2％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.10％，以上发酵培养基于121℃、0.1mpa下灭菌30min，冷却后接种an0803-m菌种，于30℃、200rpm条件下培养4～5天。
[0050]
发酵结束后，过滤或离心去除菌体，得到滤液或离心上清液，进行α-半乳糖苷酶的酶活检测。结果表明，该α-半乳糖苷酶的有效作用ph为1.5～7.0，最适反应ph为4.0，而且稳定性能良好。
[0051]
实施例2、黑曲霉突变株(an0803-m)产α-半乳糖苷酶基因的克隆
[0052]
采用rna提取试剂盒，提取黑曲霉突变株(an0803-m)的总rna，按照逆转录酶superscript
tm
iii reverse transcriptase操作说明合成第一链cdna。以cdna为模板，设计引物进行pcr扩增。
[0053]
扩增所用引物如下：
[0054]
gal-f(ecori)：
[0055]5’
gacagaattcatgcggtggcttctcgcact 3’[0056]
gal-r(noti)：
[0057]5’
gacagcggccgcctacaccaccaacgcgacat3’[0058]
pcr结束后，采用pcr产物纯化试剂盒进行纯化，并对纯化产物进行ecori和noti双酶切，然后与经过同样双酶切的载体ppiczαa相连接，连接产物转化大肠杆菌topl0感受态细胞，经抗生素zeocin筛选，获得阳性克隆。
[0059]
提取阳性克隆的质粒测序，测序结果表明，该编码α-半乳糖苷酶的基因全长1296bp，编码431个氨基酸。同时，将该基因序列进行同源性比对，比对结果表明，该酶与一种来源于黑曲霉(cbs101883)中的α-半乳糖苷酶基因具有92％的同源性。构建重组表达载体，命名为kgal-ppiczαa。
[0060]
实施例3、含酸性α-半乳糖苷酶基因kgal的毕赤酵母工程菌的构建
[0061]
将上述重组表达载体kgal-ppiczαa采用内切酶saci进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母感受态细胞x33，电转化后涂布于含zeocin(添加浓度：150-200μg/ml)的ypd平板上进行筛选，筛选得到一株高产酸性α-半乳糖苷酶的毕赤酵母重组菌株kgal-ppiczαa-x33。
[0062]
实施例4、酸性α-半乳糖苷酶重组工程菌的高密度液体发酵培养
[0063]
采用实施例3中筛选获得的酸性α-半乳糖苷酶重组工程菌株kgal-ppiczαa-x33进行高密度液体发酵培养。
[0064]
配制20l基础盐培养基(bsm培养基)，在50l液体发酵罐中121℃、0.1mpa高温灭菌30min后，冷却至常温。用氨水调节发酵液的ph值为4.60-4.80，接入2l摇瓶液体种，发酵温度设定为30℃，调节发酵罐转速和空气流量，控制整个发酵过程中溶氧大于20％以上。
[0065]
整个发酵过程分3个阶段：
[0066]
第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的4l 50％的甘油，培养20-24小时，流加完全部甘油后结束；
[0067]
第二阶段为饥饿阶段，甘油全部流加完，且溶氧上升至80％以上、ph开始上升即表明该阶段结束，为期30min左右；
[0068]
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上。
[0069]
整个发酵培养时间为180-200小时。
[0070]
诱导开始后，定时取样进行酶活检测，整个发酵过程中该酸性α-半乳糖苷酶的表达情况如图1所示，发酵190h的发酵液酶活为1552u/ml。
[0071]
实施例5、酸性α-半乳糖苷酶的酶学性质测定
[0072]
酶活单位定义：1ml酶液或1g固体酶粉在37℃、ph5.5的条件下，反应5min，每分钟释放1μm对硝基酚所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。
[0073]
发酵离心上清液经过10kd超滤膜浓缩后，进行盐析，然后将盐析产物通过sephadex g-75层析柱进行纯化，收集层析液，浓缩，进行以下酶学性质测定：
[0074]
1、sds-page电泳
[0075]
采用层析浓缩液，进行sds-page蛋白电泳，电泳结束后，显示出一条清晰的条带，且分子量约为47kd左右，这与该酶的理论分子量相符，电泳结果如图2。
[0076]
2、最适反应温度测定
[0077]
按照α-半乳糖苷酶检测方法，分别吸取0.9ml对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖(sigma)于若干试管中，在各设定温度下预热3min，分别加入0.1ml酶液，混匀，在各设定温度下反应5min后，加10％碳酸钠溶液混匀以结束反应，然后利用分光光度计于405nm处检测酶活，以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。
[0078]
该酸性α-半乳糖苷酶的最适反应温度曲线如图3所示，其最适反应温度为40℃左右。
[0079]
3、最适反应ph测定
[0080]
设定一系列反应ph(1.5-7.0)，配制不同ph值的缓冲液，用这些缓冲液稀释酶液及配制20mmol/l的对硝基酚-α-d-吡喃半乳糖(p-npg)作为反应底物。分别吸取各ph条件下配制好的p-npg 0.9ml于若干试管中，37℃下预热3min，摇匀后加入各ph值的酶液0.1ml，加10％碳酸钠溶液混匀结束反应并检测酶活，以最高酶活为100％，其他检测结果与之相比，即得到不同ph检测条件下的相对酶活。
[0081]
该酸性α-半乳糖苷酶的最适反应ph曲线如图4所示，结果表明，该酶的最适反应ph为4.0左右。
[0082]
4、贮存稳定性测定
[0083]
将该酸性α-半乳糖苷酶固体样品置于室温下贮存，按月度定时取样，按照α-半乳糖苷酶的检测方法，检测不同保存时间的样品酶活，以测定该酶在室温下贮存的稳定性能。
[0084]
该酸性α-半乳糖苷酶的稳定性测定结果见图5。检测结果表明：在室温条件下保存一年，该酸性α-半乳糖苷酶的剩余酶活仍可达到85％以上，这说明该酶的贮存稳定性能良好。
[0085]
5、各种离子对酸性α-半乳糖苷酶kag活力的影响
[0086]
分别配制含有1mm k
+
、mg
2+
、ca
2+
、fe
2+
、fe
3+
、zn
2+
、mn
2+
、co
2+
、ag
+
、cu
2+
的乙酸-乙酸钠缓冲液，与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置1h，以未处理的酶液为对照，检测结果如图6所示。
[0087]
结果表明，ca
2+
、zn
2+
、mg
2+
对酶活有一定的激活作用，fe
2+
、k
+
、mn
2+
对酶活影响不大，fe
3+
、co
2+
、ag
+
、cu
2+
则对酶活有一定程度的抑制作用。
[0088]
以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种酸性α-半乳糖苷酶kag，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:1所示。2.一种α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性α-半乳糖苷酶。3.根据权利要求2所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。4.包含权利要求2所述α-半乳糖苷酶基因的重组载体。5.包含权利要求2所α-半乳糖苷酶基因的重组菌株。6.一种制备权利要求1所述的酸性α-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)权利要求4所述的重组载体转化毕赤酵母x33，筛选获得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导酸性α-半乳糖苷酶kag进行表达；以及3)回收并纯化所表达的酸性α-半乳糖苷酶kag。7.权利要求1所述酸性α-半乳糖苷酶kag的应用。8.权利要求1所述酸性α-半乳糖苷酶kag作为饲料添加剂或食品用酶制剂的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性α-半乳糖苷酶KAG、及其编码基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的酸性α-半乳糖苷酶通过高密度液体发酵后能够达到较高的生产水平，可广泛应用于饲料、医药及食品等领域。品等领域。品等领域。


技术研发人员：罗长财 胡祥
受保护的技术使用者：江西科诺生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/7/18