硬毛粗盖孔菌内参基因及其引物和应用

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及适用于硬毛粗盖孔菌生长发育、碳源利用、高温生长研究的内参基因及其引物和应用。


背景技术：

2.实时荧光定量pcr(qpcr)因其高灵敏度、特异性和可靠性，已经成为研究基因表达量的重要工具。然而，qpcr分析的有效性很大程度上取决于内参基因的选择和引物的设计。因此，筛选在不同条件下表达相对稳定的基因作为内参基因设计引物，是qpcr成功与否的关键所在。
3.在前期的研究中，我们使用传统的内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)作为硬毛粗盖孔菌基因表达量研究的内参基因。然而gapdh的表达也会受到某些因素的影响，且gapdh的表达量较高，在对低表达基因进行研究时，适用性较差。目前，还未有针对硬毛粗盖孔菌不同培养条件和发育过程内参基因及其引物的系统研究。
4.准确的基因序列是引物设计和正确扩增的前提条件，现有的基因注释软件通常是基于已有的模型进行基因结构的预测，然而不同物种甚至不同品种的基因结构有可能存在较大的差异，因此依据转录组数据对基因结构进行校正获得准确的基因信息具有重要的意义。
5.由于引物序列一般为18-22bp的短核苷酸序列，在基因组中存在大量相似的碱基位点，容易造成非特异性扩增。传统使用实验方法进行逐一验证引物特异性的方法，耗时长、效率较低、成本高。因此，引物合成前基于全基因组序列进行blast，去掉具有潜在多个结合位点的引物，可大大降低引物的筛选工作，提高引物筛选效率。


技术实现要素：

6.本发明的目的是筛选适用于硬毛粗盖孔菌不同研究情景、不同基因表达水平的内参基因及引物。本发明所使用的筛选方法简单、快捷，筛选出了扩增效率高、稳定性好的硬毛粗盖孔菌内参基因引物。
7.本发明的第一个目的是提供硬毛粗盖孔菌的内参基因，所述的内参基因包括泛素结合酶1、自噬蛋白atg8、泛素结合酶2、钙调磷酸酯酶和真菌蛋白激酶的基因；泛素结合酶1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；自噬蛋白atg8基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；泛素结合酶2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；钙调磷酸酯酶基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；真菌蛋白激酶基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8.泛素结合酶1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：
9.atggccctcaagcgcattaacaagttaatcgatctcggccgggacccgccctcctcgtgcagcgca
10.ggcccaactggcgataacatgttccagtggcaagcaacgatcatgggaccggcggattcaccatac
11.gctggtggcgtgttcttcctgtctatcactttccccacggactaccccttcaagccgcccaaggtca
12.gcttcacgaccaagatctaccacccgaacatcaacgcgaacgggtcgatctgtctcgatatcctga
13.gggaccagtggagtccagcattgactatctcgaaagttctgctttcgatttgctcaatgctcacgga
14.ccccaatcccgacgatccgcttgtccccgacatcgctcatctatacaagaacgacccggagcgatacgcggcaacggctcgggagtggacacggaagtatgctatgtag。
15.自噬蛋白atg8基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为：atgaggtccaagttcaaggatgagcacccctttgacaagcgcaaggcggaggcggagcgtatcaggcagaagtacccagatcgtatccctgtcatctgcgagaaggcggacaagacggacatccctaccatcgacaagaagaagtatctggtcccatcagacctcactgtgggccagttcgtctatgttatccggaagcgaatcaagctcgcaccggagaaggcgatcttcatcttcgtagacgaggtgctgcccccaacagcagcactgatgagcgccatatacgaggagcacaaggacgaggacgggttcctgtacgtgagctactcgggtgagaacacctttggctcgcggtga。
16.泛素结合酶2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为：atggaccagatcacctcgccactcgcaccccgtgcaaccacgaagccgtctgtggcgggagcgggaggagaccctgcgggtagtgtcacgaaacgcctcacgagtgaacttatgagcctaatgatgtcctcttcccccggaatctccgcattcccgaggaccgacgcgaacttgtttgactgggtgggaactattgagggtccagcgggcacggtttacgctggtttgtcgttcaagatcgcgatagcgttccctccaaactacccaatggcacctcctgccattaagttcgactcaccttgcttccaccccaatgttgacatcaacggcggagggatctgtcttgacattttgcaggacaaatggtctgccgtttacagcgtgcagacaatcctattgtctctccagtcgttgcttggtgagcccaacaatgcgtcaccgctgaaccccgatgccgctgctgtctgggacaaccccgatgaattcaaggcgcaggtgttgaagtactatcgccccatgaacgacgagtcgacttga。
17.钙调磷酸酯酶基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体为：atgggccagcagcagtccaaaaagtcgaagaagggtagcaaggataaggacaaggatgccaatggcgacgcagtagctcctgatgctgccgacaccaacgagacgctccagagcagtctctctcgcgcaaccgctccccaagatccctctggtcaagggaatggccacgatgcgggcgcagcgaccccaggaacaccagcaatgaccatcacaaacccagagggtggcaccgtcatcccgaacgggagtggttcacgacctccaggctccccgagtacttcacctagtgacggcctctcggggacctctccaaagccctcttcccctcagtcctcacctcatgtgcatggaaagcctgctccgcttgacattcctatcacccataccatcctctccacatccccaggctaccccacaccggggtctgccgccagcttctccctcaacgacccgacaggcggggctgtcaagggtaacgggaaggagggcgtgaagcagatggacatagacgacatgattcagcggttgctggacgtgggttacacgggcaaagtgagcaagtcgctctgtctcaagaacgccgagatcgtcgccatttgccaagcggcacgggaggtgttcctcagccagcccactctcattgaactttcaccacccgtgaagatcgttggggacgtgcacggacagtactcggacctcatccggctgttcgagatgtgcgggttcccgccagcggcgaactacctcttcctcggcgactatgttgaccgaggcaagcaaagtctcgagaccatcctcctattgctctgctacaagatcaagtacccagagaacttcttcctactgcgtggcaaccacgagtgtgccaacgtcacgcgagtctacggtttctatgacgaatgcaaacgaaggtgtaacctgaagacttggaagacgttcattgatgtcttcaattgccttcctatcgctgctattgtcgcgtccaagattttctgtgttcatggcggcctctccccgtccctacattccatggaggagatcaagcgcatacagcgcccaaccgacgtaccagactatggtcttctgaatgaccttctctggtcagatccgtctgacaccgcagtagactgggaggacaacgaacgaggagtcagttattgttttggcaaggcagtcatcaatgatttcct ggtgcgatacgacatggacctcatctgccgggcgcacatggtagtcgaggacgggtacgagttctggaatgaccggacgctggtaactgtgttcagcgcaccgaattattgtggagagttcgacaactatggagcatgcatgagcgtgtcggaagaattgctttgcgcgttcgaacttctcaagcccttagatggtcccgccctacgaaaagaaatgacgaaggccaagcggaagagcatgatggccactacgacttga。
18.真菌蛋白激酶基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体为：atgggcaagtatatggacgtaaagactttttgctctaccttcctccccgtaccacagtcacgaccccgagaggagaggcctccaaacagca
tgcccaagggtacgaggactgccatccaaaacgccacgacagaacgtcagatctccgaagcttgggcctcttggctgaatccgtctacaaagtacgccaggggaccgtgtcctggttatcgtctcgctctgtcgcaagaccgatgggacgcaggagacgagcagatgctgaaggtcgacggtgcgctccacgtgcaagctactgtccccaccgacgggcgtccccactgggagagttcgcgactgctactcgagttcaagaggggtgggggccagtacgatccgtacgacgacgtgaagaaaggagacgcgtcgtcggatacgcgtacggcggttcgtggtcagatcactcagtacgtcgctcacgccttcgcacaccaacaccgcacggctatgttcctcttctttgtcaacgggacaaagatgcgggcgactcgctgggatcgttctgggacgatcttcacggaagcattcgactacaccgaggaccctcacacccttcgagacctgttgtggggcttctctcgactctcgcccgaggagcagggcatcgatacgaaggcccaagtcctcgcggagggcgatgagcactacgagctcatgacccaagtctcggagccttgcgatagcgacatctccattgtagagggcaccgtcgttgaccctcgacccgacgatacaccatatgtattcgcgcatgttcgtgaacgattcaagcagtcgatagccgaaggagttccccgctaccgcctacatgttcctacttcggatgctggggagcgcatcttcctcgtcgggttgccgatcttcattgcacctgggatgtccggccgcggaacgcgcggatacatcgcttgggacgttaaaggacagcgattcgtcttcctgaaagacgcttggcgacctgactatgaagacgtcgcaacggaggggaatgtgcttcggagcctgcacaccgctggcgttagtaacgttcccacaatcgtctgcgacggagagctcgaacagagaactttcactcactcctacaatccaccatcccggccagccgacgaagaggacggtcagtcaagcgaggagggccccgttgctccttctgaggacgaggacactgccgttgagccggaggactctgacggcgacatgccatcttcgccgtgtccacgccccacagtacttgacatggagatggacaactctcctaactactcgcgatctccgtcacctgtcgctgcaccgccctcactcccgccggcaccacagtcacctgcactatcccctggagagcctctgctgcttgacagccgtgcccctaacgaattcatcgggagaggcagacatctcctgaggcccttccgacactatcgtctcgtggtagaagaggtatgcttgcctctgttctcgttctccaacggaaagcagttggttcgtatacttcgtgattgtgttcaagcacatgcagaggccttgaacaaagcgggcctcctccaccgtg acctcagcgctggaaatattctcattgctccgagagtgattatggatgcggatgggaagaccggtcgtgtcgtatggaagggcatgctggctgattgggagctttcgaagcccattcctgttgacggggaagatgagacggcgcgacaacccgttcgaaccggtacatggcaattcacctcggcccacatcctcgataatcccgacgatcccgttcgagtgccagatgagatagagggtgtctttaacgtcgctctctacatctctctgcgatttctacgtcacgactgcgacaacctcccaatgacgatgttcgactacttcgacgacttcaagtactcgagcaagcataaatcctatcgttgcggggcagaaaaaaggagtctggtgcgctctggaaagctcaagacgatcggtgctgggaagtactcgttcctcggagacgatggcgaagcagattcgcatcccctgaacgacatcttctacgctatgctctcctggtttgccgctcgataccgcctatacgacgaggcacaagagcccatcaacaaagccgagcagaggtatcacgtagttttcaacaaggaacccgacgaagccagggccgcgaagctggagaaccatgatgcccttctggatctgctggacgaacagctcgacgcagagtggccgttgaaggacaaagtcggagatcagctgaagccccagaaaacgcggagagcagaggacgacgatgataagaacggcggattcccggagccaggcgcgaagcgtgtcaagaccgacgaacgaggacacgagggcaagactcgaagggcgacctcgaaggacacccgcaagaaagcgaaagcgtccggatctcgtgggcctccggtcagaagccgcggtggacgaaccactcggacacgcggcggctcagggagcacacggtacggttcatcgaatcaggttgctcggtag。
19.本发明的第二个目的是提供用于扩增上述内参基因的引物组，所述的引物组序列如下：
20.泛素结合酶1基因的扩增引物如seq id no.6-7所示，具体为：
21.f:gtggcgtgttcttcctgtct；r:cgttcttgtatagatgagcgatgt；
22.自噬蛋白atg8基因的扩增引物如seq id no.8-9所示，具体为：
23.f:gccagttcgtctatgttatccg；r:cgtccttgtgctcctcgtat；
24.泛素结合酶2基因的扩增引物如seq id no.10-11所示，具体为：
25.f:cgagtgaacttatgagcctaatga；r:cgaacttaatggcaggaggtg；
26.钙调磷酸酯酶基因的扩增引物如seq id no.12-13所示，具体为：
27.f:gccttcctatcgctgctattg；r:actgactcctcgttcgttgt；
28.真菌蛋白激酶基因的扩增引物如seq id no.14-15所示，具体为：
29.f:gcctctgttctcgttctccaa；r:catccgcatccataatcactctc。
30.本发明的第三个目的是提供检测上述的内参基因的试剂在硬毛粗盖孔菌内参基因定量检测中的应用。
31.本发明的第四个目的是提供上述的引物组在硬毛粗盖孔菌内参基因定量检测中的应用。
32.本发明的第五个目的是提供上述的引物组在制备硬毛粗盖孔菌基因表达分析的试剂盒中的应用。
33.本发明的第六个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒包含上述的引物组。
34.优选的，所述的试剂盒还包含pcr所用的其他试剂。
35.本发明的第七个目的是提供上述的内参基因、引物组或试剂盒在硬毛粗盖孔菌基因表达分析中的应用。优选的，是在硬毛粗盖孔菌不同表达水平的基因的定量检测中的应用。
36.本发明的第八个目的是提供一种硬毛粗盖孔菌不同表达水平的基因的定量检测方法，该方法是以上述的内参基因进行不同表达水平的基因的定量检测，其中，所述的真菌蛋白激酶基因作为低表达基因定量检测的内参基因；所述的钙调磷酸酯酶基因作为中低表达基因定量检测的内参基因；所述的泛素结合酶2基因作为中等表达基因定量检测的内参基因；所述的自噬蛋白atg8基因作为中高表达基因定量检测的内参基因；所述的泛素结合酶1基因作为高表达基因定量检测的内参基因。
37.本发明公开了适用于硬毛粗盖孔菌生长发育和不同培养条件(碳源利用和高温生长)相关研究的5个内参基因，包括真菌蛋白激酶、钙调磷酸酯酶、自噬蛋白atg8基因和2个泛素结合酶基因。筛选方法为计算多个转录组数据中基因的表达量，然后根据基因的转录水平及转录稳定性挑选目的基因。本发明所公开的5个内参基因分别适用于不同表达水平基因的表达量研究。本发明所提供的内参基因在不同的发育时期和不同的培养条件下均具有稳定的表达，且内参引物特异性强、扩增稳定、扩增效率均接近100％。此外，可以根据目的基因的表达水平，在这5个内参基因中选择合适的内参基因进行表达量研究。为硬毛粗盖孔菌基因表达研究提供了比常见的内参基因如gapdh更稳定的、更广泛的新候选内参基因。
附图说明
38.图1是本发明所筛选内参基因引物的扩增产物电泳图。
39.图2是本发明所筛选内参基因的溶解曲线。
40.图3是本发明所筛选内参基因和传统内参基因gapdh在45℃热处理30min、1h、3h和6h的样品中ct值稳定性。
41.图4是在硬毛粗盖孔菌中随机挑选了5个由低到高表达的基因，分别选用本发明的5个内参基因进行qpcr，得到的表达量与转录组一致性高于传统内参基因gapdh。
具体实施方式
42.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
43.实施例1
44.1、内参基因的选择：在硬毛粗盖孔菌ct001(保藏于广东省科学院生物与医学工程研究所菌种库)分别于25℃和35℃及5种不同碳源培养基(配方：硫酸铵1.5g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，硫酸镁0.3g/l，维生素b1 0.5mg/l，琼脂粉20g/l，碳源20g/l，溶剂为水，碳源分别为葡萄糖、蔗糖、纤维素、木质素和半纤维素)中培养菌丝的转录组数据，及原基和子实体的转录组数据中，筛选出在所有的样品中表达量无显著差异(tpm稳定，cv＜10％)且表达丰度由低到高(5≤tpm≤2500)的基因，作为候选内参基因。
45.2、候选基因的结构校正：根据转录组数据对候选基因的基因结构进行手工校正，获得基因全长最准确的序列。
46.3、内参基因引物的设计：根据候选内参基因和传统内参基因gapdh序列设计引物，将引物序列在全基因组中进行blast，选择潜在结合位点较少的引物进行合成。这种先blast再挑选引物的方法可以最大限度保证引物扩增的准确性和专一性，并显著降低后续挑选合适引物的实验时间。
47.4、内参基因引物的筛选：利用上述引物对硬毛粗盖孔菌连续2倍梯度稀释的cdna进行qpcr扩增，依据琼脂糖凝胶电泳结果(图1)、溶解曲线(图2)、扩增效率(表1)、ct值稳定性(图3)等指标筛选出最优内参基因引物。
48.筛选得到的5个内参基因及其扩增引物的序列如下表1所示。
49.表1
50.[0051][0052]
ct值稳定性验证流程：
[0053]
1)将硬毛粗盖孔菌ct001的菌丝于35℃培养5d，然后在45℃分别高温处理30min、1h、3h和6h；
[0054]
2)提取上述高温处理菌丝的rna，调整到相同的浓度后，反转录为cdna；
[0055]
3)利用表1中本发明的内参基因的引物和传统内参基因gapdh的引物分别对上述样品进行qpcr扩增；
[0056]
4)反应体系为：2
×
chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，正反向引物(10μmol/l)各0.4μl，双蒸水8.2μl，cdna 1μl。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性3s，60℃退火32s，40个循环；72℃延伸30s。
[0057]
5)根据各内参基因在不同样品中的ct值，判断内参基因的稳定性。
[0058]
5、内参引物的应用：随机挑选葡萄糖培养基中(25℃和35℃)培养菌丝转录组数据中基因表达水平不同的基因，使用本发明提供的内参基因引物和传统gapdh引物分别进行qpcr扩增，本发明所提供的引物检验基因表达量与转录组数据的一致性更高(图4)。
[0059]
具体方法如下：
[0060]
1)根据转录组数据中基因的表达水平，挑选5个表达水平由低到高的基因：abc转运蛋白_1、热激转录因子_1、热激转录因子_2、肽酶、abc转运蛋白_2；
[0061]
2)设计以上5个基因及传统内参基因gapdh的qpcr引物，如表2所示：
[0062]
表2
[0063][0064]
3)利用葡萄糖培养基培养菌丝(25℃和35℃)的cdna进行qpcr。反应体系为：2
×
chamq universal sybr qpcr master mix 10μl，正反向引物(10μmol/l)各0.4μl，双蒸水8.2μl，cdna 1μl。反应程序：95℃预变性3min；95℃变性3s，60℃退火32s，40个循环；72℃延伸30s。
[0065]
4)利用2
–
δδct
法计算基因相对表达量，结果表明根据本发明中所提供的内参基因得到的表达量与转录组一致性高于传统内参基因gapdh(图4)。
[0066]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.硬毛粗盖孔菌的内参基因，其特征在于，包括泛素结合酶1、自噬蛋白atg8、泛素结合酶2、钙调磷酸酯酶和真菌蛋白激酶基因；泛素结合酶1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；自噬蛋白atg8基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；泛素结合酶2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；钙调磷酸酯酶基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；真菌蛋白激酶基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。2.用于扩增权利要求1所述内参基因的引物组，其特征在于，所述的引物组序列如下：泛素结合酶1基因的扩增引物为：f:gtggcgtgttcttcctgtct；r:cgttcttgtatagatgagcgatgt；自噬蛋白atg8基因的扩增引物为：f:gccagttcgtctatgttatccg；r:cgtccttgtgctcctcgtat；泛素结合酶2基因的扩增引物为：f:cgagtgaacttatgagcctaatga；r:cgaacttaatggcaggaggtg；钙调磷酸酯酶基因的扩增引物为：f:gccttcctatcgctgctattg；r:actgactcctcgttcgttgt；真菌蛋白激酶基因的扩增引物为：f:gcctctgttctcgttctccaa；r:catccgcatccataatcactctc。3.检测权利要求1所述的内参基因的试剂在硬毛粗盖孔菌内参基因定量检测中的应用。4.权利要求2所述的引物组在硬毛粗盖孔菌内参基因定量检测中的应用。5.权利要求2所述的引物组在制备硬毛粗盖孔菌基因表达分析的试剂盒中的应用。6.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物组。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含pcr所用的其他试剂。8.权利要求1所述的内参基因、权利要求2所述的引物组或权利要求6所述的试剂盒在硬毛粗盖孔菌基因表达分析中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是在硬毛粗盖孔菌不同表达水平的基因的定量检测中的应用。10.一种硬毛粗盖孔菌不同表达水平的基因的定量检测方法，其特征在于，以权利要求1所述的内参基因进行不同表达水平的基因的定量检测，所述的真菌蛋白激酶基因作为低表达基因定量检测的内参基因；所述的钙调磷酸酯酶基因作为中低表达基因定量检测的内参基因；所述的泛素结合酶2基因作为中等表达基因定量检测的内参基因；所述的自噬蛋白atg8基因作为中高表达基因定量检测的内参基因；所述的泛素结合酶1基因作为高表达基因定量检测的内参基因。

技术总结
本发明公开了硬毛粗盖孔菌内参基因及其引物和应用。所述的内参基因包括泛素结合酶1、自噬蛋白Atg8、泛素结合酶2、钙调磷酸酯酶和真菌蛋白激酶基因。本发明所公开的5个内参基因分别适用于不同表达水平基因的表达量研究。本发明所提供的内参基因在不同的发育时期和不同的培养条件下均具有稳定的表达，且内参引物特异性强、扩增稳定、扩增效率均接近100％。此外，可以根据目的基因的表达水平，在这5个内参基因中选择合适的内参基因进行表达量研究。为硬毛粗盖孔菌基因表达研究提供了比常见的内参基因如gapdh更稳定的、更广泛的新候选内参基因。基因。基因。


技术研发人员：王丽宁 黄清铧 王庆福
受保护的技术使用者：广东省科学院生物与医学工程研究所
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/18