一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用的制作方法

1.本发明属于酶工程技术领域，涉及一种蔗糖磷酸化酶(spase)突变体及其应用。


背景技术：

2.l-抗坏血酸分子中存在极不稳定的连烯二醇结构，极易被热和氧化剂破坏，尤其是光、重金属和荧光物质都能促进其氧化，使其应用受到很大限制。抗坏血酸葡萄糖苷(aa-2g)是l-抗坏血酸的衍生物，分子式为c12h18o11,该物质是在糖基转移酶的作用下,由吡喃型葡萄糖苷和l-抗坏血酸缩合而成,其中抗坏血酸分子上2位碳上的羟基被吡喃型葡萄糖苷所取代，吡喃型葡萄糖苷以β-1,4-糖苷键连接。因为2位碳上有葡萄糖基掩蔽,所以aa-2g具有非还原性，与抗坏血酸相比，稳定性更高，同时更易于吸收和利用。
3.aa-2g具有非还原性，不易发生氧化反应，其水溶液特别稳定；aa-2g具有较好的耐光性和耐热性；aa-2g能被α-葡萄糖苷酶水解生成抗坏血酸和葡萄糖，因此可以发挥抗坏血酸的功效；aa-2g对于清除自由基，促进胶原合成具有更为持久的作用效果。
4.多种知名品牌的化妆品都使用aa-2g这种新型稳定的抗坏血酸衍生物作为美白添加剂，如法国欧莱雅、德国兰蔻、日本资生堂等。目前市场上的aa-2g主要由日本林原国际有限公司合成，该公司申报若干相关专利对相关合成技术加以保护，形成市场垄断。
5.aa-2g作为人工合成的抗坏血酸衍生物，生物转化是其现今唯一的生产方式。其化学合成的方法也有学者进行过探究，但结果表明该方案合成过程复杂、成本过高，与工业化生产差距甚远。
6.aa-2g的生物转化最早由日本林原生物化学研究所和冈山大学药学系实现，以可溶性淀粉和抗坏血酸为底物，在环糊精葡聚糖转移酶的作用下进行aa-2g的生产。近年来国内外学者也对其合成方法进行不断研究，取得一系列的研究成果。目前，环糊精糖基转移酶(cgtase,ec2.4.1.19)、α-淀粉酶(ec3.2.1.1)、α-葡萄糖苷酶(ec3.2.1.20)、α-异麦芽糖基葡萄糖形成酶、蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7)是常用的5种合成aa-2g的酶。
7.长双歧杆菌(bifidobacterium longum)来源的磷酸化酶作为一种转化生产aa-2g的新酶来源,在2007年被韩国研究者发现。其以蔗糖为糖基供体生产aa-2g，对于该酶的研究尚在实验室阶段,离实现工业化还有一定距离，目前国内外也在针对该酶进行研究,但尚未见该酶生产aa-2g的报道。


技术实现要素：

8.本发明的首要目的是提供一种蔗糖磷酸化酶突变体，以能够使突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，并能在催化制备抗坏血酸葡萄糖苷时具有更高的产物收率，为实现工业化生产奠定基础。
9.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种蔗糖磷酸化酶突变体，
10.所述的突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶中突变g52d、h273q、d314s中至少一个氨基酸位点。
11.g52d、h273q、d314s分别表示：第52位氨基酸由g突变为d；第273位氨基酸由h突变为q、第314位氨基酸由d突变为s。
12.进一步地：突变的氨基酸位点为g52d、h273q、d314s中任一个或两个。
13.进一步地：突变的氨基酸位点为g52d。
14.进一步地：突变的氨基酸位点为h273q和d314s或者g52d和d314s。
15.进一步地：突变的氨基酸位点为g52d和h273q和d314s。
16.本发明的第二个目的是提供一种编码上述的蔗糖磷酸化酶突变体的多核苷酸。
17.本发明的第三个目的是提供所述的蔗糖磷酸化酶突变体的应用，以蔗糖和抗坏血酸为底物，催化合成抗坏血酸葡萄糖苷。
18.进一步地，酶的添加量为100-150u，优选150u，底物浓度：蔗糖1.00-1.50m，优选1.46m，抗坏血酸1.00-1.50m，优选1.50m。
19.进一步地，反应在30℃-37℃下进行，优选37℃；反应时间至少1h，优选8-10h。
20.进一步地，反应所需的ph条件为5.00-5.50，优选5.20。
21.本发明的有益效果在于，本发明的蔗糖磷酸化酶突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，并能在催化制备抗坏血酸葡萄糖苷时具有更高的产物收率。
22.本发明选择长双歧杆菌bifidobacterium longum来源的蔗糖磷酸化酶spase作为出发点，其相比其它来源的蔗糖磷酸化酶有以下优势：酶活力高、催化效率高、最终产物浓度高。在此基础上，本发明通过基因工程及酶工程技术手段，对spase进行突变，所获得的蔗糖磷酸化酶合成酶突变体较spase具有酶比活力、催化速率和转化收率更高，酶更稳定等优点，因此更适用于抗坏血酸葡萄糖苷的制备。
23.以下结合实施例和附图对本发明作出进一步的说明，而不会形成对本发明的限制。
附图说明：
24.图1为蔗糖磷酸化酶制备抗坏血酸葡萄糖苷的原理图。
具体实施方式：
25.其中spase及其突变体的酶活力的测定方法如下。
26.反应底物组成：抗坏血酸:蔗糖＝250mm:250mm
27.称取抗坏血酸4.40g，蔗糖8.55g，用100mm ph5.0醋酸钠-醋酸缓冲液溶解，调ph5.0，并定容到100ml。
28.酶活测定：取0.5ml样品(或稀释后样品)于1.5ml规格的离心管中(离心管中预先加入一定量的玻璃珠，以离心管刻度1.0ml处为宜)，在ms3振荡器上振荡20min(振荡器振荡频率设为1500/min)后，将样品稀释(用水稀释)到合适的线性范围进行检测(0-4.5u),取适量稀释后样品于50ml试管中，用生理盐水补足5ml，加入已预热至37℃的底物溶液10ml，于37℃的水浴中搅拌反应10min后，加入25％的三氯乙酸溶液2ml终止反应，摇匀后离心，精确量取上清液1ml于50ml容量瓶中，用水定容后进行hplc分析。
29.hplc分析：
30.流动相：用磷酸调ph2.0的磷酸水溶液，加入1％的甲醇
31.色谱柱：中谱红c18 aq+，4.6
×
200mm，5μm
32.波长：238nm
33.流速：0.8ml/min
34.柱温：25℃
35.色谱峰保留时间：抗坏血酸，6.858min
36.aa-2g，7.959min
37.蔗糖：不显峰
38.标准液：精确称取aa-2g标准品10-20mg，用水定容到100容量瓶中，摇匀后过滤进液相进行hplc分析。
39.酶活计算：
[0040][0041]
酶活力单位：在一定反应条件下，单位酶量每分钟生成1μmol的aa-2g为一个单位。
[0042]
w标：aa-2g对照品称量，mg；
[0043]
p标：aa-2g对照品含量，％；
[0044]
a样：样品aa-2g的峰面积；
[0045]
a标：aa-2g对照品的峰面积；
[0046]
m：aa-2g分子量；
[0047]
t：反应时间，min；
[0048]
v：液态酶取样量，ml；
[0049]
w：固定化酶称量，g。
[0050]
实施例1：来源bifidobacterium longum的蔗糖磷酸化酶spase原核表达菌株的构建
[0051]
下载genbank中bifidobacterium longum来源的蔗糖磷酸化酶spase的氨基酸序列(本发明seq id no.1，具体为：mknkvqlityadrlgdgtlssmtdilrtrfdgvydgvhilpfftpfdgadagfdpidhtkvderlgswddvaelskthnimvdaivnhmsweskqfqdvlekgeeseyypmfltmssvfpngateedlagiyrprpglpfthykfagktrlvwvsftpqqvdidtdsakgweylmsifdqmaashvryirldavgygakeagtscfmtpktfklisrlreegvkrgleilievhsyykkqveiaskvdrvydfalpplllhslftghvepvahwteirpnnavtvldthdgigvidigsdqldrslkglvpdedvdnlvntihanthgesqaatgaaasnldlyqvnstyysalgcndqhylaaravqfflpgvpqvyyvgalagrndmellrrtnngrdinrhyystaeidenlerpvvkalnalakfrnelpafdgefsyevdgdtsitfrwtaadgtstaaltfepgrglgtdnttpvaslawsdaagdhetrdllanppiadid；对应genbank登陆号：wp_101027035.1)，提供给北京擎科生物技术有限公司进行编码核酸的全基因合成(采用大肠杆菌优选密码子)。合成基因c-端带有his标签，构建至原核表达载体pet30a(+)中，原核表达载体酶切位点：5’端nde i，3’端xho i。将构建好的质粒pet30a(+)-spase通过cacl2热激转化法转化至大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中，涂布于含有50μg/ml kanamycin的lb固体培养基平板，37℃过夜培养，平板上生长出的菌落即为蔗糖磷酸化酶原核表达重组菌株e.coli bl21(de3)/pet30a(+)-spase。
[0052]
用灭菌枪头在上述lb固体培养基平板中小心挑取蔗糖磷酸化酶spase原核表达重
组菌株单菌落，接种至含有20ml的lb液体培养基的三角瓶中，37℃，200r/min，振荡过夜培养。次日按照1％的接种量将摇瓶菌液接种至含有100ml tb液体培养基的三角瓶中，37℃，220r/min，振荡培养，并每隔1h测定培养液的od值，待培养液od
600
＝1.5时，补加终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃，220rpm继续培养4h-6h，停止培养。
[0053]
实施例2：spase原核表达菌株e.coli bl21(de3)/pet30a(+)-spase易错突变文库的构建
[0054]
以pet30a(+)-spase重组质粒作为pcr模板，常规的t7f/r作为通用引物(引物序列：t7f:5
’‑
taatacgactcactataggg-3’，seq id no.2；t7r:5
’‑
gctagttattgctcagcgg-3’，seq id no.3)对spase基因进行易错pcr扩增，调整pcr扩增反应体系中mg
2+
、mn
2+
、dctp和dttp寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为2
‰
，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。
[0055]
易错pcr反应体系：
[0056][0057]
易错pcr反应条件：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
[0058]
将上述易错pcr产物取样2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测无误后用pcr产物纯化试剂盒进行纯化处理。在37℃条件下，用nde i和xho i限制性内切酶分别对pcr纯化产物和原核表达载体pet30a(+)进行双酶切，酶切产物切胶回收(其中回收pcr纯化产物片段大小约为1500bp，回收载体pet30a(+)片段大小约为5400bp)后，按照易错pcr产物：原核表达载体pet30a(+)为3：1的摩尔比进行混合，加入t4 dna ligase于16℃过夜连接。第二天，通过电击转化的方法将连接产物转入大肠杆菌bl21(de3)中构建工程菌，即可得到一个库容量大的随机突变体文库。
[0059]
实施例3：spase原核表达菌株e.coli bl21(de3)/pet30a(+)-spase易错突变文库的筛选
[0060]
由蔗糖和抗坏血酸制备抗坏血酸葡萄糖苷的反应原理图(图1)可知，在转糖苷过程中，会有抗坏血酸消耗，由于需要做大批量反应，因此测ph变化的方法不够便捷；所以考虑对抗坏血酸进行检测，使用铜磷钼蓝的方法，达到高效且能大批量操作的目的。其原理为：以磷酸为介质，在邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲体系(ph值为2～4)中，cu
2+
与钼酸铵反应生成铜磷钼黄，抗坏血酸将铜磷钼黄还原为铜磷钼蓝(最大吸收波长700nm)，而糖基化的抗坏血酸更加稳定，不会被氧化，因此可以通过分光光度法测定铜磷钼蓝的量来反映体系中残余的抗坏血酸的量。
[0061]
具体方法如下：
[0062]
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库的单菌落(每根牙签挑取1个单菌落)，分别接种于96孔细胞培养板的不同孔中(每孔中已加入含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基)。将96孔细胞培养板置于恒温摇床中37℃，700rpm培养6小时，然后用8通道移液器在每孔加入终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃，250rpm诱导培养8小时。诱导培养完毕后，取100μl菌液与100μl裂解液(1.488g/l edtana2，4％(v/v)triton-100，2％(m/v)溶菌酶，ph5.2的0.05mol/l醋酸缓冲液)混匀，37℃放置1小时后4000rpm，4℃离心5min。取上清80μl至新的96孔酶标板，加入65μl反应底物(0.08mol/l蔗糖，0.02mol/l抗坏血酸，ph5.2的0.05mol/l醋酸缓冲液)，于37℃反应1h。然后取75μl的反应液体，加入65μl显色液(0.46mg/ml硫酸铜，0.77mg/ml钼酸铵，ph5.2的0.015mol/l磷酸缓冲液)，37℃反应3-5min，测量od
700
吸光值。
[0063]
通过反复大量筛选验证(＞8000个克隆子)测序分析及酶活力测定，得到2个酶活力高于野生型spase的突变体表达菌株，分别命名为spase-1、spase-2，总结如下表1。
[0064]
表1：易错突变文库筛选获得的spase突变体的表达菌株
[0065][0066]
从表1可以看出，spase-2的摇瓶(发酵液)酶活力相比野生型spase有明显提高，摇瓶酶活力提高2.47倍；突变体spase-1的摇瓶酶活力相比野生型spase也有一定提升。考虑在spase-1基础上，进行氨基酸突变位点的叠加突变。
[0067]
实施例4：不同叠加突变体菌株的构建与筛选
[0068]
将表1中spase-1表达菌株进行扩大培养，用质粒试剂盒(omega)提取质粒，以质粒pet30a(+)-spase-1为模板，将所获得的突变位点进行叠加突变，选取第273或/和314位氨基酸，分别设计定点突变引物，进行全质粒pcr反应，全质粒pcr产物经dpni消化后转化至表达菌株bl21(de3)中，经测序验证无误，即获得在spase-1、2突变体基础上的各叠加突变体的表达菌株，所表达与筛选的spase突变体的具体情况见表2。
[0069]
表2：spase及其突变体的突变位点和活力
[0070][0071]
从表2可以看出，个体叠加突变体较spase-1c活力有明显提升，因此，为进一步测定各酶的催化反应能力，选取原本的两株单点突变菌株spase-1、spase-2及叠加突变株spase-1c，以野生型spase为对照，进行转化实验，测定产物收率。
[0072]
实施例5：各突变体菌株的转化实验
[0073]
利用液相色谱测定产物aa-2g的最终摩尔收率，具体方法如下。
[0074]
反应底物组成：称取蔗糖25.00g(1.46mol/l)，维生素c 8.75g(0.99mol/l)，用30ml水超声溶解后，调ph值至5.20。
[0075]
投酶量为150u，反应时间8-10h，转化实验在37℃下，避光无氧进行。
[0076]
hplc具体测定条件如下：
[0077]
流动相：用磷酸调ph2.0的磷酸水溶液，加入1％的甲醇。
[0078]
标准液：精确称取aa-2g标准品10～20mg，用水定容到100容量瓶中，摇匀后过滤进液相进行hplc分析。
[0079]
色谱柱：中谱红c18 aq+，4.6
×
200mm，5μm
[0080]
检测器：rid
[0081]
柱温：25℃
[0082]
进样量：100μl
[0083]
流速：0.8ml/min
[0084]
色谱峰保留时间：抗坏血酸，6.858min
[0085]
aa-2g，7.959min
[0086]
蔗糖：不显峰
[0087]
野生型spase及各突变株转化实验结果如下表3所示。
[0088]
表3：spase及其突变体转化实验结果
[0089][0090]
从表3可以看出，spase-1、-1c两个突变株转化收率相比野生型均有明显提升，具有工业化应用的潜力。综合来看spase-1c是最佳选择的突变株。
[0091]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述的突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的野生型蔗糖磷酸化酶中突变g52d、h273q、d314s中至少一个氨基酸位点。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为g52d、h273q、d314s中任一个或两个。3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为g52d；或者g52d和d314s；或者h273q和d314s。4.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变的氨基酸位点为g52d和rh273q和d314s。5.一种编码权利要求1-4任意一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体的多核苷酸。6.根据权利要求书1-4任一项所述的蔗糖磷酸化酶突变体的应用，其特征在于，以蔗糖和抗坏血酸为底物，催化合成抗坏血酸葡萄糖苷。7.根据权利要求书6所述的蔗糖磷酸化酶突变体的应用，其特征在于，酶的添加量为100-150u，底物浓度：蔗糖1.00-1.50m，抗坏血酸1.00-1.50m。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：反应在30℃-37℃下进行，反应时间至少1h。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：反应所需的ph条件为5.00-5.50。

技术总结
本发明属于酶工程领域，涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用。所述的蔗糖磷酸化酶突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型酶中突变多个氨基酸位点。利用本发明的蔗糖磷酸化酶突变体及其制备抗坏血酸葡糖苷的方法，能够使得突变体较野生型蔗糖磷酸化酶具有更高的比活力，更高的转化收率。更高的转化收率。更高的转化收率。


技术研发人员：华垚堃 张羽桑 周晶辉 赵强 罗红辉 赵士敏 许岗
受保护的技术使用者：湖南福来格生物技术有限公司
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/7/18