一种川贝母的UPLC检测方法及其含量测定和鉴别方法与流程

一种川贝母的uplc检测方法及其含量测定和鉴别方法
技术领域
1.本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种川贝母的uplc检测方法及其含量测定和鉴别方法。


背景技术：

2.川贝母为百合科植物川贝母fritillaria cirrhosa d.don、暗紫贝母fritillaria unibracteata hsiao et k.c.hsia、甘肃贝母fritillaria przewalskii maxim.、梭砂贝母fritillaria delavayi franch.、太白贝母fritillaria taipaiensis p.y.li或瓦布贝母fritillaria unibracteata hsiao et k.c.hsia var.wabuensis(s.y.tang et s.c.yue)z.d.liu，s.wang et s.c.chen的干燥鳞茎，目前，川贝母按性状不同分别习称松贝、青贝和炉贝。其中，松贝，呈类圆锥形或近球形，高0.3-0.8cm，直径0.3-0.9cm；表面类白色；外层鳞叶2瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣，未抱部分呈新月形，习称“杯中抱月”；顶部闭合，内有类圆柱形、顶端稍尖的心芽和小鳞叶1-2枚；先端钝圆或稍尖，底部平，微凹入，中心有1灰褐色的鳞茎盘，偶有残厚须根。青贝，呈类扁球形，高0.4-1.4cm，直径0.4-1.6cm；外层鳞叶2瓣，大小相近，相对抱合，顶部开裂，内有心芽和小鳞叶2-3枚及细圆柱形的残茎。炉贝，呈长圆锥形，高0.7-2.5cm，直径0.5-2.5cm；表面类白色或浅棕黄色，有的具棕色斑点；外层鳞叶2瓣，大小相近，顶部开裂略尖，基部稍尖或较钝。
3.川贝母主产于四川、西藏、青海、甘肃等地，是著名的川产道地药材。川贝母味苦、甘，性微寒，归肺、心经，具有清热润肺、化痰止咳、散结消痈的功效，主要用于治疗肺热燥咳、干咳少痰、阴虚痨嗽、痰中带血、瘰疬、乳痈、肺痈等。生物碱类的西贝母碱具有镇咳，祛痰，解痉，抗菌，降压的作用，为川贝母中抗炎的主要活性成分，这与川贝母“止咳”的功效相一致。
4.现行中国药典以总生物碱含量作为川贝母含测指标，采用紫外分光光度法建立含量测定方法，该方法制样步骤复杂，灵敏度低，专属性不强。且收录的含川贝母制剂中有20个制剂未针对川贝母建立质控项目，缺少相关评价系统。目前已有大量文献针对贝母类药材建立特征图谱或含量测定方法，以期提高贝母类药材的质量水平。从内容来看，这些特征图谱或含量测定方法多侧重于生物碱类成分，仅少数开始关注川贝母中非生物碱类成分的测定。从技术水平来看，针对川贝母的质量研究多为hplc法，尤其是特征图谱方面，此类方法检测时间较长，灵敏度低，因此需要提高检测效率和灵敏度。
5.而现有技术中公开的uplc检测中，例如：在“uplc-elsd同时测定贝母类药材中6种生物碱的含量，车朋等”文献中，在该色谱条件下，想要获得分离度较好的色谱图，实现生物碱的检测，供试品需要采用三氯甲烷等毒性较大的有毒溶剂进行提取，且供试品制备时间较长。


技术实现要素：

6.因此，本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术中公开的川贝母的uplc检测
方法中存在供试品制备试剂毒性大、耗时长的问题；从而提供一种用毒性较低的溶剂进行提取，在较短的时间内依然能有效获得出峰更多、各峰之间分离度较好的特征图谱并实现西贝母碱含量测定的uplc检测方法。
7.本发明要解决的第二个问题是，可以采用本发明获得的特征图谱有效实现川贝母中炉贝的鉴别。
8.为了解决上述问题，本发明提供的技术方案如下：
9.一种川贝母的uplc检测方法，色谱条件为：
10.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；蒸发光检测器检测；以甲醇为流动相a，以0.02％二乙胺为流动相b，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：
[0011][0012]
所述色谱条件中，色谱柱的柱温为33℃～37℃，流速为0.23ml/min～0.27ml/min，理论板数按西贝母碱峰计算应不低于10000。
[0013]
还包括以下供试品溶液和西贝母碱对照品溶液的制备方法；
[0014]
所述供试品溶液的制备方法包括：取待测物，精密称定获得质量m1，加氨水浸润0.5-1h后，加入质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量m2，混匀，置55℃水浴中加热回流0.5h，放冷，再称定重量m3，用质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液补足失重；离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液体积l1，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至体积l2，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0015]
所述西贝母碱对照品溶液的制备方法包括：取西贝母碱对照品，精密称定，加溶剂配制而成；优选的，西贝母碱对照品溶液中每1ml含500μg的西贝母碱，溶剂为甲醇。
[0016]
所述供试品溶液的制备中，2g的待测物中加入20ml的氨水，m2重量称定前加入50ml二氯甲烷-甲醇混合溶液；
[0017]
和/或，l1与l2的体积比为25：2。
[0018]
还包括参照溶液的制备，具体方法为：取川贝母对照药材，精密称定获得质量m4，加氨水浸润0.5h后，加入质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量m5，混匀，置55℃水浴中加热回流0.5h，放冷，再称定重量m6，用质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液补足失重；离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液体积l3，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至体积l4，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0019]
所述参照溶液的制备中，2g的川贝母对照药材中加入20ml的氨水，m4重量称定前加入50ml二氯甲烷-甲醇混合溶液；
[0020]
和/或，l3与l4的体积比为25：2。
[0021]
一种川贝母的鉴别方法，包括采用上述的一种川贝母的uplc检测方法获取供试品和西贝母碱对照品的特征图谱，以西贝母碱对应峰为s峰，确认供试品的特征图谱中相对保
留时间为1.07
±
10％所在位置处是否存在特征峰，如果有特征峰，则为炉贝。
[0022]
一种川贝母的有效成分的含量检测方法，采用上述的一种川贝母的uplc检测方法对供试品溶液进行检测，并根据外标峰面积法获取供试品中西贝母碱的含量。
[0023]
所述有效成分还包括尿苷、鸟苷和腺苷，所述尿苷、鸟苷和腺苷的含量采用以下色谱条件进行hplc检测：
[0024]
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：
[0025][0026]
所述尿苷、鸟苷和腺苷的含量检测色谱条件中，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm；检测波长为260nm；色谱柱的柱温为25℃～30℃，流速为0.9ml/min～1.1ml/min，理论板数按尿苷峰计算应不低于5000；
[0027]
所述供试品溶液的制备方法为：
[0028]
取待测物，精密称定，加溶剂，密塞，称定重量，超声处理15-25分钟，取出，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0029]
所述尿苷、鸟苷和腺苷的对照品溶液的制备方法为：取对照品，精密称定，加溶剂配制而成；对照品溶液的浓度优选为每1ml各含50μg的溶液。
[0030]
优选的，溶剂为10％甲醇；和/或，每1g待测物添加10ml溶剂；和/或，超声功率为250w，频率40khz。
[0031]
本发明技术方案，具有如下优点：
[0032]
1.本发明提供的一种川贝母的uplc检测方法，通过色谱条件的优化，即使不采用毒性较大的溶剂三氯甲烷，且在显著缩短供试品制备时间的情况下，依然能有效实现特征图谱的构建以及西贝母碱含量测定，显著提高检测效率。
[0033]
2.由于贝母种类众多，《中国药典》规定的川贝母基原就多达六种，已有许多文献对贝母种类或川贝母的混伪品进行区分鉴别，但鲜有针对川贝母某一基原建立质控标准，为需要固定基原的川贝母制剂如配方颗粒质量标准的制定带来困难。利用本发明中的一种川贝母的uplc检测方法获取的特征图谱，即可有效实现川贝母中炉贝与其他基原如松贝、青贝等的区分，从而保证药材基原准确，药材质量可靠。
[0034]
3.本发明不仅仅能利用一种川贝母的uplc检测方法实现西贝母碱含量测定，本发明还公开了尿苷、鸟苷和腺苷这些非生物碱成分的含量测定方法，可以更全面地把控川贝母制剂物质基准的质量，提高川贝母整体质量控制的专属性。
附图说明
[0035]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0036]
图1是本发明中17批川贝母(梭砂贝母)标准汤剂冻干粉的特征图谱；
[0037]
图2是本发明中川贝母(梭砂贝母)标准汤剂冻干粉对照图谱；
[0038]
图3是本发明中17批川贝母(梭砂贝母)饮片的特征图谱；
[0039]
图4是本发明中川贝母(梭砂贝母)标准汤剂与对照药材比较的特征图谱；
[0040]
图5是本发明中西贝母碱的线性回归方程标准曲线图；
[0041]
图6是本发明实施例2中专属性考察时供试品、西贝母碱、阴性对照的色谱图；
[0042]
图7是本发明中川贝母药材不同基原色谱图；
[0043]
图8是本发明中尿苷的线性回归方程标准曲线图；
[0044]
图9是本发明中鸟苷的线性回归方程标准曲线图；
[0045]
图10是本发明中腺苷的线性回归方程标准曲线图；
[0046]
图11是本发明实施例5中专属性考察时对照品溶液与阴性对照溶液的对照色谱图。
具体实施方式
[0047]
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0048]
仪器：waters acquity uplc h-class超高效液相色谱仪(els detector检测器)；ml204t电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；ja1002电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；msa6.6s-0ce-dm电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；kq-300db数控超声波清洗(昆山市超声仪器有限公司)；dzkw-4电热恒温水浴锅(林茂科技(北京)有限公司)
[0049]
色谱柱：waters cortecs c18+(2.1
×
100mm，1.6μm)；waters acquitycsh(2.1
×
100mm，1.7μm)；agilent poroshell cs-c18(2.1
×
100mm，2.7μm)
[0050]
试剂：用于供试品制备考察的甲醇、氨水、二氯甲烷为分析纯，用于液相色谱仪的甲醇、二乙胺为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。
[0051]
试药：
[0052]
川贝母对照药材(批号：121757-202101，中国食品药品检定研究院)
[0053]
西贝母碱对照品(批号：110767-202111，中国食品药品检定研究院)
[0054]
川贝母(梭砂贝母)标准汤剂冻干粉：yp2022030301、yp2022030302、yp2022030303、yp2022030304、yp2022030305、yp2022030306、yp2022030307、yp2022030308、yp2022030310、yp2022030311、yp2022030312、yp2022030313、yp2022030314、yp2022030315、yp2022030316、yp2022030317、yp2022030318。
[0055]
实施例1
[0056]
一种川贝母的uplc检测方法，通过该检测方法可以有效获得川贝母标准汤剂的特征图谱以及西贝母碱的含量，具体获取过程如下：
[0057]
川贝母饮片标准汤剂的制备：取川贝母(梭砂贝母)饮片经前处理制成的粗粒。将
粗粒置于砂锅中，浸泡30分钟，一煎加入饮片量6倍水，武火煮沸后，文火煎煮30分钟，趁热用150目滤布过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量5倍水，武火煮沸后，文火煎煮20分钟，趁热用150目滤布过滤，迅速冷却，备用；合并两煎滤液，减压浓缩(65℃)，浓缩至料液比约为1:1，冷冻干燥，即得。
[0058]
色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm)；以甲醇为流动相a，以0.02％二乙胺为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为35℃。蒸发光检测器检测。理论板数按西贝母碱峰计算应不低于10000。
[0059]
表1梯度洗脱表
[0060][0061]
参照物溶液的制备：取西贝母碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含500μg的溶液，即得。
[0062]
供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置于100ml具塞锥形瓶中，加氨水20ml浸润0.5h后，加入二氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液50ml，称定重量，混匀，置55℃水浴中加热回流0.5h，放冷，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液补足失重。离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并分别转移至2ml量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0063]
参照溶液的制备：取川贝母对照药材2g，置于100ml具塞锥形瓶中，加氨水20ml浸润30分钟后，加入二氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液50ml，称定重量，混匀，置55℃水浴中加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用二氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液补足失重。离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液25ml，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至2ml量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
[0064]
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、0.5μl，供试品溶液4μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0065]
1、特征图谱获取
[0066]
本实施例中17批川贝母饮片获得的标准汤剂的特征图谱，使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》(2012版)以s1为参照图谱，按中位数计算，得出川贝母标准汤剂冻干粉对照图谱，并计算各批次川贝母标准汤剂与对照图谱的相似度，确定相似度的可接受范围。结合川贝母饮片的特征图谱，进行对照图谱进行共有峰的标识，以4号峰为参照峰s，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，并明确各共有峰的相对保留时间的可接受度。见表2-4、图1-4。
[0067]
表2川贝母标准汤剂冻干粉样品列表
[0068][0069]
表3 17批川贝母标准汤剂特征图谱相似度计算结果
[0070][0071]
表4 17批川贝母标准汤剂冻干粉保留时间和相对保留时间
[0072]
[0073][0074]
结合17批川贝母标煎冻干粉的特征图谱，选用6个特征峰作为共有峰，如图1、图2所示。经用对照品定位，得知4号峰为西贝母碱。选择4号峰作为参照峰，标号s。由图3、图4可知，川贝母6个特征峰从药材到饮片再到标准汤剂实现了稳定的传递，为相关制剂从原料到中间体，到成品的质量控制提供参考。
[0075]
由表3可知，17批川贝母标准汤剂液相图谱与对照特征图谱的相似度为0.950～1.000，均大于0.900。由表4可知，6个特征峰相对保留时间差异较小，均在
±
10％范围内。因此选择17批川贝母标准汤剂相对保留时间的平均值作为规定值；规定值为：0.56(峰1)、0.64(峰2)、0.68(峰3)、1.07(峰5)、1.66(峰6)，允许误差：
±
10％。
[0076]
2、西贝母碱的含量测定
[0077]
取西贝母碱对照品10.518mg，精密称定，于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成每1ml含西贝母碱1.052mg的溶液，作为对照品母液
⑦
。分别精密吸取对照品母液1ml、1ml、1ml、1ml、2ml、1ml，分别置于50ml、20ml、10ml、5ml、5ml、2ml容量瓶中，加10％甲醇稀释至刻度，分别作为对照品溶液
①
、
②
、
③
、
④
、
⑤
、
⑥
。取上述各浓度对照品溶液
①
～
⑦
滤过，分别精密吸取续滤液4μl，注入超高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定西贝母碱色谱峰峰面积，分别以色谱峰的ln峰面积为纵坐标，ln浓度为横坐标，观察是否呈线性，以最小二乘法进行线性回归。
[0078]
最终获得西贝母碱的线性回归方程为y＝1.5912x+6.9238，r2＝0.9995，其线性范围为0.0210-1.0518mg/ml，结果见表5和图5。
[0079]
表5西贝母碱标准曲线
[0080][0081]
对上述17批川贝母标准汤剂采用上述色谱条件进行检测获得西贝母碱所在峰的峰面积，将峰面积带入到西贝母碱的线性回归方程中获得17批川贝母标准汤剂冻干粉西贝母碱含量测定结果，如下表6所示。
[0082]
表6 17批川贝母标准汤剂冻干粉西贝母碱含量
[0083][0084][0085]
根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，以17批川贝母饮片为样本进行标准汤剂的研究的最终结果：
[0086]
川贝母标准汤剂西贝母碱含量范围为0.10mg/g～0.80mg/g；供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱峰中的6个特征峰保留时间相对应，以西贝母碱参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.56(峰1)、0.64(峰2)、0.68(峰3)、1.00(峰4s)、1.07(峰5)、
1.66(峰6)。
[0087]
实施例2
[0088]
实施例1中色谱条件的方法学验证，具体如下：
[0089]
2.1精密度
[0090]
2.1.1重复性
[0091]
取川贝母标准汤剂冻干粉(批号：yp2022030316)6份，按实施例1中色谱条件进行测定，获得其特征图谱，以4号峰为参照峰s，计算其相对保留时间以及西贝母碱含量，并计算rsd值。计算结果如表7和表8所示。
[0092]
表7川贝母重复性考察保留时间及相对保留时间
[0093][0094]
表8川贝母重复性考察西贝母碱含量
[0095][0096][0097]
重复性实验结果显示：六个重复性实验样品的6个特征峰的相对保留时间rsd在0.1％～0.6％范围内，表明该特征图谱的重复性较好；西贝母碱含量均值为0.42mg/g，rsd值为2.5％，符合方法学验证重复性要求。
[0098]
2.1.2、中间精密度
[0099]
取川贝母标准汤剂冻干粉(yp2022030316)，不同分析人员在不同时间利用agilent超高效液相色谱仪(elsd)进行中间精密度试验，按实施例1中色谱条件测定，以第4号峰为参照峰，计算其相对保留时间以及西贝母碱含量，计算rsd值，结果见表9和表10。
[0100]
表9川贝母中间精密度考察保留时间及相对保留时间
[0101][0102]
表10川贝母中间精密度考察西贝母碱含量
[0103][0104]
中间精密度结果显示：不同分析人员在不同时间利用另一台超高效液相色谱仪得到的6个特征峰的相对保留时间rsd值在0.3％～0.8％范围内，与重复性相对保留时间rsd值在0.7％～1.5％范围内，表明本方法对不同仪器的有一定的耐受性；西贝母碱含量均值为0.40mg/g，rsd值为2.0％，与重复性西贝母碱含量rsd为3.3％，符合方法学验证精密度要求。
[0105]
2.2系统适应性
[0106]
在实施例1中色谱条件下，进行系统适应性试验，其结果见表11。
[0107]
表11西贝母碱系统适用性试验结果
[0108][0109]
结果显示，西贝母碱峰面积rsd值为2.3％，拖尾因子均值为1.0，理论板数为均值为38698，系统适用性符合分析要求。
[0110]
2.3专属性
[0111]
取供试品溶液、西贝母碱对照品溶液、阴性对照溶液按实施例1的方法获得其色谱图，阴性对照溶液的获取过程为：不加样品后按实施例1中供试品溶液制备方法即得阴性对照溶液，结果见图6，通过图6可知，本方法专属性良好，阴性对照无干扰。
[0112]
2.4准确度
[0113]
准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。取川贝母标准汤剂冻干粉(批号：yp2022030316)样品，按对照品量与所取供试品中待测定成分量之比为1:1分别加入对照品进行加样(n＝6)，制备供试品溶液，并按照西贝母碱含量测定中色谱条件进行液相分析，试验结果取平均值，按照下式计算对照品的回收率，结果见表12。
[0114][0115]
表12回收率结果
[0116][0117]
小结：回收率试验所测得的西贝母碱回收率范围为92.7％～107.1％，平均回收率102％，rsd值为4.9％，符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
[0118]
2.5耐用性
[0119]
2.5.1稳定性
[0120]
取川贝母标准汤剂冻干粉(yp2022030316)，按实施例1方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24h进行测定，获得其特征图谱，以第4号峰为参照峰，计算其相对保留时间和西贝母碱的峰面积变化情况，计算rsd值，结果见表13和表14。
[0121]
表13川贝母耐用性考察保留时间及相对保留时间
[0122][0123]
表14川贝母耐用性考察峰面积
[0124][0125]
稳定性结果显示：经过考察24小时溶液稳定性，6个特征峰的相对保留时间均规定值
±
10％范围内，西贝母碱峰的峰面积rsd值为0.9％，符合系统分析的要求。
[0126]
2.5.2不同柱温
[0127]
取川贝母标准汤剂冻干粉(批号：yp2022030316)，按实施例1供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同柱温(33℃、35℃及37℃)按实施例1方法进行测定，获得其特征图谱，以第4号峰为参照峰，计算其相对保留时间和西贝母碱含量，计算rsd值，结果如表15和表16。
[0128]
表15川贝母不同柱温考察保留时间及相对保留时间
[0129][0130][0131]
表16川贝母不同柱温考察西贝母碱含量
[0132][0133]
不同柱温考察结果显示：分别考察不同柱温(33℃、35℃及37℃)，样品中6个特征峰的相对保留时间均在规定值
±
10％范围内，西贝母碱的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；不同柱温测得西贝母碱含量rsd值为1.4％，表明该方法对柱温耐用性较好。
[0134]
2.5.3不同流速
[0135]
取川贝母冻干粉(批号：yp2022030316)，按实施例1供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同流速(0.23ml/min、0.25ml/min及0.27ml/min)按实施例1方法进行测定，获得其特征图谱，以第4号峰为参照峰，计算其相对保留时间以及西贝母碱含量，计
算rsd值。结果如表17和表18。
[0136]
表17川贝母不同流速考察保留时间及相对保留时间
[0137][0138]
表18川贝母不同流速考察西贝母碱含量
[0139][0140][0141]
不同流速考察结果显示：分别考察不同流速(0.23ml/min、0.25ml/min及0.27ml/min)，样品6个特征峰的相对保留时间均在规定值
±
10％范围内，西贝母碱峰的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；西贝母碱含量rsd值为2.4％，表明本方法对流速具有较好的耐用性。
[0142]
2.5.4不同品牌型号色谱柱
[0143]
取川贝母标煎冻干粉(批号：yp2022030316)按实施例1方法制备供试品溶液，采用不同型号色谱柱按实施例1方法进行测定，获得其特征图谱，以4号峰为参照峰，计算其相对保留时间和西贝母碱含量，计算rsd值，结果如表19和表20所示。
[0144]
色谱柱1：waters cortecs c18+(2.1
×
100mm，1.6μm)
[0145]
色谱柱2：waters acquitycsh(2.1
×
100mm，1.7μm)
[0146]
色谱柱3：agilent poroshell cs-c18(2.1
×
100mm，2.7μm)
[0147]
表19川贝母不同色谱柱考察保留时间及相对保留时间
[0148]
[0149]
表20川贝母不同色谱柱考察西贝母碱含量
[0150][0151]
不同色谱柱考察结果显示：分别考察不同色谱柱waters cortecs c18(2.1
×
100mm，1.6μm)、waters acquitychs(2.1
×
100mm，1.7μm)及agilent poroshell cs-c18(2.1
×
100mm，2.7μm)，样品中6个特征峰的相对保留时间基本都在规定值
±
10％范围内；西贝母碱峰的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；采用不同色谱柱测得西贝母碱的含量rsd值为6.2％，表明该方法对不同色谱柱有较好的耐用性。
[0152]
实施例3
[0153]
一种川贝母的鉴别方法，包括采用实施例1中的方法分别获取川贝母(炉贝，批号：2022030316，产地：四川省广元市青川县)、川贝母(松贝，批号：2022030319，产地：四川省甘孜藏族自治州甘孜县)、川贝母(青贝，批号：2022030320，产地：四川省甘孜藏族自治州甘孜县)的特征图谱。检测结果如图7所示。
[0154]
由图7可知，松贝、青贝和炉贝除色谱峰5外，有5个共有特征峰。其中松贝和青贝在峰5位置处未检测到色谱峰，炉贝在峰5位置能够检测到色谱峰。因此本研究所用的特征图谱方法可作为川贝母中炉贝与松贝、青贝的鉴别手段，通过该特征峰的定性能更好地控制川贝母(梭砂贝母)的质量。
[0155]
实施例4
[0156]
一种川贝母的有效成分的含量检测方法，本实施例中不仅仅采用实施例1中的方法实现待测物中西贝母碱的含量的测定，还采用下述方法对尿苷、鸟苷和腺苷进行检测。尿苷、鸟苷和腺苷的具体检测方法如下：
[0157]
色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm)；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按下表21规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为25℃；检测波长为260nm。理论板数按尿苷峰计算应不低于5000。
[0158]
表21梯度洗脱表
[0159][0160]
对照品溶液的制备取尿苷对照品、鸟苷对照品和腺苷对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含50μg的溶液。
[0161]
供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇10ml，密塞，
称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0162]
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0163]
取尿苷、鸟苷及腺苷适量，精密称定，于50ml容量瓶中，加10％甲醇定容至刻度线，制成每1ml分别含尿苷0.2600mg、鸟苷0.1145mg及腺苷0.2310mg的溶液，作为混标对照品母液
⑤
。分别精密吸取混合对照品母液1ml、2ml、2ml、5ml，分别置于25ml、25ml、10ml、10ml容量瓶中，加10％甲醇稀释至刻度，分别作为混合对照品溶液
①
、
②
、
③
、
④
。取上述各浓度混合对照品溶液
①
～
⑤
滤过，精密吸取续滤液20μl，注入高效液相色谱仪，按上述方法测定尿苷、鸟苷及腺苷色谱峰峰面积，分别以色谱峰的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，观察是否呈线性，以最小二乘法进行线性回归。
[0164]
其中，尿苷的线性回归方程为y＝47976779.9863x+19488.2166，r2＝1.0000，其线性范围为0.0104-0.2600mg/ml；鸟苷的线性回归方程为y＝49780771.2846-798.0568，r2＝1.0000，其线性范围为0.0046-0.1145mg/ml；腺苷的线性回归方程为y＝47976779.9863x+19488.2166，r2＝1.0000，其线性范围为0.0104-0.2600mg/ml结果见表22、图8-图10。
[0165]
表22标准曲线
[0166][0167]
对实施例1中的17批川贝母标准汤剂采用上述色谱条件进行检测获得尿苷、鸟苷和腺苷所在峰的峰面积，将峰面积带入到尿苷、鸟苷和腺苷的线性回归方程中获得17批川贝母标准汤剂冻干粉中尿苷、鸟苷和腺苷的含量测定结果，如下表23所示。
[0168]
表23 17批川贝母标准汤剂冻干粉中尿苷、鸟苷和腺苷含量测定结果
[0169]
[0170][0171]
通过检测得出，川贝母标准汤剂中尿苷含量为0.55mg/g～0.80mg/g；鸟苷含量为0.27mg/g～0.41mg/g；腺苷含量为0.54mg/g～0.77mg/g。
[0172]
实施例5
[0173]
实施例4中尿苷、鸟苷和腺苷的含量测定的色谱条件的方法学验证，具体如下：
[0174]
5.1系统适应性
[0175]
在实施例4中尿苷、鸟苷和腺苷的含量测定的色谱条件条件下，进行系统适应性试验，其结果见表24-26。
[0176]
表24尿苷系统适用性试验结果
[0177][0178]
表25鸟苷系统适用性试验结果
[0179][0180]
表26腺苷系统适用性试验结果
[0181][0182]
结果显示，尿苷峰面积rsd值为0.1％，分离度均值为20.1，理论板数为均值为12880；鸟苷峰面积rsd值为0.1％，分离度均值为24.6，理论板数为均值为35922；腺苷峰面积rsd值为0.0％，分离度均值为20.4，理论板数为均值为187794，系统适用性符合分析要求。
[0183]
5.2专属性考察
[0184]
取供试品溶液、尿苷、鸟苷、腺苷混合对照品溶液、阴性对照溶液按实施例4方法获得其色谱图，其结果见图11，可见本方法专属性良好，阴性对照无干扰。
[0185]
5.3准确度
[0186]
准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。取川贝母标准汤剂冻干粉(批号：yp2022030316)样品，按对照品量与所取供试品中待测定成分量之比为0.5:1，1:1，1:1.5分别加入对照品进行加样(n＝9)，制备供试品溶
液，并按照尿苷、鸟苷及腺苷含量测定中色谱条件进行液相分析，试验结果取平均值，按照下式计算对照品的回收率，结果见表27-29。
[0187][0188]
表27尿苷回收率结果
[0189][0190]
表28鸟苷回收率结果
[0191][0192]
表29腺苷回收率结果
[0193][0194]
小结：回收率试验所测得的尿苷回收率范围为94.28％～96.58％，平均回收率为95.5％，rsd值为0.8％；鸟苷回收率范围为95.35％～102.38％，平均回收率为98.0％，rsd值为2.9％；腺苷回收率范围为91.61％～95.72％，平均回收率为94.6％，rsd值为1.3％符合方法学验证回收率要求，表明利用该方法测得的结果准确。
[0195]
5.4精密度
[0196]
5.4.1重复性
[0197]
取川贝母冻干粉(批号：yp2022030316)6份，按实施例4方法进行样品处理，分别进样，检测，结果见表30-32。
[0198]
表30川贝母标准汤剂冻干粉尿苷重复性试验结果
[0199][0200]
表31川贝母标准汤剂冻干粉鸟苷重复性试验结果
[0201][0202]
表32川贝母标准汤剂冻干粉腺苷重复性试验结果
[0203][0204]
小结：重复性试验所测得川贝母冻干粉中尿苷含量均值为0.50mg/g，rsd值为
[0205]
4.0％；鸟苷含量均值为0.23mg/g，rsd值为0.6％；腺苷含量均值为0.49mg/g，rsd值为0.6％，均符合方法学验证重复性要求。
[0206]
5.4.2中间精密度
[0207]
不同分析人员在不同时间利用另一台waters高效液相色谱仪进行中间精密度试验。取川贝母冻干粉(批号：yp2022030316)6份，按实施例4方法进行测定，结果见表33-35。
[0208]
表33川贝母冻干粉尿苷中间精密度
[0209][0210][0211]
表34川贝母冻干粉鸟苷中间精密度
[0212][0213]
表35川贝母冻干粉腺苷中间精密度
[0214][0215]
小结：中间精密度试验所测得川贝母标准汤剂冻干粉中的川贝母冻干粉中尿苷含量均值为0.49mg/g，rsd值为0.4％，与重复性试验检测结果的rsd为3.1％；鸟苷含量均值为0.23mg/g，rsd值为0.6％，与重复性试验检测结果的rsd为0.6％；腺苷含量均值为0.49mg/g，rsd值为0.4％，与重复性试验检测结果的rsd为0.6％，符合方法学验证精密度的要求。
[0216]
根据精密度、准确度和线性实验结果及多批次川贝母标准汤剂冻干粉中尿苷、鸟苷和腺苷含量的结果可知，尿苷含量范围为0.0104～0.2600mg/ml，鸟苷含量范围为0.0046～0.1145mg/ml，腺苷含量范围为0.0092～0.2310mg/ml。
[0217]
5.5耐用性考察
[0218]
5.5.1稳定性考察
[0219]
取川贝母标煎冻干粉(批号：yp2022030316)，按实施例4中的色谱方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h按实施例4中的色谱方法进行测定，记录尿苷、鸟苷及腺苷的峰面积变化情况，结果见表36-38。
[0220]
表36尿苷稳定性考察结果表
[0221][0222][0223]
表37鸟苷稳定性考察结果表
[0224][0225]
表38腺苷稳定性考察结果表
[0226][0227]
小结：由以上数据可知，48小时内尿苷峰的峰面积rsd值为1.4％，鸟苷的峰面积rsd值为1.7％，腺苷的峰面积rsd值为0.2％，符合系统分析的要求。
[0228]
5.5.2不同柱温
[0229]
取川贝母标煎冻干粉(批号：yp2022030316)，按实施例4供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，分别于不同柱温(25℃、27℃及30℃)按实施例4中的色谱方法进行测定，考察实验方法对于柱温的耐用性。结果如表39-41所示。
[0230]
表39不同柱温尿苷含量测定
[0231][0232]
表40不同柱温鸟苷含量测定
[0233][0234]
表41不同柱温腺苷含量测定
[0235][0236]
小结：不同柱温下获得的色谱图，尿苷的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；不同柱温测得尿苷含量rsd值为1.9％，鸟苷含量rsd值为1.7％，腺苷的含量rsd值为0.4％，表明该方法对柱温耐用性较好。
[0237]
5.5.3不同流速
[0238]
取川贝母标煎冻干粉(批号：yp2022030316)，按实施例4供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液，分别采用不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min及1.1ml/min)按实施例4中的色谱方法进行测定，考察实验方法对于流速的耐用性。结果如表42-44。
[0239]
表42不同流速尿苷含量测定
[0240][0241]
表43不同流速鸟苷含量测定
[0242][0243]
表44不同流速腺苷含量测定
[0244][0245]
小结：采用不同流速获得的色谱图，尿苷峰的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；尿苷含量rsd值为0.9％，鸟苷含量rsd值为1.1％，腺苷的含量rsd值为0.4％，表明该方法对流速耐用性较好。
[0246]
5.5.4不同色谱柱
[0247]
取川贝母标煎冻干粉(yp2022030316)按实施例4中的色谱方法制备供试品溶液，采用不同型号色谱柱按实施例4中的色谱方法进行测定，考察实验方法对于不同色谱柱的耐用性。结果如表45-47所示。
[0248]
色谱柱1：agilent zorbax eclipse plus c18(4.6
×
50mm，5.0μm)
[0249]
色谱柱2：waters symmetry(4.6
×
250mm，5.0μm)
[0250]
色谱柱3：agilent zorbax sb-c18(4.6
×
250mm，5.0μm)
[0251]
表45不同色谱柱尿苷含量测定
[0252][0253]
表46不同色谱柱鸟苷含量测定
[0254][0255]
表47不同色谱柱腺苷含量测定
[0256][0257]
小结：采用不同色谱柱获得的色谱图，尿苷峰的理论塔板数、拖尾因子、分离度均符合系统适用性要求；采用不同色谱柱测得尿苷的含量rsd值为4.6％，鸟苷的含量rsd值为1.4％，腺苷的含量rsd值为3.3％，表明该方法对不同色谱柱有较好的耐用性。
[0258]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种川贝母的uplc检测方法，其特征在于，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；蒸发光检测器检测；以甲醇为流动相a，以0.02％二乙胺为流动相b，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为33℃～37℃，流速为0.23ml/min～0.27ml/min，理论板数按西贝母碱峰计算应不低于10000。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，还包括以下的供试品溶液和西贝母碱对照品溶液的制备方法；所述供试品溶液的制备方法包括：取待测物，精密称定获得质量m1，加氨水浸润0.5-1h后，加入质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量m2，混匀，置55℃水浴中加热回流0.5h，放冷，再称定重量m3，用质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液补足失重；离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液体积l1，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至体积l2，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述西贝母碱对照品溶液的制备方法包括：取西贝母碱对照品，精密称定，加溶剂配制而成。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备中，2g的待测物中加入20ml的氨水，m2重量称定前加入50ml二氯甲烷-甲醇混合溶液；和/或，l1与l2的体积比为25：2。5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，还包括参照溶液的制备，具体方法为：取川贝母对照药材，精密称定获得质量m4，加氨水浸润0.5h后，加入质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液，称定重量m5，混匀，置55℃水浴中加热回流0.5h，放冷，再称定重量m6，用质量比为4：1的二氯甲烷-甲醇混合溶液补足失重；离心，弃去上层，滤过，精密量取滤液体积l3，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至体积l4，摇匀，滤过，取续滤液，即得。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述参照溶液的制备中，2g的川贝母对照药材中加入20ml的氨水，m4重量称定前加入50ml二氯甲烷-甲醇混合溶液；和/或，l3与l4的体积比为25：2。7.一种川贝母的鉴别方法，其特征在于，包括采用权利要求1-6任一项所述的一种川贝母的uplc检测方法获取供试品和西贝母碱对照品的特征图谱，以西贝母碱对应峰为s峰，确认供试品的特征图谱中相对保留时间为1.07
±
10％所在位置处是否存在特征峰，如果有特征峰，则为炉贝。8.一种川贝母的有效成分的含量检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的一种川贝母的uplc检测方法对供试品溶液进行检测，并根据外标峰面积法获取供试品中
西贝母碱的含量。9.根据权利要求8所述的含量检测方法，其特征在于，所述有效成分还包括尿苷、鸟苷和腺苷，所述尿苷、鸟苷和腺苷的含量采用以下色谱条件进行hplc检测：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；检测波长为260nm；以甲醇为流动相a，以水为流动相b，按以下梯度洗脱程序进行洗脱：10.根据权利要求9所述的含量检测方法，其特征在于，所述尿苷、鸟苷和腺苷的含量检测色谱条件中，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm，色谱柱的柱温为25℃～30℃，流速为0.9ml/min～1.1ml/min，理论板数按尿苷峰计算应不低于5000；所述供试品溶液的制备方法为：取待测物，精密称定，加溶剂，密塞，称定重量，超声处理15-25分钟，取出，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述尿苷、鸟苷和腺苷的对照品溶液的制备方法为：取对照品，精密称定，加溶剂配制而成；优选的，溶剂为10％甲醇；和/或，每1g待测物添加10ml溶剂；和/或，超声功率为250w，频率40khz。

技术总结
本发明提供了一种川贝母的UPLC检测方法及其含量测定和鉴别方法。其中，一种川贝母的UPLC检测方法，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；蒸发光检测器检测；以甲醇为流动相A，以0.02％二乙胺为流动相B，按正文表1的梯度洗脱程序进行洗脱。本发明提供了一种使用毒性较低的溶剂进行提取，在较短的时间内依然能有效获得出峰更多、各峰之间分离度较好的特征图谱并实现西贝母碱含量测定的UPLC检测方法；同时，还可以采用本发明获得的特征图谱有效实现川贝母中炉贝的鉴别，有效实现川贝母中炉贝与其他基原如松贝、青贝等的区分，从而保证药材基原准确，药材质量可靠。药材质量可靠。药材质量可靠。


技术研发人员：张志强 冯京 刘天祎 赵胜达 张思琦 程立伟 周永康 董晨虹
受保护的技术使用者：北京康仁堂药业有限公司
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/7/18