槟榔的组学分析与鉴定方法与流程

1.本技术涉及化学分析领域，具体涉及一种槟榔的组学分析与鉴定方法。
背景技术：
：2.槟榔具有良好的食用和药用价值。槟榔的主要化学成分包括多酚、生物碱、脂肪酸、三萜和甾体等。其中多酚主要包括木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁和没食子酸等，具有较强的抗氧化以及清除自由基的能力；生物碱主要包括槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱，具备诸多的明确疗效，如驱虫作用、抗血栓和抗动脉粥样硬化等，又表现出了一些毒性作用，如免疫毒性、细胞毒性和基因毒性。3.传统的槟榔活性成分分析方法，主要通过样品处理、活性成分提取，再通过色谱法进行。比如将超高效液相色谱(ultra-highperformanceliquidchromatography,uhplc)和质谱(massspectrometry,ms)相结合的非靶向组学分析方法，采集方式包括：全扫描(full-scan)、数据依赖采集(informationdependentacquisition，ida)和数据非依赖采集(dataindependentacquisition，dia)，是基于高分辨质谱的非靶向组学中的三种常见数据采集模式。全扫描是将代谢物一级和二级分开扫描，所需检测时间较长。ida中，质谱仪器进行全扫描，然后对从全扫描质谱中选择的母离子(强度依赖)列表进行二级扫描。而理论上，dia能够对所有代谢物的ms2信息进行连续和无偏倚的采集。但由于其ms2质谱信息十分复杂，母离子和子离子关联不紧密，数据处理存在困难。由于仪器平台的缺陷，导致非靶向分析往往受限于线性范围和精确性。靶向分析通常采用三重四级杆质谱(triplequadrupolemassspectrometry,tqms)，其具有更广的线性范围和精确性，但是由于其具有覆盖性不足的缺陷，导致其一般只用于定量分析，而难以应用于非靶向分析。在物质鉴定过程中，由于质谱仪采集光谱信息平均20个/秒，会产生大量数据信息；天然产物如多酚和生物碱数据库建立不够完善，二级质谱信息利用不足，物质鉴定以手动为主。4.由此可知，非靶向分析由于仪器平台的缺陷，使得其分析结果的线性范围和精确性较差；靶向分析由于其具有覆盖性不足的缺陷，导致其一般只用于定量分析，且质谱仪器产生的数据量巨大，处理困难。技术实现要素：5.基于此，有必要提供一种高效的槟榔组学分析方法。6.本技术一实施例提供了一种槟榔组学分析方法，其包括：7.提取槟榔中的活性成分获得检测样品，采用uhplc-swath方法对所述检测样品进行检测获得样品质谱数据；8.对所述样品质谱数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐处理，并与化合物数据库进行比对，获得样品化合物列表，所述样品化合物列表包括已知结构化合物和未知结构化合物；9.将第一活性成分标准品制成浓度梯度溶液，采用uhplc-swath方法进行检测，绘制对应的活性成分标准曲线；10.根据所述活性成分标准曲线和所述样品质谱数据，分析获得所述检测样品中第一活性成分的绝对含量，并采用峰面积比对法获得第二活性成分的相对含量，所述第二活性成分为所述检测样品中除第一活性成分的其他同类活性成分；11.将所述样品化合物列表和所述样品质谱数据采用分子网络化分析，获得样品化合物分子网络；12.从所述样品化合物分子网络中获取样品化合物的化学信息和质谱信息，并根据所述质谱信息定位所述检测样品中各化合物在所述样品化合物分子网络中的化合物编号；13.根据所述化合物编号，获得与未知结构化合物结构类似的已知结构化合物，并根据所述结构类似的已知结构化合物的化学信息和质谱信息，分析裂解规律，具体为根据所述已知结构化合物的分子量、质谱信息及元素组成，推测出所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，基于与结构类似化合物具有相同的二级质谱碎片，根据所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，并结合未知结构化合物的分子式，推测相对应的未知结构化合物的结构。14.在一实施例中，所述活性成分为多酚、生物碱中的一种或两种。可选地，所述第一活性成分多酚为木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、没食子酸中的一种或多种；可选地，所述第一活性成分生物碱为槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱中的一种或多种。15.在一实施例中，所述提取槟榔中活性成分获得检测样品过程包括：16.将槟榔进行干燥粉碎，采用极性有机溶剂进行超声提取后，离心取上清液获得检测样品。17.在一实施例中，所述多酚采用uhplc-swath方法检测具体为：18.uhplc色谱条件为：色谱柱为thermohypersilgoldc18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，19.柱温为30℃；20.swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。21.在一实施例中，所述生物碱采用uhplc-swath方法具体为：22.uhplc色谱条件为：色谱柱为thermohypersilgoldc18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，23.柱温为30℃；24.swath采集条件：用电喷雾离子源，在正离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。25.在一实施例中，所述化合物数据库包括已知的多酚或/和生物碱的化学信息和对应的质谱数据。26.在一实施例中，所述化学信息包括质荷比和分子量；所述质谱信息包括保留时间和二级碎片。27.本技术又一实施例还提供了一种槟榔的鉴定方法，所述鉴定方法具体包括：28.根据上述组学分析方法获得训练数据；29.构建神经网络模型，以上述训练数据作为输入，经训练深度学习获得鉴定模型；30.将待测槟榔样品进行活性成分提取，并采用uhplc-swath方法检测获得待鉴定质谱数据，将所述待鉴定质谱数据输入鉴定模型，获取鉴定结果。31.在具体的实施例中，所述训练数据为不同产地、不同部位、不同加工方式和不同成熟期槟榔样品的化学信息、质谱信息和定量分析数据；所述定量分析数据为槟榔样品中各化合物的绝对含量或相对含量数据。32.本技术采用uhplc-swath方法进行质谱数据的采集，能够获得更多的二级质谱信息，获得更为丰富的多酚或生物碱类化合物。根据母离子的保留时间和子离子的质荷比进行相对定量，充分利用了swath采集模式的定量能力，相对定量的精确性高，线性范围广。同时避免了转换质谱仪和样品采集两次带来的误差，提高了分析效果，并且swath数据储存了样品的所有信息，有利于数据库的建立、数据的重新分析以及数据的社区共享。利用分子网络技术进行未知化合物的结构分析，利用结构类似物会连接在一个网络上的特性，可以更加高效的鉴定样品中的未知化合物结构；显著降低了系统误差对分析结果的影响，有利于获得更加可信的统计学结果。33.进一步，本技术通过构建神经网络模型，并将组学分析获得的相关数据作为输入，进行模型训练获得相应的槟榔鉴定模型，可以实现快速、高效对槟榔产地进行鉴定，结构准确度可靠、匹配度高。附图说明34.图1为实施例1提供的酚类化合物的标准曲线；a)为木犀草素、b)为槲皮素、c)为表儿茶素、d)为绿原酸、e)为芦丁、f)为没食子酸；35.图2为实施例1提供的不同产地槟榔中酚类物质的定量分析结果图；a)为木犀草素、槲皮素、绿原酸、芦丁、没食子酸的定量分析结果图；b)为表儿茶素的定量分析结果图；c)为对羟基苯甲酸和原儿茶素的相对定量分析结果图；36.图3为实施例2提供的生物碱类化合物的标准曲线；a)为槟榔碱、b)为去甲槟榔碱、c)为槟榔次碱、d)为去甲槟榔次碱；37.图4为实施例2提供的不同产地槟榔中生物碱类物质的定量分析图；a)为槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱和去甲槟榔次碱的定量分析结果图；b)为尼古丁的相对定量分析结果图；38.图5为实施例3提供的芦丁与其类似物的分子网络及化学结构信息图；39.图6为实施例3提供的表儿茶素与其类似物的分子网络及化学结构信息图。具体实施方式40.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。41.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本技术的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。42.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。43.术语解释：44.swath(sequentialwindowedacquisitionofalltheoreticalfragmentions)：swath采集模式是一种新型的ms/ms扫描技术，它将扫描范围划分为以25dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息，是一种全景式、高通量和数据可追溯的质谱技术，是一种数据非依赖性采集技术(dataindependentacquisition,dia)，可对样品中所有可检测到的化合物进行全面检测和定量分析，它在极低浓度下也能采集并提供类mrm的定量信息，即二级定量信息，并具有强大的解卷积功能，可抗一级干扰，得到准确的二级质谱信息，具有通过二级碎片定量的潜力。45.gnps(globalnaturalproductssocialmolecularnetworking，https://gnps.ucsd.edu/)：是一个基于web的质谱生态系统，旨在成为一个开放的数据库，供全球范围共享原始质谱数据，处理或者确定串联质谱数据。46.本技术第一目的提供了一种槟榔组学分析方法；所述组学分析方法具体包括：47.提取槟榔中的活性成分获得检测样品，采用uhplc-swath方法对所述检测样品进行检测获得样品质谱数据；48.对所述样品质谱数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐处理，并与化合物数据库进行比对，获得样品化合物列表，所述样品化合物列表包括已知结构化合物和未知结构化合物；49.将第一活性成分标准品制成浓度梯度溶液，采用uhplc-swath方法进行检测，绘制对应的活性成分标准曲线；50.根据所述活性成分标准曲线和所述样品质谱数据，分析获得所述检测样品中第一活性成分的绝对含量，并采用峰面积比对法获得第二活性成分的相对含量，所述第二活性成分为所述检测样品中除第一活性成分的其他同类活性成分；51.将所述样品化合物列表和所述样品质谱数据采用分子网络化分析，获得样品化合物分子网络；52.从所述样品化合物分子网络中获取样品化合物的化学信息和质谱信息，并根据所述质谱信息定位所述检测样品中各化合物在所述样品化合物分子网络中的化合物编号；53.根据所述化合物编号，获得与未知结构化合物结构类似的已知结构化合物，并根据所述结构类似的已知结构化合物的化学信息和质谱信息，分析裂解规律，具体为根据所述已知结构化合物的分子量、质谱信息及元素组成，推测出所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，基于与结构类似化合物具有相同的二级质谱碎片，根据所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，并结合未知结构化合物的分子式，推测相对应的未知结构化合物的结构。54.其中第一活性成分为已知结构，且能从市面上购买标准品。第二活性成分是检测样品中除第一活性成分外的其他活性成分。55.在具体地实施例中，所述活性成分为多酚、生物碱中的一种或两种。可选地，所述第一活性成分多酚为木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、没食子酸中的一种或多种；可选地，所述第一活性成分生物碱为槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱中的一种或多种。56.在具体示例中，所述提取槟榔中的活性成分获得检测样品过程具体包括：57.将槟榔进行干燥粉碎，采用有机溶剂进行超声提取后，离心取上清液获得检测样品。进一步的，所述干燥过程采用真空冷冻干燥，干燥时长为68-80h；所述有机溶剂具体为甲醇溶液(提取生物碱)和80％丙酮溶液(提取多酚)；58.所述超声提取过程的温度为45-55℃条件下，超声提取55-65h；所述离心过程为10rpm/min离心10～15min。59.在具体示例中，所述多酚采用uhplc-swath方法检测具体为：60.uhplc色谱条件为：色谱柱为thermohypersilgoldc18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，61.柱温为30℃；62.swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。63.在具体的实施例中，所述生物碱采用uhplc-swath方法具体为：64.uhplc色谱条件为：色谱柱为thermohypersilgoldc18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃；65.swath采集条件：用电喷雾离子源，在正离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。66.在具体示例中，所述化合物数据库包括已知的多酚或/和生物碱的化学信息和对应的质谱数据。化合物数据库为自建数据库，通过将现有的多酚、生物碱类物质(尤其是槟榔中含有的多酚、生物碱)以及质谱图进行收集，并分析各化合物的化学信息和质谱数据。67.在具体示例中，所述从所述样品化合物分子网络中获取与未知结构化合物类似的已知结构化合物，并根据已知结构化合物推测未知结构化合物的结构包括：68.从所述样品化合物分子网络中获取样品化合物的化学信息和质谱信息，并根据所述质谱信息定位所述检测样品中各化合物在所述样品化合物分子网络中的化合物编号；69.根据所述化合物编号，获得与未知结构化合物结构类似的已知结构化合物，并根据所述结构类似的已知结构化合物的化学信息和质谱信息，分析裂解规律，推测相对应的未知结构化合物的结构。具体为：分析裂解规律，根据已知结构化合物的分子量、碎片信息及其所含元素，推测出其二级质谱碎片的具体结构，由于与其结构类似的未知化合物与其有着相同的二级质谱碎片，便可以根据此二级质谱碎片信息，结合其分子式，推测未知结构化合物的结构。70.在具体的实施例中，所述化学信息包括质荷比和分子量；所述质谱信息包括保留时间和二级碎片。71.本技术还提供了一种槟榔的鉴定方法，所述鉴定方法具体包括：72.根据上述组学分析方法获得训练数据；73.构建神经网络模型，以所述所述训练数据作为输入，经训练深度学习获得鉴定模型；74.将待测槟榔样品进行多酚或/和生物碱提取，并采用uhplc-swath方法检测获得待鉴定质谱数据，将所述待鉴定质谱数据输入鉴定模型，获取鉴定结果。75.具体为：根据输入的多组训练数据，形成含有多种类别槟榔的数据库，当有新的样本数据输入后，该模型会将样本数据与数据库中的数据进行聚类分析，根据聚类分析得出与数据库中不同类别槟榔样本信息的相似度，得到广槟榔的鉴定结果。76.在具体的实施例中，所述训练数据为不同产地、不同部位、不同加工方式和不同成熟期槟榔样品的化学信息、质谱信息和定量分析数据；所述定量分析数据为槟榔样品中各化合物的绝对含量或相对含量数据。77.以下以具体实施例进行进一步说明。78.实施例179.一种基于丙酮体系的多酚提取与评价方法，包括以下步骤：80.(1)将产自海南、印尼、越南和缅甸的槟榔干果分别放入真空冷冻干燥机中干燥72h,使用粉碎机将其粉碎成粉末状，并称重；将槟榔粉末溶于甲醇溶液中(10％w/v)，在50℃条件下，超声提取60h；10krpm/min离心10～15min，取上层液相，得到多酚样品。每个样品设置3个平行。81.(2)通过uhplc部分和swath部分采集槟榔样品中化合物的uhplc-swath数据，其中：82.uhplc部分：采用thermohypersilgoldc18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相a为超纯水(含0.1％甲酸)，流动相b为乙腈(含0.1％甲酸)，流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃，梯度如表1所示；83.表1色谱梯度84.时间/min02610141520b/％5067679090505085.swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。86.(3)精确称取木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁和没食子酸标准品，用甲醇溶解，制成混合标准液，并逐级稀释成不同浓度范围，随后进行lc-ms测定，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。其中木犀草素、槲皮素、表儿茶素、芦丁和没食子酸的线性范围是0.001～10μg/ml，绿原酸的线性范围是0.01～10μg/ml。87.(4)利用质谱自带软件对步骤(1)得到的uhplc-swath数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐，通过与第一数据库中的多酚类化合物和生物碱类化合物的质谱信息比对鉴定化合物，形成化合物列表，如表2。88.表2化合物列表[0089][0090](5)利用步骤(2)得到的uhplc-swath数据，结合标准曲线，对样品中的木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁和没食子酸进行绝对定量，具体如图2所示。根据表儿茶素的标准曲线，对步骤(4)得到的化合物列表中其他的多酚类化合物进行相对定量，如图2c)中的对羟基苯甲酸和原儿茶素的相对定量分析结果图。[0091]实施例2[0092](1)将产自海南、印尼、越南和缅甸的槟榔干果分别放入真空冷冻干燥机中干燥72h,使用粉碎机将其粉碎成粉末状，并称重；将槟榔粉末溶于甲醇溶液中(10％w/v)，在50℃条件下，超声提取60h；10krpm/min离心10～15min，取上层液相，得到多酚样品。每个样品设置3个平行。[0093](2)通过uhplc部分和swath部分采集槟榔样品中化合物的uhplc-swath数据，其中：[0094]uhplc部分：采用thermohypersilgoldc18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相a为超纯水(含0.1％甲酸)，流动相b为甲醇(含0.1％甲酸)，流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃，梯度如表1所示。[0095]swath采集条件：用电喷雾离子源，在正离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。[0096](3)精确称取槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲基槟榔次碱标准品，用甲醇溶解，制成混合标准液，并逐级稀释成不同浓度范围，随后进行uhplc-swath测定，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，具体详见图3。其中槟榔碱的线性范围是0.0125～0.25μg/ml，去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲槟榔次碱的线性范围是0.0125～0.5μg/ml。[0097](4)利用质谱自带软件对步骤(1)得到的uhplc-swath数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐，通过与第一数据库中的多酚类化合物和生物碱类化合物的质谱信息比对鉴定化合物，形成化合物列表，如表3。[0098]表3化合物列表[0099][0100][0101](5)利用步骤(2)得到的uhplc-swath数据，结合标准曲线，对样品中的槟榔碱、去甲槟榔碱、槟榔次碱和去甲槟榔次碱进行绝对定量，具体详见图4，根据槟榔碱的标准曲线，对步骤(4)得到的化合物列表中其他的生物碱类化合物进行相对定量，如图4b)所示。[0102]实施例3[0103]一种基于uhplc-swath-ms/ms和分子网络的道地药材广槟榔的组学分析方法，包括以下步骤：[0104](1)将产自海南、印尼、越南和缅甸的槟榔干果分别放入真空冷冻干燥机中干燥72h,使用粉碎机将其粉碎成粉末状，并称重；将槟榔粉末溶于甲醇溶液中(10％w/v)，在50℃条件下，超声提取60h；10krpm/min离心10～15min，取上层液相，得到多酚样品。每个样品设置3个平行。[0105](2)通过uhplc部分和swath部分采集槟榔样品中化合物的uhplc-swath数据，其中：[0106]uhplc部分：采用thermohypersilgoldc18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相a为超纯水(含0.1％甲酸)，流动相b为乙腈(含0.1％甲酸)，流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃，梯度由表1所示。[0107]swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。[0108](3)将样品的uhplc-swath原始数据上传到gnps网站，将quantificationtablesource(量表源，上传文件所需设置的参数之一)设置为ms-dial(质谱数据处理软件)，其余设置为默认设置，将gnps发回邮箱中的文件下载后，在cytoscape(可以生成分子网络的软件)软件中打开，得到样品的分子网络图。以芦丁、表儿茶素为列，二者及其类似物的分子网络及化学结构信息图如图5、6所示。[0109](4)利用ms-dial软件，根据样品列表中各化合物的质荷比、保留时间和二级碎片信息定位分子网络中的化合物编号，进而找到分子网络中已知化合物及其类似物的位置，在确认类似物的质荷比、二级碎片信息后，再根据已知化合物信息，推测其化学结构，具体为根据已知结构化合物的分子量、碎片信息及其所含元素，推测出其二级质谱碎片的具体结构，由于与其结构类似的未知化合物与其有着相同的二级质谱碎片，便可以根据此二级质谱碎片信息，结合其分子式，推测相对应的未知结构化合物的结构。[0110]实施例4[0111]一种基于人工神经网络技术的道地药材广槟榔的鉴定方法，包括以下步骤：[0112](1)将产自海南、印尼、越南和缅甸的槟榔干果分别放入真空冷冻干燥机中干燥72h,使用粉碎机将其粉碎成粉末状，并称重；将槟榔粉末溶于甲醇溶液中(10％w/v)，在50℃条件下，超声提取60h；10krpm/min离心10～15min，取上层液相，得到多酚和生物碱样品。每个样品设置3个平行。[0113](2)通过uhplc部分和swath部分采集槟榔样品中多酚类化合物的uhplc-swath数据，其中：[0114]uhplc部分：采用thermohypersilgoldc18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相a为超纯水(含0.1％甲酸)，流动相b为乙腈(含0.1％甲酸)，流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃，梯度由表1所示。[0115]swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。[0116](3)通过uhplc部分和swath部分采集槟榔样品中生物碱类化合物的uhplc-swath数据，其中：[0117]uhplc部分：采用thermohypersilgoldc18柱(100*2.1mm,1.9μm)，流动相a为超纯水(含0.1％甲酸)，流动相b为甲醇(含0.1％甲酸)，流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃，梯度由表1所示；[0118]swath采集条件：用电喷雾离子源，在正离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z。源温度500℃，碰撞能30±10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms×20+50ms＝1100ms。[0119](4)将步骤(2)和(3)获得的uhplc-swath数据输入到ann(人工神经网络)程序进行道地药材广槟榔的鉴定模型的构建：[0120]在absciextripletof5600+(质谱型号)配套的os(质谱数据分析软件)中，提取不同样品的swath-ms/ms峰面积；之后通过mzmine或mzmine2(组学数据处理软件)软件(mzmine.github.io)处理数据，得到siriusmgf(文件格式)文件；按照gnps中的“基于特征峰的分子网络(featurebasedmolecularnetwork,fbmn)”流程(https://gnps.ucsd.edu/proteosafe/static/gnps-splash.jsp)，从mzmine中导出用于构建fbmn的文件之后，用样品中各个化合物的特征子离子峰面积替换相应的ms1特征峰面积，并通过gnps构建fbmn，从结果文件夹中得到qiime2_table.qza，qiime2_metadata.tsv(用于导入ann程序的文件)；即：ann程序所需的文件；最后登录gnps，按照ann工作流程上传文件，进行道地药材广槟榔的鉴定模型的构建。[0121](5)将未知样品的uhplc-ms/ms数据输入到构建完成的鉴定模型中，即可获得道地药材广槟榔的鉴定结果。[0122]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。[0123]以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。当前第1页12
技术特征：
1.一种槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述组学分析方法包括：提取槟榔中的活性成分获得检测样品，采用uhplc-swath方法对所述检测样品进行检测获得样品质谱数据；对所述样品质谱数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐处理，并与化合物数据库进行比对，获得样品化合物列表，所述样品化合物列表包括已知结构化合物和未知结构化合物；将第一活性成分标准品制成浓度梯度溶液，采用uhplc-swath方法进行检测，绘制对应的活性成分标准曲线；根据所述活性成分标准曲线和所述样品质谱数据，分析获得所述检测样品中第一活性成分的绝对含量，并采用峰面积比对法获得第二活性成分的相对含量，所述第二活性成分为所述检测样品中除第一活性成分的其他同类活性成分；将所述样品化合物列表和所述样品质谱数据采用分子网络化分析，获得样品化合物分子网络；从所述样品化合物分子网络中获取样品化合物的化学信息和质谱信息，并根据所述质谱信息定位所述检测样品中各化合物在所述样品化合物分子网络中的化合物编号；根据所述化合物编号，获得与未知结构化合物结构类似的已知结构化合物，并根据所述结构类似的已知结构化合物的化学信息和质谱信息，分析裂解规律，具体为根据所述已知结构化合物的分子量、质谱信息及元素组成，推测出所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，基于与结构类似化合物具有相同的二级质谱碎片，根据所述已知机构化合物二级质谱碎片结构，并结合未知结构化合物的分子式，推测相对应的未知结构化合物的结构。2.根据权利要求1所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述提取槟榔中的活性成分获得检测样品的过程包括：将槟榔进行干燥粉碎，采用极性有机溶剂进行超声提取后，离心取上清液获得所述检测样品。3.根据权利要求1所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述活性成分包括多酚和生物碱中的一种或两种；可选地，所述第一活性成分多酚为木犀草素、槲皮素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、没食子酸中的一种或多种；可选地，所述第一活性成分生物碱为槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述多酚采用uhplc-swath方法检测包括：uhplc色谱条件为：色谱柱为thermo hypersil gold c18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃；swath采集条件：用电喷雾离子源，在负离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z；源温度500℃，碰撞能30
±
10ev，ms1采集范围为
100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms
×
20+50ms＝1100ms。5.根据权利要求3所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述生物碱采用uhplc-swath方法进行检测具体为：uhplc色谱条件为：色谱柱为thermo hypersil gold c18；流动相a为0.1％甲酸水溶液；流动相b为含0.1％甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱条件为：0～2min，50％～67％b；2～6min，67％b；6～10min，67％～90％b；10～14min，90％b；14～15min，90％～50％b；15～20min，50％b；流速为0.3ml/min，进样量为1μl，柱温为30℃；swath采集条件：用电喷雾离子源，在正离子模式下进行数据采集；毛细管电压：3kv，毛细管温度：350℃；加热器温度：50℃；喷射电压：3.00kv；脱溶剂和锥孔气均为氮气，脱溶剂气流速为600l/h，扫描范围为70～1000m/z；源温度500℃，碰撞能30
±
10ev，ms1采集范围为100到1000da，ms1累计时间为150ms；按照45da/窗口将ms1的采集范围划分为20个窗口，每个窗口的ms2累积时间设置为45ms；周期时间为150ms+45ms
×
20+50ms＝1100ms。6.根据权利要求3所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述化合物数据库包括已知结构的多酚或/和生物碱的化学信息和对应的质谱数据。7.根据权利要求1所述的槟榔的组学分析方法，其特征在于，所述化学信息包括质荷比和分子量；所述质谱信息包括保留时间和二级碎片。8.一种槟榔的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法具体包括：根据权利要求1-7任一项所述的组学分析方法获得多组训练数据；将所述训练数据采用神经网络模型进行特征提取并进行深度学习，再进行聚类分析获得鉴定模型；将待测槟榔样品进行活性成分提取，并采用uhplc-swath方法检测获得待鉴定质谱数据，将所述待鉴定质谱数据输入鉴定模型，获取鉴定结果。9.根据权利要求8所述的槟榔的鉴定方法，其特征在于，所述训练数据包括不同产地、不同部位、不同加工方式和不同成熟期槟榔样品中各化合物的化学信息、质谱信息和定量分析数据。10.根据权利要求9所述的槟榔的鉴定方法，其特征在于，所述定量分析数据为槟榔样品中各化合物的绝对含量或相对含量数据。

技术总结
本申请涉及一种槟榔的组学分析方法，具体包括：提取槟榔中的活性成分，采用UHPLC-SWATH方法检测获得样品质谱数据；将样品质谱数据进行去卷积、色谱峰识别和色谱峰对齐，并与第一数据库进行比对获得化合物列表；取多个第一活性成分标准品配制成浓度梯度，检测绘制标准曲线；根据标准曲线和样品质谱数据，分析获得检测样品中第一活性成分的绝对含量，采用峰面积比对法获得第二活性成分相对含量；将化合物列表和样品质谱数据采用分子网络化分析，再根据已知结构化合物的化学信息和质谱信息推断检测样品中的未知化合物结构。本申请兼顾了数据采集的覆盖性和高效性，能用于定量分析，且提高了槟榔防伪溯源模型的有效性和可信性。高了槟榔防伪溯源模型的有效性和可信性。高了槟榔防伪溯源模型的有效性和可信性。


技术研发人员：郭焘 匡凤姣 徐勇将 赵佳亮 康宗华 匡凤军 冯彦勇 蒋富强 刘群 匡杨 郭卫群
受保护的技术使用者：湖南口味王集团有限责任公司
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/7/19