一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用与流程

1.本发明涉及生物化工技术领域，尤其是涉及一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用。


背景技术：

2.目前，所有乳制品生产企业严禁在产品中添加β-内酰胺酶，β-内酰胺酶添加到乳与乳制品中会掩蔽抗生素。β-内酰胺类抗生素是在牛乳生产中应用最广泛的抗生素，用于治疗牛乳腺炎和其他细菌感染性疾病。而使用抗生素药物后一定时间内的乳汁，不得作为供人食用的原料。
3.由于β-内酰胺类抗生素的滥用，不法分子通过添加β-内酰胺酶分解内酰胺类抗生素从而掩盖抗生素的过量使用。然而，检测生乳中β-内酰胺酶的残留含量，可以打击拮抗剂对抗生素残留含量的遮蔽，β-内酰胺酶的抑制剂从而诞生。目前，有几种β-内酰胺衍生物被报道为β-内酰胺酶抑制剂，但在临床上具有效果仅有克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦，应用更为广泛的是舒巴坦。
4.舒巴坦（sulbactam），其分子量为347，是一种半合成的青霉酸砜，是含有6-氨基青霉酸衍生的β-内酰胺环。舒巴坦是多种细菌β-内酰胺酶的不可逆抑制剂，对革兰阳性及阴性菌（除绿脓杆菌外）所产生的β-内酰胺酶均有抑制作用。
5.当舒巴坦与某些青霉素或头孢菌素联合使用时，产生的协同作用对许多产生β-内酰胺酶的细菌起到抑制作用，从而扩大了这些抗生素的活性谱。此外，它也是引起第三代头孢菌素耐药性的诱导酶抑制剂。当舒巴坦和这些抗生素扩大了活性谱后，也提高了其在治疗各种革兰氏阳性、厌氧和革兰氏阴性感染方面的效果。
6.目前，舒巴坦的检测方法主要有高效液相色谱串联质谱法，然而，仪器检测操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。对于免疫分析方法来说，具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员要求相对低的优点，适用于大量样品的快速检测。因此，通过免疫方法可以实现对舒巴坦含量的高效、快速检测。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用，实现舒巴坦的精准检测，与其他药物无交叉反应。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种舒巴坦半抗原，舒巴坦半抗原的化学式结构如下：。
9.一种舒巴坦半抗原的合成方法，步骤如下：
s1、准确称取舒巴坦酸，溶解至二氯甲烷中，然后依次加入4-dmap、马来酸酐，50℃反应48h；s2、通过液质检测步骤s1得到的混合液，干燥处理后加入5ml水，再使用2mol/l hcl调节溶液ph，通过乙酸乙酯萃取后，合并有机相；s3、将步骤s2得到的有机相干燥后，得到粗的半抗原；s4、纯化：将步骤s3得到的粗产物在正相flash柱进行极性纯化，即可。
10.优选地，步骤如下：s1、准确称取舒巴坦酸200mg，溶解至4ml二氯甲烷中，依次加入4-dmap 62mg、马来酸酐56mg，50℃反应48小时；s2、液质检测、干燥处理后，加入5ml水，用2mol/l hcl调节ph至3，乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥后，得到粗的半抗原230mg；s3、纯化：确定粗半抗原极性为pe:ea(1:1)，正相flash在此极性下纯化，得到80mg纯品，纯度为93.5%。
11.因此，本发明采用上述一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用，实现舒巴坦的精准检测，与其他药物无交叉反应。
12.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
13.图1是舒巴坦半抗原的lc图谱；图2是舒巴坦半抗原的ms图谱；图3是舒巴坦半抗原的nmr图谱；图4是胶体金检测试剂示意图。
具体实施方式
14.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
15.本公开使用的所有术语（包括技术术语或者科学术语）与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
16.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
17.本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
18.其中，舒巴坦结构如下：
19.舒巴坦结构位点偶联困难，因此本发明选择舒巴坦酸进行偶联。
20.舒巴坦酸结构如下：
21.舒巴坦半抗原结构如下：
22.实施例一舒巴坦半抗原的合成，其具体操作过程如下：s1、准确称取舒巴坦酸200mg，溶解至4ml二氯甲烷中，依次加入4-dmap 62mg、马来酸酐56mg，50℃反应48小时。
23.s2、将步骤s1所得的混合液依次经液质检测、干燥处理后，加入5ml水，用2mol/l hcl调节ph至3，再通过乙酸乙酯萃取后合并有机相，并将有机相干燥，得到粗的半抗原230mg。
24.s3、纯化：确定粗半抗原极性为pe:ea(1:1)，正相flash在此极性下纯化，得到80mg纯品，纯度为93.5%，如图1。根据ms图谱得出，分子离子峰为m/z 332.15[m+h]
+
，即分子量为331，与合成的舒巴坦半抗原c
12h13
no8s分子量一致，如图2。根据nmr图谱得出，除去溶剂峰、水峰和无法积分的杂质小峰后，h的数量为13，对图谱进行分析：1h nmr (400 mhz, methanol-d4) δ 6.73 (s, 2h), 4.44 (s, 1h), 4.25 (d, j = 42.2 hz, 1h), 3.68 (s, 1h), 3.32 (s, 1h), 1.47 (s, 6h)。与合成的舒巴坦半抗原c
12h13
no8s分子结构一致，如图3。
[0025]
其反应路线如下：
[0026]
实施例二包被舒巴坦抗原bsa载体的偶联，其操作如下：s1、称取10mg纯半抗原，溶解至1ml dmf中，缓慢加入21mgnhs、58mgedc，室温搅拌过夜。
[0027]
s2、称取bsa 60mg，溶解至1ml 0.01mol/l，ph为7.4的pbs缓冲液中，搅拌均匀，缓慢滴加至活化好的半抗原溶液中，室温搅拌3h。用0.01mol/l ph为7.2的pbs透析，期间2h换一次水，透析48h，-20℃保存。
[0028]
其反应路线如下：
[0029][0030]
包被舒巴坦抗原ova载体同理如上。
[0031]
实施例三免疫舒巴坦抗原bsa载体的偶联，其操作如下：s1、称取5mg纯半抗原，溶解至500μl无水甲醇中，滴加30μl三乙胺，室温搅拌30min；s2、加入60μl氯甲酸异丁酯，搅拌1h；s3、称取30mgbsa，缓慢加入至步骤s2所得溶液，搅拌4h。
[0032]
s4、用0.01mol/l ph为7.2的pbs透析，期间2h换一次水，透析48h，-20℃保存。
[0033]
实施例四单克隆抗体制备动物免疫：采用6周的balb/c小鼠作为免疫动物，用舒巴坦与bsa的抗原作为免疫原，免疫剂量为80μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔皮下多点注射，间隔三周后取同等剂量的免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，4天后取脾细胞。
[0034]
细胞融合与克隆：取免疫balb/c小鼠脾细胞，按4:1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用显微克隆法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0035]
细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5
×
106个/ml的
细胞悬液，分装于冻存管，在-70℃超低温冰箱中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速溶，离心去除冻存液后，移入培养瓶中培养。
[0036]
单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将balb/c 8周龄小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5
×
106个/只15天后取腹水。用亲和层析法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
[0037]
实施例五舒巴坦半抗原及单克隆抗体的应用一、舒巴坦胶体金检测试剂的制备，包括以下步骤：（1）胶体金的制备取1%（质量百分比）氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01%（质量百分比）的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1%（质量百分比）柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充纯水至原体积。
[0038]
（2）胶体金标记舒巴坦单克隆抗体的制备调节胶体金溶液ph值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入舒巴坦单克隆抗体，1小时后加入抗体量相当的peg，充分反应30min后加入抗体量相当的bsa，加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30 min，获得均一性的金标抗体沉淀，再加pbs重悬备用，得到胶体金标记舒巴坦单克隆抗体。
[0039]
（3）胶体金检测试剂的制备如图4，在硝酸纤维素膜上喷涂舒巴坦包被抗原溶液形成检测线t线，采用喷涂羊抗鼠igg形成控制线c线。所述检测线和控制线相互平行，两者距离0.5cm。然后，在底板上，沿同一方向依次将样品垫、喷涂有舒巴坦免疫抗原的检测线t线和喷涂有羊抗鼠igg的控制线c线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连。
[0040]
其中，检测线靠近样品垫，所述控制线靠近吸水纸，将粘好的所述检测试纸切成等宽度的试纸条；反应杯内加入胶体金标记舒巴坦单克隆抗体，冻干；将所述反应杯及试纸条密封干燥保存。
[0041]
二、样品检测（1）样品中舒巴坦的检测：方法为：取新鲜鸡组织样品绞碎，舒巴坦残留经乙腈和丙酮提取，正己烷除脂肪，取样置于反应杯中，室温孵育10分钟，随后插入试纸条，室温孵育3分钟。取出试纸条，轻轻刮除试海绵垫，进行结果判读。若t线与c线同时显示紫红色条带，则结果为阴性；若t线颜色比c线浅或c线显色而t线不显色，则结果为阳性；若c线、t线均不显色，则检测试剂已失效。
[0042]
（2）舒巴坦胶体金检测试剂的灵敏度检测：通过加标实验，发现本发明中舒巴坦胶体金检测装置的灵敏度可达50ppb，cv值小于15%。
[0043]
（3）舒巴坦胶体金检测试剂的特异性检测：在阴性的鱼肉组织中，分别加入克拉维酸、四环素、青霉素、头孢匹林、红霉素、林可霉素、泰乐菌素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺二甲嘧啶各200ppb，进行检测发现，检测结果均为阴性，表明舒巴坦有优异的选择性，与以上添加药物无交叉反应。
[0044]
因此，本发明采用上述一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用，实现舒巴坦的精
准检测，与其他药物无交叉反应。
[0045]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种舒巴坦半抗原，其特征在于，舒巴坦半抗原的化学式结构如下：。2.一种舒巴坦半抗原的合成方法，其特征在于，步骤如下：s1、准确称取舒巴坦酸，溶解至二氯甲烷中，然后依次加入4-dmap、马来酸酐，50℃反应48h；s2、通过液质检测步骤s1得到的混合液，干燥处理后加入5ml水，再使用2mol/l hcl调节溶液ph，通过乙酸乙酯萃取后，合并有机相；s3、将步骤s2得到的有机相干燥后，得到粗的半抗原；s4、纯化：将步骤s3得到的粗产物在正相flash柱进行极性纯化，即可。3.根据权利要求2所述的一种舒巴坦半抗原的合成方法，其特征在于，步骤如下：s1、准确称取舒巴坦酸200mg，溶解至4ml二氯甲烷中，依次加入4-dmap 62mg、马来酸酐56mg，50℃反应48小时；s2、液质检测、干燥处理后，加入5ml水，用2mol/l hcl调节ph至3，乙酸乙酯萃取，合并有机相，干燥后，得到粗的半抗原230mg；s3、纯化：确定粗半抗原极性为pe:ea(1:1)，正相flash在此极性下纯化，得到80mg纯品，纯度为93.5%。

技术总结
本发明公开了一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用，舒巴坦半抗原的化学式结构如下：。本发明采用上述的一种舒巴坦半抗原及其合成方法和应用，实现舒巴坦的精准检测，与其他药物无交叉反应。与其他药物无交叉反应。与其他药物无交叉反应。


技术研发人员：赵荣茂 巩玉洁 石强 杨雨
受保护的技术使用者：北京纳百生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/7/19