一种生物合成普伦斯特中间体的方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种普伦斯特中间体的生物合成法。


背景技术：

2.普仑斯特是日本小野药业株式会社首创的世界上第一个白三烯受体拮抗剂，该药物在1995年于日本上市，随后1996年在欧洲和美国注册，其临床主要用作抗哮喘及抗过敏药，是治疗哮喘的有效药物。由于普仑斯特具有高效、低毒、左右范围广、不良反应少等诸多优点，从其上市开始就迅速占领了抗哮喘药市场，成为目前国际市场上最受关注的焦点，具有非常广阔的市场前景。其中3-氨基-2-羟基苯乙酮(3ahap)是合成普仑斯特的关键药物中间体，在新药研究方面有很大的应用价值。
3.现有技术下，3-氨基-2-羟基苯乙酮可以选择对氯苯酚为原料通过酯化、fries重排、硝化、还原反应的四步法反应获得。该途径的第二步，即在路易斯或布朗斯特酸的催化下，将酚酯重排为邻或对乙酰基苯酚。然而，由于有机溶剂的使用，如氯仿和二氯甲烷等，使得该步骤具有极高的环境污染风险。同时，反应系统中使用的催化剂，如alcl3、bf3和ticl4，可能会释放有毒气体，对环境产生极大危害。此外，该方法的制备过程中涉及到硝化反应及催化加氢反应，存在较大生产及安全隐患。其中，硝化反应速度快，放热量大，且硝化试剂具有强腐蚀性与强氧化性，与有机物接触能够引起燃烧或爆炸；催化加氢反应在工业规模的生产中十分危险，具有高燃爆危险特性，而传统搅拌工艺无法保证气-液-固三相间的混合交换，使得加氢反应通常在高温高压下进行，反应时间长、能耗高、催化剂回收套用效率低。


技术实现要素：

4.针对现有技术合成3-氨基-2-羟基苯乙酮存在的污染问题以及安全问题，本发明的目的在于，提供一种温和有效、绿色安全、成本低廉的3-氨基-2-羟基苯乙酮合成方法。
5.本发明的第一方面，提供了一种生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的方法，所述方法为：以硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh为催化剂并构成酶混合系统，以葡萄糖和间硝基苯乙酮3nap为底物，构建反应体系，合成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap；所述酶混合系统中硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比为(1～4)：(1～8)：(1～32)。
6.具体地，所述方法的反应过程为：硝基苯还原酶nbza催化间硝基苯乙酮3nap生成3-羟基氨基乙酰苯3haap；羟胺苯变异酶haba催化3-羟基氨基乙酰苯3haap生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap；葡萄糖脱氢酶gdh催化葡萄糖生成nadph，为反应提供能量。
[0007][0008]
在上述反应过程中，葡萄糖脱氢酶gdh的引入为该合成路线提供了必要的nadph，为反应提供能量，克服了生物合成途径中额外加入nadph，消耗纯净nadph，生产成本昂贵的问题。
[0009]
所述反应体系中底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为2～10g/l，葡萄糖的质量分数为1～2％。
[0010]
进一步地，所述反应体系的溶剂为50mm、ph＝8的磷酸盐缓冲液，反应温度为30℃，反应时间为5～6小时。
[0011]
进一步地，在30℃，ph＝8的反应条件下，在所述50ml反应体系中，酶混合系统中硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比为(1～4)：(1～8)：(1～32)；底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为2～10g/l，使其在反应体系中处于过饱和状态；在含有1％葡萄糖的50mm磷酸盐缓冲液中进行催化反应，持续时间为5小时。反应过程中，nadph的浓度维持在1.72～3mm/l。反应结束后，通过高效液相色谱法测定反应产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度。
[0012]
具体地，所述硝基苯还原酶nbza以硝基苯还原酶nbza基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述硝基苯还原酶nbza基因工程菌是核苷酸序列seq id no.1所示的硝基苯还原酶nbza基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；
[0013]
所述羟胺苯变异酶haba以羟胺苯变异酶haba基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述羟胺苯变异酶haba基因工程菌是核苷酸序列seq id no.2所示的羟胺苯变异酶haba基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；
[0014]
所述葡萄糖脱氢酶gdh以葡萄糖脱氢酶gdh基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述葡萄糖脱氢酶gdh基因工程菌是核苷酸序列seq id no.3所示的葡萄糖脱氢酶gdh基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到。
[0015]
进一步地，所述湿菌体按如下方法获得：将基因工程菌接入含卡那霉素的lb培养基中，35～37℃培养至od600达到0.8，向发酵液中加入终浓度0.5～1mm的诱导剂iptg，于28～30℃诱导培养，将获得的发酵液离心，收集菌体沉淀，即得所述湿菌体。
[0016]
本发明的第二方面，提供了一种核糖体结合位点rbs优化后的羟胺苯变异酶haba基因，通过调整核糖体结合位点，对羟胺苯变异酶haba酶的表达进行了优化，大幅度提高了羟胺苯变异酶haba酶的翻译速率及表达量，有利于促进3-氨基-2-羟基苯乙酮的转化率。
[0017]
具体地，对所述羟胺苯变异酶haba核苷酸序列seq id no.2中的rbs序列seq id no.7利用rbs calculator 2.0进行优化，优化后的rbs序列为seq id no.8～12中的任意一
种；将所述优化后的rbs序列通过对应的引物seq id no.13～22置换至所述羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中；得到如核苷酸序列seq id no.23～27所示的含有优化后rbs序列的羟胺苯变异酶haba基因。将得到的含有优化后rbs序列的羟胺苯变异酶haba基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到羟胺苯变异酶haba基因工程菌，发酵培养后将湿菌体破碎，提取羟胺苯变异酶haba，并以粗酶液形式加入混合酶系统，参与3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap体外酶催化反应。
[0018]
本发明的第三方面，提供了硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用。
[0019]
具体地，一种硝基苯还原酶nbza在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，所述硝基苯还原酶nbza的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0020]
具体地，一种羟胺苯变异酶haba在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述羟胺苯变异酶haba的氨基酸序列如seq id no.5所示。
[0021]
具体地，一种葡萄糖脱氢酶gdh在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶gdh的氨基酸序列如seq id no.6所示。
[0022]
本发明的有益效果在于：
[0023]
1.本发明利用葡萄糖脱氢酶gdh催化葡萄糖为反应途径提供所需消耗的nadph，不用向反应体系中额外加入纯净nadph，降低了成产成本。
[0024]
2.本发明利用硝基苯还原酶nbza和羟胺苯变异酶haba催化间硝基苯乙酮3nap生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap。相较于现有技术存在的安全问题以及污染问题，本发明提供的生物合成途径温和有效、绿色安全。
[0025]
3.本发明通过rbs序列优化，对羟胺苯变异酶haba的核糖体结合位点进行了调整，大幅度提高了羟胺苯变异酶haba的翻译速率及表达量，从而进一步提高3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的转化率，使得3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的滴度从75mg/l提高至580mg/l，降低了生产成本，有利于工业化生产。
[0026]
对序列表的描述：
[0027]
seq id no.1为来源于pseudomonas oleovorans的硝基苯还原酶nbza的核苷酸序列。
[0028]
seq id no.2为来源于pseudomonas oleovorans的羟胺苯变异酶haba的核苷酸序列。
[0029]
seq id no.3为来源于exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脱氢酶gdh的核苷酸序列。
[0030]
seq id no.4为来源于pseudomonas oleovorans的硝基苯还原酶nbza的氨基酸序列。
[0031]
seq id no.5为来源于pseudomonas oleovorans的羟胺苯变异酶haba的氨基酸序列。
[0032]
seq id no.6为来源于exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脱氢酶gdh的氨基酸序列。
[0033]
seq id no.7为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中的rbs序列。
[0034]
seq id no.8为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中经优化后的rbs序列。
[0035]
seq id no.9为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中优化后的rbs序列。
[0036]
seq id no.10为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中优化后的rbs序列。
[0037]
seq id no.11为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中优化后的rbs序列。
[0038]
seq id no.12为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中优化后的rbs序列。
[0039]
seq id no.13为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.8所需的正向引物。
[0040]
seq id no.14为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.8所需的反向引物。
[0041]
seq id no.15为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.9所需的正向引物。
[0042]
seq id no.16为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.9所需的反向引物。
[0043]
seq id no.17为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.10所需的正向引物。
[0044]
seq id no.18为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.10所需的反向引物。
[0045]
seq id no.19为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.11所需的正向引物。
[0046]
seq id no.20为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.11所需的反向引物。
[0047]
seq id no.21为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.12所需的正向引物。
[0048]
seq id no.22为羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中置换优化后的rbs序列seq id no.12所需的反向引物。
[0049]
seq id no.23为含有优化后rbs序列seq id no.201的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列。
[0050]
seq id no.24为含有优化后rbs序列seq id no.202的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列。
[0051]
seq id no.25为含有优化后rbs序列seq id no.203的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列。
[0052]
seq id no.26为含有优化后rbs序列seq id no.204的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列。
[0053]
seq id no.27为含有优化后rbs序列seq id no.205的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列。
具体实施方式
[0054]
以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背
离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0055]
实施例中使用的质粒提取试剂盒、dna纯化回收试剂盒购自杭州擎科梓熙生物技术有限公司；一步克隆试剂盒购自诺唯赞有限公司；e.coli bl21(de3)、质粒pcdf-duet和全基因合成等由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；dna标记、低分子量标准蛋白、蛋白预制胶购自北京genstar有限公司；clonexpress ii onestep cloning kit无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；pfu dna聚合酶和dpni内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
[0056]
下游催化工艺所用试剂间硝基苯乙酮和3-氨基-2-羟基苯乙酮购自阿拉丁试剂(中国上海)，其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
[0057]
下列实施例通过高效液相色谱(hplc)检测反应的进行以及产物的检测，并对产物进行分析。hplc分析方法为：高效液相色谱法在alltima苯基柱(5μm；250
×
4.6mm；alltech，deerfield，ill.)上进行，波长为235nm。流动相是25％的乙腈和75％的13.5mm的三氟乙酸，流速为1.0ml min-1
。
[0058]
实施例1：基因工程菌的制备以及酶的生产纯化
[0059]
将来源于pseudomonas oleovorans的野生型硝基苯还原酶nbza(sequence id:q6dlr9.1，核苷酸序列为seq id no.1所示，氨基酸序列为seq id no.4所示)的基因序列进行全基因合成后，插入表达质粒pet-28a，得到pet-28a-nbza。测序验证无误后将pet-28a-nbza转入表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)中用于后续酶的表达。
[0060]
将来源于pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变异酶haba,(sequence id:o52214.1，核苷酸序列为seq id no.2所示，氨基酸序列为seq id no.5所示)的基因序列进行全基因合成后，插入表达质粒pet-28a，得到pet-28a-haba。测序验证无误后将pet-28a-haba转入表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)中用于后续酶的表达。
[0061]
将来源于exiguobacterium sibiricum的野生型葡萄糖脱氢酶gdh(sequence id:aiz68241.1，核苷酸序列为seq id no.3所示，氨基酸序列为seq id no.6所示)的基因序列进行全基因合成后，插入表达质粒pet-duet，得到pet-duet-gdh。测序验证无误后将pet-duet-gdh转入表达宿主大肠杆菌e.coli bl21(de3)中用于后续酶的表达。
[0062]
将上述测序无误的表达宿主基因工程菌分别经平皿划线活化后，挑单菌落分别接种至含50μg/ml卡那霉素的10ml lb液体培养基中，37℃震荡培养10～12h，按2％接种量转接至100ml同样含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃震荡至od600达到0.8左右时，降温至30℃，加入iptg至其终浓度为0.5mm，诱导培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清液，分别收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。
[0063]
其中，lb液体培养基的配料为蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l；用水溶解后上述配料后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0064]
将培养结束后收集到的菌体，分别用50mm，ph8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mlph8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，分别得到硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的粗酶液。
[0065]
体外酶催化合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的方法
[0066]
实施例2
[0067]
在50ml的酶混合系统中，硝基苯还原酶nbza的浓度为0.15mg/ml，羟胺苯变异酶haba的浓度为0.28mg/ml、葡萄糖脱氢酶gdh的浓度为0.32mg/ml；硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比为1：1：1；并直接加入2g/l的底物间硝基苯乙酮3nap，催化反应在含有1％葡萄糖的50mm磷酸盐缓冲液(ph8)中进行，于30℃反应48小时，反应体系中nadph的浓度为1.72mm/l。反应结束后，通过高效液相色谱法测定反应体系中产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度，结果见表1。
[0068]
实施例3～13
[0069]
与实施例2相比，不同之处在于，各个实施例中酶混合系统中硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比各不相同，具体比例及反应结果见表1。由以上实施例可知，硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的最佳反应摩尔比为1：4：24，对应的产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度为0.58g/l。
[0070]
表1不同酶混合系统对应的产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap浓度
[0071]
实施例nbza、haba、gdh的摩尔比3ahap浓度(g/l)实施例21：1：10.075实施例31：1：40.1实施例41：4：10.15实施例54：1：10.05实施例61：2：80.175实施例71：4：160.245实施例81：8：320.25实施例91：4：80.275实施例101：4：120.28实施例111：4：240.58实施例121：4：280.532实施例131：4：320.48
[0072]
实施例14
[0073]
与实施例2相比，不同之处在于，底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为5g/l。反应结束后，反应体系中产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度为0.125g/l。
[0074]
实施例15
[0075]
与实施例2相比，不同之处在于，底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为10g/l。反应结束后，反应体系中产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度为0.131g/l。
[0076]
rbs优化
[0077]
实施例16：
[0078]
对实施例1中的羟胺苯变异酶haba核苷酸序列seq id no.2中的rbs序列seq id no.7利用rbs calculator 2.0进行优化，优化后的rbs序列为seq id no.8～12；将所述优化后的rbs序列通过对应的全基因合成的引物seq id no.13～22置换至所述羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中；得到核苷酸序列如seq id no.23～27所示的含有优化后rbs序列的羟胺苯变异酶haba基因。
[0079]
将得到的含有优化后rbs序列的羟胺苯变异酶haba基因按照实施例1中所述方法进行操作，得到经rbs优化的羟胺苯变异酶haba的粗酶液。
[0080]
实施例17：
[0081]
在50ml的酶混合系统中，硝基苯还原酶nbza的浓度为0.15mg/ml，核苷酸序列如seq id no.23所示的经rbs优化的羟胺苯变异酶haba的浓度为0.25mg/ml、葡萄糖脱氢酶gdh的浓度为0.32mg/ml；硝基苯还原酶nbza、核苷酸序列如seq id no.23所示的经rbs优化的羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比为1：4：24；并加入2g/l的底物间硝基苯乙酮3nap，催化反应在含有1％葡萄糖的50mm磷酸盐缓冲液(ph8)中进行，于30℃反应5小时，反应体系中nadph的浓度为1.72mm/l。反应结束后，通过高效液相色谱法测定反应体系中产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度，结果见表2。
[0082]
实施例18～21：
[0083]
与实施例17相比，不同之处在于，各个实施例中酶混合系统中羟胺苯变异酶haba的核苷酸序列不同，粗酶液中对应的经rbs优化的羟胺苯变异酶haba的浓度也不同，反应结束后，产物3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的浓度结果见表2。由表2可知，利用如seq id no.9所示的rbs序列对羟胺苯变异酶haba进行优化后，3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap的产量相较于优化前得到大幅度提高，达到0.58g/l。
[0084]
表2经rbs优化后的羟胺苯变异酶haba及其对应的产物浓度
[0085][0086]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的方法，其特征在于，所述方法为：以硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh为催化剂并构成酶混合系统，以葡萄糖和间硝基苯乙酮3nap为底物，合成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap；所述酶混合系统中硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的摩尔比为(1～4)：(1～8)：(1～32)。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的反应过程为：硝基苯还原酶nbza催化间硝基苯乙酮3nap生成3-羟基氨基乙酰苯3haap；羟胺苯变异酶haba催化3-羟基氨基乙酰苯3haap生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap；葡萄糖脱氢酶gdh催化葡萄糖生成nadph。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为2～10g/l。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝基苯还原酶nbza以硝基苯还原酶nbza基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述硝基苯还原酶nbza基因工程菌是核苷酸序列seq id no.1所示的硝基苯还原酶nbza基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；所述羟胺苯变异酶haba以羟胺苯变异酶haba基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述羟胺苯变异酶haba基因工程菌是核苷酸序列seq id no.2所示的羟胺苯变异酶haba基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；所述葡萄糖脱氢酶gdh以葡萄糖脱氢酶gdh基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述葡萄糖脱氢酶gdh基因工程菌是核苷酸序列seq id no.3所示的葡萄糖脱氢酶gdh基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟胺苯变异酶haba以羟胺苯变异酶haba基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述羟胺苯变异酶haba基因工程菌是核苷酸序列seq id no.23～27所示的羟胺苯变异酶haba基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述羟胺苯变异酶haba核苷酸序列seq id no.2中的rbs序列seq id no.7进行优化，优化后的rbs序列为seq id no.8～12中的任意一种；将所述优化后的rbs序列通过对应的引物seq id no.13～22置换至所述羟胺苯变异酶haba核苷酸序列中；得到核苷酸序列seq id no.23～27所示的含有优化后rbs序列的羟胺苯变异酶haba基因。7.如权利要求4或5任一所述的方法，其特征在于，所述湿菌体按如下方法获得：将基因工程菌接入含卡那霉素的lb培养基中，35～37℃培养至od600达到0.8，向发酵液中加入终浓度0.5～1mm的诱导剂iptg，于28～30℃诱导培养，将获得的发酵液离心，收集菌体沉淀，即得所述湿菌体。8.一种硝基苯还原酶nbza在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述硝基苯还原酶nbza的氨基酸序列如seq id no.4所示。9.一种羟胺苯变异酶haba在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述羟胺苯变异酶haba的氨基酸序列如seq id no.5所示。10.一种葡萄糖脱氢酶gdh在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶gdh的氨基酸序列如seq id no.6所示。

技术总结
本发明公开了一种生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的方法，所述方法为：以硝基苯还原酶nbzA、羟胺苯变异酶habA、葡萄糖脱氢酶GDH为催化剂并构成酶混合系统，以葡萄糖和间硝基苯乙酮3NAP为底物，合成3-氨基-2-羟基苯乙酮3AHAP；所述酶混合系统中硝基苯还原酶nbzA、羟胺苯变异酶habA、葡萄糖脱氢酶GDH的摩尔比为(1～4)：(1～8)：(1～32)。具体反应过程为：硝基苯还原酶nbzA催化间硝基苯乙酮3NAP生成3-羟基氨基乙酰苯3HAAP；羟胺苯变异酶habA催化3-羟基氨基乙酰苯3HAAP生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3AHAP；葡萄糖脱氢酶GDH催化葡萄糖生成NADPH。本发明提供了一种温和有效、绿色安全、成本低廉的3-氨基-2-羟基苯乙酮生物合成方法。法。


技术研发人员：薛亚平 汤恒 朱红利 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/7/18