一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以荆芥茎段为外植体的荆芥组织培养再生体系的建立方法。


背景技术：

2.植物离体再生技术即植物组织培养，植物外植体在经过脱分化以后形成愈伤组织，将愈伤组织转入分化培养基中，再分化完成形态发生进而产生芽根结构，即可发育成完整植株。植物细胞具有全能性，而已经分化的细胞若要表现出全能性，首先要经历脱分化和再分化的过程(duclercq et al.,2011)。对药用植物而言，亦可以使用组织培养的技术，扩繁培养，在我国已有200余种药用植物建立了再生体系。植物再生有多种途径，直接在适宜的培养条件下诱导外植体产生不定芽和不定根等器官，最终可形成完整植株(perianez et al.,2014)。而利用离体的茎和叶片等组织器官直接产生再生植株，不经过诱导愈伤组织阶段，其再生周期和程序更短，并且具有很强的遗传稳定性，在培养过程中基因型不容易被改变。
3.培养基组成成分也是影响离体再生的一个重要因素，在离体再生研究中备受关注。诱导芽和根生长发育培养基大多以ms为基础培养基，因为其中含有比其他培养基更高的营养物质，也有部分研究者采用1/2ms作为药用植物生根培养基(cardoso et al.,2013)。培养基中添加的植物生长调节剂的种类、浓度和配比在很大程度上决定着药用植物离体再生培养的发展方向(vijaya et al.,2008)。诱导药用植物再生过程中并非某类生长调节剂单独作用的结果，不同的生长调节剂组合以及不同浓度的配比才会诱导出再生植株。再生培养这一技术的价值不仅仅是为药用植物再生提供了一种新繁殖方式，还可以使再生植物提取出比愈伤组织及悬浮细胞更多的次生代谢产物，更重要的是作为遗传转化技术的基础，可进一步实现中药现代化、推动中医药学更好发展。
4.荆芥为唇形科荆芥属一年生草本，在我国辽宁、河北、甘肃等省份均有野生或栽培种(中国植物志，1959-2004)。荆芥在我国具有悠久的用药历史，始载于《神农本草经》，有解表散风、透疹、消疮的作用；具有极大的临床医药价值，被《中国药典》正文部分收录(中国药典，2020)。荆芥的入药部位为干燥的地上部分及花穗，可用于治疗感冒，麻疹，疮疡初起等；荆芥及荆芥穗还可炒炭入药，分别为荆芥炭和荆芥穗炭，具有收敛止血等功效。现代研究表明，荆芥中有丰富的化学物质，如萜类、黄酮类等成分，故荆芥的药理活性多样，分别具有抗病毒、免疫调节、抗菌消炎等作用。荆芥质量的优劣直接关系到其临床疗效，因此开展荆芥发挥临床作用的物质基础的萜类化合物调控研究，为其栽培生产中实现精细调控具有重要意义。目前关于荆芥的研究比较少，其中仅涉及次生代谢物含量测定、生理生化指标分析和单萜代谢基因的克隆及表达分析等。发明人认为，随着对荆芥代谢相关分子机制的研究深入，迫切需要构建一种针对荆芥的高效再生体系，以保证和促进荆芥种质的保存及优化，为此，需要设计一种以荆芥茎段为外植体的荆芥组织培养再生体系的建立方法。
5.需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强理解本公开的背景，
并且因此可以包括不构成现有技术的信息。


技术实现要素：

6.发明人通过研究发现，以荆芥茎段为外植体，进行再生芽诱导及生根培养，可直接用于荆芥遗传转化的高频再生体系。
7.鉴于以上技术问题中的至少一项，本公开提供了一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，具体技术方案如下：
8.一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，包括如下步骤：
9.第一步，取荆芥种子，浸泡后在超净工作台中消毒后接种于初代培养基上，获得的无菌幼苗，所述初代培养基包括1/2ms；
10.第二步，将无菌幼苗置于超净台内，切取带腋芽茎段，将带腋芽茎段栽入用于再生芽的诱导培养基中，所述诱导培养基包括1/2ms，0.1～2.0mg/l naa和0.5～2.5mg/l tdz；
11.第三步，在诱导培养基中暗培养2周后移至光培养，获得再生苗；
12.第四步，取再生苗移至生根培养基，生根培养基包括1/2ms和0～0.5mg/l naa，获得组培苗；
13.第五步，将组培苗炼苗后去除根部培养基后栽入灭菌基质。
14.在本公开的一些实施例中，第一步中所述消毒的方法为将浸泡后的种子置于体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液1min，用无菌水冲洗3～4次；再用有效氯含量为2％的次氯酸钠溶液消毒30～40min，用无菌水冲洗34次，消毒过程中不断摇晃搅动。
15.在本公开的一些实施例中，第二步至第五步中的荆芥的茎段均为下端竖直插入对应阶段的培养基。
16.在本公开的一些实施例中，第三步中的所述的暗培养环境为光照强度0lx，温度为24
±
2℃；所述光培养环境为光照强度3000lx、光照周期为16小时光照/8小时黑暗，温度为24
±
2℃。
17.在本公开的一些实施例中，第五步中所述炼苗是将组培苗的培养器皿移至自然光下，而后在光照中将培养器皿开盖，在生根培养基表面覆水；3天完成炼苗取出植株。
18.在本公开的一些实施例中，其特征在于，第五步中所述灭菌基质的配比为3营养土：1蛭石：1珍珠岩。
19.在本公开的一些实施例中，第五步还包括将荆芥茎段栽入灭菌基质后在光照培养箱内，在24
±
1℃环境中，将光源的光照强度逐渐增强到10000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，在相对湿度为70～80％的条件下进行培养，培养1个月后，移至室外正常环境下进行培养，直至荆芥开花。
20.在本公开的一些实施例中，第三步中的所述诱导培养基视其变色情况适时更新继代，以保持其中激素及营养恒定。
21.在本公开的一些实施例中，第一步还包括将所述无菌幼苗按茎段繁殖方式在继代培养基中进行继代扩繁。
22.在本公开的一些实施例中，所述继代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37g/l，蔗糖30g/l、琼脂5g/l，ph值为5.8。
23.相比较现有技术而言，本发明具有以下有益效果：
24.1.通过无菌体系的建立、诱导茎段再生芽萌发、培养继代、生根、炼苗及移栽等步骤，实现了荆芥快繁、为完成遗传转化实验提供了基础；利用本公开的技术方案建立荆芥茎段组织再生体系，操作简便，污染率低，成活率高；
25.2.以荆芥茎段为外植体，进行再生芽诱导及生根培养，构建植株再生体系，不仅有利于对荆芥进行快繁，还可促进荆芥种质资源的保存，是一种可直接用于荆芥遗传转化的高频再生体系；
26.3.为进行农杆菌侵染的转基因试验提供了启示。
具体实施方式：
27.为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
28.下述实施例中的实验方法，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
29.本公开是设计一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，包括如下步骤：
30.第一步，取荆芥种子，浸泡后在超净工作台中消毒后接种于初代培养基上，获得的无菌幼苗，所述初代培养基包括1/2ms；
31.第二步，将无菌幼苗置于超净台内，切取带腋芽茎段，将带腋芽茎段栽入用于再生芽的诱导培养基中，所述诱导培养基包括1/2ms，0.1～2.0mg/l naa和0.5～2.5mg/l tdz；
32.第三步，在诱导培养基中暗培养2周后移至光培养，获得再生苗；
33.第四步，取再生苗移至生根培养基，生根培养基为1/2ms和0～0.5mg/l naa，获得组培苗；
34.第五步，将组培苗炼苗后去除根部培养基后栽入灭菌基质。
35.其中，各阶段的培养基的配制：
36.(1)初代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37g/l，蔗糖30g/l和琼脂5g/l，ph值为5.8。
37.(2)继代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37g/l，蔗糖30g/l和琼脂5g/l，ph值为5.8。
38.(3)再生芽诱导培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37或4.74g/l、萘乙酸(naa)0.1～2.0mg/l、噻苯隆(tdz)0.5～2.5mg/l、6-苄基氨基嘌呤(6-ba)0-8mg/l、蔗糖30g/l、琼脂5g/l，ph值为5.8。
39.最优再生芽诱导培养基中ms2.37g/l、萘乙酸(naa)0.5mg/l、噻苯隆(tdz)1.5mg/l、6-苄基氨基嘌呤(6-ba)对再生芽诱导效果不如噻苯隆(tdz)，浓度为0mg/l。
40.(4)生根培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37或4.74g/l，萘乙酸0～0.5mg/l，蔗糖30g/l和琼脂5g/l，
ph值为5.8。
41.最佳生根培养基中ms2.37g/l、萘乙酸(naa)0.4mg/l。
42.其中，ms为基本培养基，可以是hb8469-5。
43.以上实施方式中，列举出实施例一和四个对比例解释上述技术方案：
44.实施例一
45.本实施例是公开一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，具体步骤为：
46.1.无菌幼苗初代培养
47.取完整饱满的荆芥种子，在温水中浸泡3h，在超净工作台中于体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液中浸泡1min，用无菌水冲洗3～4次；再用有效氯含量为2％的次氯酸钠溶液消毒30～40min，消毒时间视种子外皮褪色程度而定，用无菌水冲洗3～4次，得到消毒后的荆芥种子，放在无菌干燥的滤纸上吸干表面水分，备用；
48.将消毒后的荆芥种子接种于初代培养基上，在光照强度为3000lx，16小时光照/8小时黑暗条件下进行无菌幼苗的初代培养，培养温度为24
±
1℃，培养时间为35～40天。此阶段无菌幼苗长势良好，其茎节伸长，茎间出现腋芽，根系生长旺盛。后将初代培养所得无菌幼苗按茎段繁殖方式，在超净工作台内将茎段作为外植体，按照上述方法进行继代扩繁，获得的无菌幼苗用于后续荆芥茎段再生试验。
49.2.再生芽诱导培养
50.以培养30天的荆芥无菌苗为材料，在超净工作台中用手术刀将荆芥茎段切成长0.5cm的小段，保留节间腋芽，接种于再生芽诱导培养基中，在正常光照或黑暗条件下进行再生芽诱导培养，培养温度为24
±
1℃。
51.荆芥茎段的再生芽诱导培养基为半量ms，分别添加0.1～1.0mg/l naa、0.5～3.0mg/l tdz组合，观察并统计30天后茎段生长情况及再生芽出芽率，以确定最佳再生芽诱导培养基，结果见表1。
52.植物组织培养的培养基大多以ms为基础培养基，因为其中含有比其他培养基更高的营养物质，而其中添加的植物生长调节剂的种类、浓度和配比在很大程度上决定着植物离体再生培养的发展方向。诱导芽分化的生长调节剂主要是生长素和细胞分裂素，生长素多采用naa，而细胞分裂素则以6-ba或tdz为主。
53.统计数据显示，不同培养基对荆芥外植体再生芽出芽率有不同影响。茎段接种5～10天时，茎段切口边缘持续膨大，腋芽生长明显，而后茎段上开始出现愈伤组织。30天时，愈伤组织处出现再生芽。低浓度naa对荆芥茎段再生芽的诱导率总体较低；高浓度tdz能明显促进愈伤组织的诱导，但浓度过高对荆芥后续生长有所不利。不同浓度的生长素和细胞分裂素组合对茎段再生芽诱导率和再生芽数量的影响极大，最佳配比为0.5mg/l naa和1.5mg/l tdz。
54.表1不同培养基成分对荆芥再生芽的影响
[0055][0056]
3.生根培养
[0057]
将长度为1.0～1.5cm的荆芥不定芽在超净工作台中用镊子分离，接种于生根培养基中进行生根培养。培养温度为24
±
1℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。生根培养20天后，不定根长至1.2～1.5cm，不定根较粗短，根系上布满根毛，有利于荆芥不定芽吸收养分。
[0058]
不定根的生根培养基为半量ms，分别添加0～0.5mg/l的naa含量，统计20天时荆芥再生芽上生根率及植株长势情况，确定最佳生根培养基，结果可见表2。
[0059]
统计数据显示，不同培养基对荆芥外植体生根影响有明显差异。无激素培养基对外植体的生根无明显促进作用，植株后期长势不良。随着naa浓度上升，荆芥再生芽生根率先升高后降低，其中naa在0.3～0.4mg/l时，生根率最高；而中naa浓度0.4mg/l时，植株长势最好，叶片完全展开，长势旺盛，为最佳生根培养基。
[0060]
不定根的生根培养基为半量ms，分别添加0-0.5mg/l的naa含量，统计20天时荆芥再生芽上生根率及植株长势情况，确定最佳生根培养基，结果可见表2。
[0061]
统计数据显示，不同培养基对荆芥外植体生根影响有明显差异。无激素培养基对外植体的生根无明显促进作用，植株后期长势不良。随着naa浓度上升，荆芥再生芽生根率先升高后降低，其中naa在0.3～0.4mg/l时，生根率最高；而中naa浓度0.4mg/l时，植株长势最好，叶片完全展开，长势旺盛，为最佳生根培养基。
[0062]
表2不同培养基成分对荆芥再生根的影响
[0063][0064]
4.炼苗与移栽
[0065]
待生长健壮的无菌苗的不定根长至1.5～2.0cm时，将培养瓶拿至室外自然光下，炼苗3天；而后在光照培养箱中打开瓶盖，在培养基表面覆水。炼苗3天后，取出植株，用流水洗去根部残留的培养基，移栽到装有蛭石、珍珠岩的无土栽培基质中，蛭石、珍珠岩的重量配比为1：1。在光照培养箱内，于(24
±
1)℃，日光灯光源，光照强度为3000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度为50～80％下进行培养。培养15天后，统计移栽成活率，植株生长健壮；培养1个月后，移至室外正常环境下进行培养，直至荆芥开花。
[0066]
对比例一
[0067]
本对比例是公开一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，本对比例与实施例一的区别是，按照实施例一的方法，将预培养环境由黑暗、温度为24
±
2℃，替换为光照强度3000lx、光照周期16小时光照/8小时黑暗、温度为24
±
2℃，其它步骤均不变，分别观察荆芥茎段状态及统计最终再生芽获得率。
[0068]
黑暗环境下荆芥茎段形态学下端膨胀，腋芽淡黄色，伤口部位出现愈伤组织。无黑暗环境培养的荆芥茎段无明显变化，腋芽呈绿色，伤口处无愈伤组织生长，再生芽数量较少。
[0069]
对比例二
[0070]
本对比例是公开一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，本对比例与实施例一的区别是，将所有培养基中的tdz替换为6-ba，浓度范围为0.5～4mg/l，其它步骤均不变，分别统计荆芥再生植株培养过程中的再生芽诱导率和诱导数量，观察植株生长状态。
[0071]
实验发现6-ba替换tdz对荆芥茎段再生芽诱导率几乎无影响，但生成愈伤组织量减少，再生芽获得量降低。在各种naa与6-ba组合中，0.8mg/l naa和2mg/l 6-ba组合最佳，荆芥茎段生长状态良好，10天时茎有明显膨胀，茎段形态学下端有少量愈伤组织，不定芽细小；20天时，茎与叶柄开始产生愈伤组织，叶片呈淡黄色。naa与6-ba组合培养基对荆芥茎段再生芽诱导率无明显影响，可作为茎段遗传转化的替代配方。
[0072]
对比例三
[0073]
本对比例是公开一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，本对比例与实施例一的区别是，将再生芽诱导培养基中激素组合设置为萘乙酸(naa)、噻苯隆(tdz)和6-苄基氨基嘌呤(6-ba)，具体配比为0.2mg/l naa、1.0mg/l tdz与1.0mg/l 6-ba，其它步骤
均不变，分别统计荆芥再生植株培养过程中再生芽诱导率及生根情况，观察植株生长状态。
[0074]
实验发现同时使用naa、6-ba和tdz的培养基在荆芥茎段再生芽诱导过程中，愈伤组织诱导量降低，再生芽数量减少。
[0075]
对比例四
[0076]
本对比例是公开一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，本对比例与实施例一的区别是，将再生芽诱导培养基和生根培养基中基础含量1/2ms更换为ms，其它步骤均不变，分别统计荆芥再生植株培养过程中的再生芽诱导率、获得再生芽数量及生根情况，观察植株生长状态。
[0077]
实验发现，增加ms用量使培养基中离子浓度提升，植株再生芽及新叶的生长状态发生改变。全量ms在再生芽诱导过程中，叶片呈半透明状，质脆，但植株可正常生长；在生根过程中，植株生根效果差，生根率极低，且生根植株难以完成炼苗与移栽工作，叶片不能正常抵御强光与室外干燥环境。而半量ms培养基的新叶正常，完成荆芥快繁工作后可进行炼苗与移栽，是培养基较好的选择
[0078]
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本技术的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

技术特征：
1.一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，取荆芥种子，浸泡后在超净工作台中消毒后接种于初代培养基上，获得的无菌幼苗，所述初代培养基包括1/2ms；第二步，将无菌幼苗置于超净台内，切取带腋芽茎段，将带腋芽茎段栽入用于再生芽的诱导培养基中，所述诱导培养基包括1/2ms，0.1～2.0mg/l naa和0.5～2.5mg/l tdz；第三步，在诱导培养基中暗培养2周后移至光培养，获得再生苗；第四步，取再生苗移至生根培养基，生根培养基包括1/2ms和0～0.5mg/l naa，获得组培苗；第五步，将组培苗炼苗后去除根部培养基后栽入灭菌基质。2.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第一步中所述消毒的方法为将浸泡后的种子置于体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液1min，用无菌水冲洗3～4次；再用有效氯含量为2％的次氯酸钠溶液消毒30～40min，用无菌水冲洗34次，消毒过程中不断摇晃搅动。3.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第二步至第五步中的荆芥的茎段均为下端竖直插入对应阶段的培养基。4.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第三步中的所述的暗培养环境为光照强度0lx，温度为24
±
2℃；所述光培养环境为光照强度3000lx、光照周期为16小时光照/8小时黑暗，温度为24
±
2℃。5.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第五步中所述炼苗是将组培苗的培养器皿移至自然光下，而后在光照中将培养器皿开盖，在生根培养基表面覆水；3天完成炼苗取出植株。6.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第五步中所述灭菌基质的配比为3营养土：1蛭石：1珍珠岩。7.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第五步还包括将荆芥茎段栽入灭菌基质后在光照培养箱内，在24
±
1℃环境中，将光源的光照强度逐渐增强到10000lx，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，在相对湿度为70～80％的条件下进行培养，培养1个月后，移至室外正常环境下进行培养，直至荆芥开花。8.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第三步中的所述诱导培养基视其变色情况适时更新继代，以保持其中激素及营养恒定。9.根据权利要求1所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，第一步还包括将所述无菌幼苗按茎段繁殖方式在继代培养基中进行继代扩繁。10.根据权利要求9所述的以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于，所述继代培养基为由溶剂和溶质组成的无菌培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度分别为ms基本培养基2.37g/l，蔗糖30g/l和琼脂5g/l，ph值为5.8。

技术总结
本发明公开了一种以荆芥茎段为外植体建立高效再生体系的方法，属于植物组织培养技术领域，包括将荆芥种子接种于初代培养基上，获得的无菌幼苗，将无菌幼苗切取带腋芽茎段，将带腋芽茎段栽入诱导培养基中，在诱导培养基中暗培养2周后移至光培养，获得再生苗；取再生苗移至生根培养基，获得组培苗；将组培苗炼苗后去除根部培养基后栽入灭菌基质。通过无菌体系的建立、诱导茎段再生芽萌发、培养继代、生根、炼苗及移栽等步骤，实现了荆芥快繁、为完成遗传转化实验提供了基础；利用本公开的技术方案建立荆芥茎段组织再生体系，操作简便，污染率低，成活率高。成活率高。


技术研发人员：唐晓清 张济萌 孙莉琼 师建玲 李晓帆 高阳 王康才
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/7/12