用于肿瘤靶向成像和光动力治疗的化合物及其合成方法和应用与流程

1.本发明属于生物成像与抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种可用于近红外荧光成像、肿瘤手术导航且具有聚集诱导发光特性的荧光分子及其制备方法。


背景技术：

2.荧光成像技术具有检测灵敏度高、经济便捷、无辐射危害等优点，在生物医学领域具有广泛的应用，但受限于较低的组织穿透深度。近红外荧光(nir)极大克服了传统荧光(400-700nm)面临的组织吸收、散射及自发荧光干扰，在活体成像中可实现更高的组织穿透深度和空间分辨率，被视为最具潜力的下一代活体荧光影像技术。通过偶联特异性的肿瘤靶向基团，构成可用于肿瘤成像的荧光导航探针。在乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等癌症的特异性成像中，成像信噪比高且边界清晰，可指导医生在可视化图像下完成肿瘤切除，极大地提高了肿瘤清除率，降低复发概率，显著延长患者生存期甚至完全治愈肿瘤。
3.目前广泛使用的荧光光敏剂材料如卟啉衍生物这种传统有机小分子，由于其疏水性和刚性平面结构，在高浓度和聚集状态下会发生荧光强度急剧下降的情况，这种现象被称为聚集荧光淬灭(aggregation-caused quenching，acq)。而具有aie(aggregation-induced emission，聚集诱导发光)特性的荧光分子，由于其独特的非平面扭转结构，在溶液中以单分子状态存在时不发射荧光，而在分子聚集状态下反而呈现高荧光亮度，这种与acq截然相反的特性使其具有可观的应用前景，但目前广泛报道的多数aie类荧光分子发射波长较低(400-700nm)，组织穿透深度有限，易受背景荧光干扰。相较而言，近红外一区(750-950nm)荧光分子成像有着更高的分辨率与灵敏性，在成像导航领域优势明显。因此，在荧光分子设计中结合aie独特性能与近红外一区发射波长并应用于肿瘤手术导航具有明确应用前景和重大现实意义。
4.202210728466.8的发明《用于光动力治疗的可降解型荧光分子、制备方法与应用》告知了荧光分子的化学结构式为
5.式中，r为碳原子数为1-30的直链或支链烷基，r 1为氢或碳原子数为1-30的直链或支链烷基，r 1取对位。该荧光分子lm由于硫原子的重原子效应，能提高耦合常数，有利于激子的系间窜越，提高荧光分子lm生成活性氧的产率，光动力治疗效果好。荧光分子lm骨架含有碳碳双烯键，基于荧光分子lm的纳米粒子用于光动力治疗后，可被hclo降解，排出体外，减少其在生物体的残留。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种可用于近红外一区荧光成像且具有聚集诱导发光特性的荧光分子及其制备方法和用途。
7.即，本发明的首要目的在于提供一种可用于近红外一区荧光成像且具有聚集诱导发光特性的荧光分子；另一目的在于提供上述荧光分子的制备方法；再一目的在于提供上述荧光分子在制备荧光成像手术导航及光敏剂中的应用。
8.为解决上述技术问题，本发明提供一种具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，所述荧光分子具有式(i)结构：
[0009][0010]
结构式中，r1为碳原子数为1-20的直链或支链烷基，r2为氢、碳原子数为1-20的直链或支链烷基和碳原子数为1-20的直链或支链烷氧基中的一种，r3为氢、芳代乙烯基、碳原子数为1-20的直链或支链烷基、碳原子数为1-20的直链或支链烷氧基和碳原子数为1-20的直链羧基中的一种。
[0011]
所述荧光分子命名为eco-ax120系列，x为1，4，5，a，b，d；其是可用于红外一区荧光成像且具有聚集诱导发光特性的荧光分子。
[0012]
作为本发明的具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子的改进，式(ⅰ)中：
[0013]
r1为碳原子数为1-10的直链或支链烷基，r2为氢、碳原子数为1-10的直链或支链烷基和碳原子数为1-10的直链或支链烷氧基中的一种，r3为氢、芳代乙烯基、碳原子数为1-10的直链或支链烷基、碳原子数为1-10的直链或支链烷氧基和碳原子数为1-10的直链羧基中的一种。进一步优选的，r1为正基己，r2为氢、甲基或甲氧基中的一种，r3为氢、甲基、甲氧基、丙酸基或三苯乙烯基中的一种。
[0014]
对应eco-ax120系列荧光分子的分子结构式为：
[0015][0016][0017]
说明：
[0018]
eco-a1120，r1为直链己基，r2为氢；r3为氢；
[0019]
eco-a4120，r1为直链己基，r2为甲氧基；r3为甲氧基；
[0020]
eco-a5120，r1为直链己基，r2为甲基；r3为甲基；
[0021]
eco-aa120，r1为直链己基，r2为甲基；r3为三苯基乙烯基；
[0022]
eco-ab120，r1为直链己基，r2为甲基；r3为丙酸基；
[0023]
eco-ad12，r1为直链己基，r2为甲氧基；r3为丙酸基。
[0024]
本发明还同时提供了上述具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子的制备方法，包括以下步骤：
[0025]
1)、制备化合物1：
[0026]
4，9-二溴萘并噻二唑与2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷在四(三苯基磷)钯催化和碳酸钾碱性环境作用下发生suzuki偶联反应，于(100
±
10)℃下反应12-24h；
[0027]
4，9-二溴萘并噻二唑、2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷、四(三苯基磷)钯、碳酸钾的摩尔比为1：2-3：0.03-0.1：10-20；
[0028]
反应所得物进行纯化后得到化合物1；
[0029][0030]
2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷选用4-己基-2-噻吩硼酸频哪醇酯；
[0031]
2)、制备化合物2：
[0032]
化合物1在四氢呋喃溶剂中被n-溴代丁二酰亚胺溴化，于室温下反应5
±
1h，化合物1与n-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：2-3；
[0033]
反应所得物进行纯化后得到得到化合物2；
[0034][0035]
3)、化合物5或者苯胺类化合物与化合物2在四(三苯基磷)钯催化和碳酸钾碱性环境作用下发生suzuki偶联反应，在100
±
10℃下反应12-24h，
[0036]
化合物2、化合物5/三苯胺类化合物、四(三苯基磷)钯、碳酸钾的摩尔比为1：2-4：0.03-0.1：10-20；
[0037]
苯胺类化合物为4-(二苯基氨基)苯硼酸、4-甲氧基-n-(4-甲氧基苯基)-n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)苯胺；
[0038]
反应所得物进行纯化后得到具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子或者得到荧光分子前期产物。
[0039]
说明：荧光分子为eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120；荧光分子前期产物为eco-ab120、eco-ad120的前期产物。
[0040]
作为本发明制备方法的改进，将荧光分子前期产物制备成荧光分子：
[0041]
向荧光分子前期产物加入氢氧化钠进行反应，70
±
10℃反应10
±
1h；
[0042]
荧光分子前期产物：氢氧化钠的摩尔比为1:(20
±
1)；
[0043]
反应所得物进行纯化后，得到具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子(eco-ab120、eco-ad120)。
[0044]
作为本发明制备方法的进一步改进，化合物5的制备方法为包括以下步骤：
[0045]
①
、将作为原料的化合物3或者4，4'-二甲基三苯胺在氯仿溶剂中被n-溴代丁二酰亚胺溴化得到化合物4；反应温度为冰浴～室温，反应时间为6-21h；
[0046]
原料与n-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：1-1.5；
[0047][0048]
②
、化合物4与联硼酸频那醇酯在三(二亚苄基丙酮)二钯催化，1,1'-双(二苯基膦)二茂铁作为配体和醋酸盐(醋酸钠、醋酸钾)碱性环境作用下与发生miyaura硼化反应，在100
±
10℃下反应12-24h；
[0049]
化合物4、联硼酸频那醇酯、三(二亚苄基丙酮)二钯、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、醋酸盐的摩尔比为1：1-1.5：0.01-0.06：0.03-0.04：2-4；
[0050]
联硼酸频那醇酯为双(频哪醇合)二硼；
[0051]
反应所得物进行纯化后得到化合物5；
[0052][0053]
作为本发明制备方法的进一步改进，化合物3的制备方法为包括以下步骤：
[0054]
1-r3取代基-4-溴苯与4-r2取代基-n-苯基苯胺在醋酸钯催化，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦作为配体和碳酸铯碱性环境作用下发生c-n偶联反应，在(100
±
10)℃下反应12-24h；1-r3取代基-4-溴苯、4-r2取代基-n-苯基苯胺、醋酸钯、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、碳酸铯的摩尔比为1：1-1.5：0.05-0.15；0.1-0.2；1.5-3；
[0055]
反应所得物进行纯化后得到化合物3；
[0056][0057]
1-r3取代基-4-溴苯为1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯、对溴苯丙酸乙酯；
[0058]
4-r2取代基-n-苯基苯胺为4-甲基-n-苯基苯胺、4-甲氧基二苯胺。
[0059]
作为本发明制备方法的进一步改进：
[0060]
化合物1的合成中：4，9-二溴萘并噻二唑的摩尔量与1，4-二氧六环的体积比为1mmol:(15-30)ml。
[0061]
化合物2的合成中，化合物1的摩尔量与四氢呋喃的体积比为1mmol:(20-40)ml。
[0062]
化合物3的合成中，1-r3取代基-4-溴苯的摩尔量与二甲苯的体积比为1mmol:(3-6ml)。
[0063]
化合物4的合成中，化合物3的摩尔量与氯仿的体积比为1mmol:(8-12)ml。
[0064]
化合物5的合成中，化合物4的摩尔量与1，4-二氧六环的体积比为1mmol:(5-10)ml。
[0065]
eco-ax120的合成中，4，9-二溴萘并噻二唑的摩尔量与1，4-二氧六环的体积比为1mmol:(30-50)ml。
[0066]
本发明还同时提供了上述具有聚集诱导发光特性的近红外一区成像荧光分子在肿瘤光动力治疗光敏剂和/或在肿瘤手术导航显影剂中的应用。
[0067]
作为本发明应用的改进：
[0068]
作为在肿瘤光动力治疗光敏剂的应用：将eco-ax120系列荧光分子与两亲性聚合物在有机溶剂中溶解，再向体系中加入超纯水，超声，促进体系分散均匀，随后除去有机溶剂，从而得到水溶性荧光分子纳米颗粒，所述荧光分子纳米颗粒的表观浓度≥20μg/ml；
[0069]
作为在肿瘤手术导航显影剂中的应用：所述的荧光分子可以用于原位乳腺癌等癌症的成像与辅助治疗药剂。
[0070]
eco-ax120系列荧光分子的具体制备路线如下：
[0071][0072]
本发明的用于光动力治疗的荧光分子：在激发光(520nm-550nm)的照射下，所述荧光分子既能够通过电子转移途径生成众多活性氧物种进行i型光动力治疗过程，也能通过能量转移途径生成单线态氧进行ii型光动力治疗过程。
[0073]
上述合成的可用于红外一区荧光成像，且具有光动力治疗效用的荧光分子在制备肿瘤手术导航药与光动力治疗光敏剂中的应用。本发明还同时提供了上述具有聚集诱导发光特性的近红外一区成像荧光分子在肿瘤手术导航显影剂中的应用。
[0074]
作为在肿瘤光动力治疗光敏剂的应用：将eco-ax120系列荧光分子与两亲性聚合物在有机溶剂中溶解，再向体系中加入超纯水，超声，促进体系分散均匀，随后除去有机溶剂，从而得到水溶性荧光分子纳米颗粒，所述荧光分子纳米颗粒的表观浓度≥20μg/ml。
[0075]
作为在肿瘤手术导航显影剂中的应用：所述的荧光分子可以用于原位乳腺癌等癌症的成像与辅助治疗药剂。
[0076]
进一步地，所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、和二甲基亚砜中的一种。
[0077]
进一步优选的，所述有机溶剂选择四氢呋喃。
[0078]
进一步地，所述两亲性聚合物为f127(乙氧基-丙氧基形成的两性三嵌段聚合物)、dspe-mpeg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)或dspe-mpeg5000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000)。
[0079]
进一步优选的，所述两亲性聚合物选择dspe-mpeg2000。
[0080]
进一步，所述采用eco-ax120系列荧光分子制备的纳米药物可以用于乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等癌症的成像与治疗药物。
[0081]
本发明的荧光分子相对于202210728466.8而言：本发明中的eco-ax120系列荧光分子以采用具有较强电子接受能力的萘并噻二唑作为核心，三芳胺类作为给电子体，3位烷基取代噻吩作为π桥构筑d-π-a-π-d分子结构；而202210728466.8中的lm荧光分子则以芴并苯噻吩砜为核心，三芳胺类作为给电子体，双键作为π桥构筑分子结构。本发明中的eco-ax120系列荧光分子具有较高的荧光绝对亮度、极大的斯托克斯位移以及近红外一区(》800nm)荧光发射能力，主要应用方向为荧光手术导航领域，兼具光动力辅助治疗的应用潜
力。
[0082]
本发明的eco-ax120系列荧光分子，与现有技术相比具有如下优点和有益效果：
[0083]
1.本发明的eco-ax120系列荧光分子由于扭转的分子构型，可以避免分子聚集堆叠导致的聚集荧光猝灭(acq)现象，具有显著的聚集诱导发光(aie)特性，在聚集状态下荧光不仅无淬灭效应，亮度反而进一步增强；因此提升了生物体内荧光成像亮度。eco-ax120系列荧光分子的聚集诱导发光特性在实验3中予以测定，结果在实施例结论部分与图13-18中体现。
[0084]
2.本发明的eco-ax120系列荧光分子发射波长处于近红外一区(》800nm)，相较目前广泛报道的如四苯乙烯类等其他aie类荧光分子具有明显更高的发射波长，因此可避免生物组织背景荧光的干扰，并提升组织穿透性。eco-ax120系列荧光分子的紫外吸收与荧光发射峰值在实验1中予以测定，结果在图7-12中体现。
[0085]
3.本发明的eco-ax120系列荧光分子在实现高发射波长的同时具有较高的荧光绝对亮度(》20％)，在手术导航中生物组织成像边界清晰易分辨，信噪比高。eco-ax120系列荧光分子的量子产率在实验2中予以测定，结果在实施例结论部分体现。
[0086]
4.本发明的eco-ax120系列荧光分子具有极大的斯托克斯位移(约270nm)，激发波长范围与发射波长范围分离度高，可有效减小激发光对发射光的重叠干扰。eco-ax120系列荧光分子的紫外吸收与荧光发射峰值在实验1中予以测定，斯托克斯位移情况在图7～12中体现。
[0087]
5.本发明的eco-ax120系列荧光分子以采用具有较强电子接受能力的萘并噻二唑作为核心，三芳胺类作为给电子体，3位烷基取代噻吩作为π桥，构筑d-π-a-π-d分子结构，促进了分子homo-lumo轨道分离度，减小了单重激发态与三种激发态之间的能级差，从而加强了激子的系间窜越，提高了荧光分子生成活性氧的产率，具有潜在的光动力治疗效用。eco-ax120系列荧光分子的ros生成能力在实验4中予以测定，结果在实施例结论部分和图19、图20中体现。
[0088]
综上，本发明荧光分子提供了手术导航和光动力治疗的新思路，生物毒性低、发光波长长、受背景荧光干扰小、组织穿透性强，合成条件简便温和，易于提纯，应用前景广泛。
附图说明
[0089]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0090]
图1为实施例1制备的eco-a1120的h核磁谱图；
[0091]
图2为实施例2制备的eco-a4120的h核磁谱图；
[0092]
图3为实施例3制备的eco-a5120的h核磁谱图；
[0093]
图4为实施例4制备的eco-aa120的h核磁谱图；
[0094]
图5为实施例5制备的eco-ab120的h核磁谱图；
[0095]
图6为实施例6制备的eco-ad120的h核磁谱图；
[0096]
图7为实施例1制备的eco-a1120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0097]
图8为实施例2制备的eco-a4120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0098]
图9为实施例3制备的eco-a5120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0099]
图10为实施例4制备的eco-aa120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0100]
图11为实施例5制备的eco-ab120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0101]
图12为实施例6制备的eco-ad120的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0102]
图13为实施例1制备的eco-a1120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0103]
图14为实施例2制备的eco-a4120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0104]
图15为实施例3制备的eco-a5120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0105]
图16为实施例4制备的eco-aa120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0106]
图17为实施例5制备的eco-ab120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0107]
图18为实施例6制备的eco-ad120在不同体积比例下thf/水混合溶液中的归一化荧光发射光谱，以及聚集诱导发光曲线图；
[0108]
图19为实施例1制备的eco-a1120荧光分子在不同时间长度白光照射下，使用h2dcf-da检测ros产生量的荧光强度变化光谱图；
[0109]
图20为实施例1、2、3、5分别制备的eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120和eco-ab120荧光分子在不同时间长度白光照射下ros产生量的对照曲线；
[0110]
图21为实施例1制备的eco-a1120 nps(图a)和实施例5制备的eco-ab120 nps(图b)的动态光散射直径(dls)；插图为相应纳米颗粒的透射电子显微镜图(tem)；
[0111]
图22为实施例2制备的eco-a1120的细胞毒性测试(mtt法)图；
[0112]
图23为共聚焦激光扫描显微镜(clsm)观察4t1乳腺癌细胞与实施例一制备的eco-a1120 nps共孵育4h后的图像,细胞核用dapi(蓝色)染色图；
[0113]
图24为实施例1制备的eco-a1120引导组和未引导组在切除肿瘤前后小鼠腹腔的荧光显像对比图(图a)；实施例1制备的eco-a1120引导组和未引导组切除肿瘤大小对比图像(图b)。
[0114]
图25为实施例5制备的eco-ab120导航组和未导航组在切除肿瘤前后小鼠腹腔的荧光显像对比图。
具体实施方式
[0115]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0116]
实施例1、化合物eco-a1120的制备，合成路线如下：
a1120，收率58.1％。
[0124]
eco-a1120的核磁h谱图如图1所示。
[0125]
实施例2、化合物eco-a4120的制备，合成路线如下：
[0126][0127]
步骤一、eco-a4120的合成：
[0128]
向反应瓶中加入实施例1中步骤二所得化合物2(602mg，0.89mmol)、四(三苯基磷)钯(72.0mg，0.062mmol)与4-甲氧基-n-(4-甲氧基苯基)-n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)苯胺(959mg，2.23mmol)，氮气球保护后加入28.0ml 1，4-二氧六环，随后加入7.0ml 2m的碳酸钾溶液(v
二氧六环
：v
碱溶液
＝4：1)，升温100℃反应24h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用400ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
dcm
＝1：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得664.7mg紫黑色产物固体化合物eco-a4120，收率66.4％。
[0129]
eco-a4120的核磁h谱图如图2所示。
[0130]
实施例3、化合物eco-a5120的制备，合成路线如下：
[0131][0132]
步骤一，化合物3的合成：
[0133]
向反应瓶中加入4，4'-二甲基三苯胺(1.83g，6.70mmol)与n-溴代丁二酰亚胺(1.31g，7.36mmol)，氮气球保护后加入50ml氯仿，置于冰浴中搅拌5min，随后室温反应21h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥
过滤，减压旋蒸除去溶剂，最终得2.35g白色产物固体化合物3，收率90.6％。
[0134]
步骤二，化合物4的合成：
[0135]
向反应瓶中加入实施例3中步骤一所得化合物3(2.35g，6.68mmol)、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(148mg，0.27mmol)、醋酸钠(1.64g，20.04mmol)、双(频哪醇合)二硼(2.04g，8.02mmol)与三(二亚苄基丙酮)二钯(184mg，0.20mmol)，氮气球保护后加入30ml 1,4-二氧六环，升温100℃反应20h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
ea
＝50：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂，最终得911mg棕黄色油状产物化合物4，收率34.2％。
[0136]
步骤三，eco-a5120的合成：
[0137]
向反应瓶中加入实施例1中步骤二所得化合物2(588mg，0.87mmol)、四(三苯基磷)钯(70.0mg，0.061mmol)与实施例3中步骤二所得化合物4(868mg，2.18mmol)，氮气球保护后加入28.0ml 1，4-二氧六环，随后加入7.0ml 2m的碳酸钾溶液(v
二氧六环
：v
碱溶液
＝4：1)，升温100℃反应20h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用500ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
dcm
＝5：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂，最终得519.8mg紫黑色产物固体化合物eco-a5120，收率56.3％。
[0138]
eco-a5120的核磁h谱图如图3所示。
[0139]
实施例4、化合物eco-aa120的制备，合成路线如下所示：
[0140][0141]
步骤一，化合物5的合成：
[0142]
向反应瓶中称取4-甲基-n-苯基苯胺(2.20g，12mmol)、1，1'-联萘-2,2'-双二苯膦(934mg，1.5mmol)、碳酸铯(6.52g，20.0mmol)与醋酸钯(226mg，1.0mmol)，氮气球保护后加入1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯(4.113g，10.0mmol)与30ml超干二甲苯混合溶剂，先室温搅拌30min，后升温100℃反应20h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入600ml水、800ml乙酸乙酯进行萃取，收集有机相并用6g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用700ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂为v
pe
：v
ea
＝20：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得2.34g淡黄色产物固体化合物5，收率45.5％。
[0143]
步骤二，化合物6的合成：
[0144]
向反应瓶中加入实施例4中步骤一所得化合物5(1g，1.94mmol)与n-溴代丁二酰亚胺(381mg，2.14mmol)，氮气球保护后加入20ml氯仿，置于冰浴中反应16h。此时反应完全，加入300ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用5g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂为v
pe
：v
dcm
＝5：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得850mg黄色产物固体化合物6，收率73％。
[0145]
步骤三，化合物7的合成：
[0146]
向反应瓶中加入实施例4中步骤二所得化合物6(1g，1.69mmol)、双(频哪醇合)二硼(514.3mg，2.02mmol)、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(37.05mg，0.068mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(27.5mg，0.03mmol)与醋酸钾(496mg，5.06mmol)，氮气球保护后加入20ml 1,4-二氧六环，升温110℃反应20h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用6g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用700ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂采用v
pe
：v
dcm
＝5：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)的体积比混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得600mg棕黄色产物固体化合物7，收率55.5％。
[0147]
步骤四，eco-aa120的合成：
[0148]
向反应瓶中加入实施例1中步骤二所得化合物2(489mg，0.78mmol)、四(三苯基磷)钯(59.7mg，0.05mmol)与实施例4步骤三所得化合物7(1114mg，1.74mmol)，氮气球保护后加入24.0ml 1，4-二氧六环，随后加入6.0ml 2m的碳酸钾溶液(v
二氧六环
：v
碱溶液
＝4：1)，升温110℃反应16h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约70g)，用500ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
dcm
＝3：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得600mg紫黑色产物固体化合物eco-aa120，收率52.7％。
[0149]
eco-aa120的核磁h谱图如图4所示。
[0150]
实施例5、化合物eco-ab120的制备，合成路线如下：
[0151][0152]
步骤一，化合物8的合成：
[0153]
在反应瓶中称取4-甲基-n-苯基苯胺(2.20g，12mmol)、1，1'-联萘-2,2'-双二苯膦(934mg，1.5mmol)、碳酸铯(6.52g，20.0mmol)与醋酸钯(226mg，1.0mmol)，氮气球保护后加入对溴苯丙酸乙酯(2.57g，10.0mmol)与30ml超干二甲苯，先室温搅拌30min，后升温100℃反应20h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入600ml水、800ml乙酸乙酯进行萃取，收集有机相并用6g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用700ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
ea
＝20：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂，最终得2.78g淡黄色产物固体化合物8，收率77.4％。
[0154]
步骤二，化合物9的合成：
[0155]
在反应瓶中加入实施例5中步骤一所得化合物8(2.78g，7.74mmol)与n-溴代丁二酰亚胺(1..41g，7.89mmol)，氮气球保护后加入50ml氯仿，置于冰浴中反应6h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
dcm
＝2：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂，最终得2.91g棕黄色油状产物固体化合物9，收率85.4％。
[0156]
步骤三，化合物10的合成：
[0157]
向反应瓶中加入实施例5中步骤二所得化合物9(2.90g，6.62mmol)、双(频哪醇合)二硼(2.0g，7.91mmol)、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(145mg，0.266mmol)、三(二亚苄基丙酮)
二钯(107.7mg，0.12mmol)与醋酸钾(1.94g，19.8mmol)，氮气球保护后加入50ml 1,4-二氧六环，升温100℃反应20h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用800ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
ea
＝20：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得5.64g棕黄色油状产物固体化合物10，收率44.9％。
[0158]
步骤四，化合物11的合成：
[0159]
向反应瓶中加入实施例1中步骤二所得化合物2(570mg，0.84mmol)、四(三苯基磷)钯(67.9mg，0.059mmol)与实施例5中步骤三所得化合物10(1.43g，2.94mmol)，氮气球保护后加入28.0ml 1，4-二氧六环，随后加入7.0ml 2m的碳酸钾溶液(v
二氧六环
：v
碱溶液
＝4：1)，升温100℃反应20h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用800ml纯二氯甲烷洗脱剂进行洗脱，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得806.4mg紫黑色产物固体化合物11，收率77.8％。步骤五，eco-ab120的合成：
[0160]
向反应瓶中加入实施例5中步骤四所得化合物11(560mg，0.45mmol)，氮气球保护后加入50ml四氢呋喃，随后加入氢氧化钠(360mg，9.0mmol)与17ml水，升温70℃反应10h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入500ml水、500ml二氯甲烷/甲醇混合溶液(v
dcm
：v
meoh
＝20：1)进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后用10ml二氯甲烷溶解产物，滴入1000ml石油醚中进行沉降，抽滤得312mg紫黑色产物固体化合物eco-ab120，收率58.9％。
[0161]
eco-ab120的核磁h谱图如图5所示。
[0162]
实施例6、化合物eco-ad120的制备，合成路线如下所示：
[0163][0164]
步骤一，化合物12的合成：
[0165]
在反应瓶中称取4-甲氧基二苯胺(2.39g，12mmol)、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(934mg，1.5mmol)、碳酸铯(6.52g，20.0mmol)与醋酸钯(226mg，1.0mmol)，氮气球保护后加入对溴苯丙酸乙酯(2.57g，10.0mmol)与30ml超干二甲苯混合溶剂，先室温搅拌30min，后升温100℃反应20h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入600ml水、800ml乙酸乙酯进行萃取，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂为v
pe
：v
ea
＝20：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得1.95g淡黄色产物固体化合物12，收率52.0％。
[0166]
步骤二，化合物13的合成：
[0167]
在反应瓶中加入实施例6中步骤一所得化合物12(1.95g，5.2mmol)与n-溴代丁二酰亚胺(943mg，5.3mmol)，氮气球保护后加入40ml氯仿，置于冰浴中反应6h。此时反应完全，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用800ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
pe
：v
dcm
＝1：1(pe为石油醚，dcm为二氯甲烷)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得1.94g棕黄色产物固体化合物13，收率82.3％。
[0168]
步骤三，化合物14的合成：
[0169]
向反应瓶中加入实施例6中步骤二所得化合物13(1.94g，4.28mmol)、(1g，1.69mmol)、双(频哪醇合)二硼(1.3g，5.12mmol)、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁(93.8mg，
0.172mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(69.6mg，0.076mmol)与醋酸钾(1.26g，12.8mmol)，氮气球保护后加入50ml 1,4-二氧六环，升温100℃反应20h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入400ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用5g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约70g)，用900ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂采用v
pe
：v
ea
＝10：1(pe为石油醚，ea为乙酸乙酯)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得2.13g棕黄色产物固体化合物14，收率39.3％。
[0170]
步骤四，化合物15的合成：
[0171]
向反应瓶中加入实施例1中步骤二所得化合物2(325mg，0.48mmol)、四(三苯基磷)钯(38.8mg，0.034mmol)与实施例6中步骤三所得化合物14(843mg，1.68mmol)，氮气球保护后加入16.0ml 1，4-二氧六环，随后加入4.0ml 2m的碳酸钾溶液(v
二氧六环
：v
碱溶液
＝4：1)，升温100℃反应20h。此时反应完全，加入200ml水、300ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用7g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用900ml纯二氯甲烷洗脱剂进行洗脱，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压旋蒸除去溶剂处理，最终得271.7mg紫黑色产物固体化合物15，收率44.7％。步骤五，eco-ad120的合成：
[0172]
向反应瓶中加入实施例6中步骤四所得化合物15(253mg，0.20mmol)，氮气球保护后加入20ml四氢呋喃，随后加入氢氧化钠(160mg，4.0mmol)与7ml水，升温70℃反应10h。此时反应完全，减压旋蒸除去反应液溶剂，加入200ml水、200ml二氯甲烷/甲醇混合溶液(v
dcm
：v
meoh
＝20：1)进行萃取，收集有机相并用6g无水硫酸镁干燥过滤，减压旋蒸除去溶剂后用4ml二氯甲烷溶解产物，滴入500ml石油醚中进行沉降，抽滤得121mg紫黑色产物固体化合物eco-ad120，收率50.1％。
[0173]
eco-ad120的核磁h谱图如图6所示。
[0174]
结构表征
[0175]
将上述实施例1～实施例6制备所得eco-ax120系列荧光分子:eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120进行核磁h谱检测(测试溶剂：cdcl3)，结果如图1～6所示，证明eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120结构正确无误。
[0176]
光学性质测试
[0177]
将上述实施例1～实施例6制备而得的eco-ax120系列荧光分子:eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120(或其中优选的几种)作为待测物分别进行光学性质测试，以下用实施例对实施方案进行描述。
[0178]
实验1：eco-ax120系列荧光分子的紫外吸收与荧光发射峰值测定。
[0179]
测定分子选用eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120。
[0180]
1.方法与条件
[0181]
紫外测定：使用的仪器为岛津uv-1900i紫外光谱仪，待测物浓度为50μm，吸收波长扫描范围：750nm～400nm；记录范围：0abs～2.5abs；扫描速度：高速；数据间隔：0.2nm；记录方式：覆盖。
[0182]
荧光测定：使用的仪器为岛津rf-6000荧光光谱仪，待测物浓度为10μm，激发波长
设定为待测物的最大吸收波长，发射光谱波长范围：730nm～900nm；狭缝宽度(nm)：ex＝5，em＝5；灵敏度：low；数据间隔：1.0nm；扫描速度：2000nm/min；响应时间：自动。
[0183]
2.结果与分析
[0184]
eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120紫外吸收与荧光发射最大峰值如图7～12所示，进一步证明斯托克斯位移红移。
[0185]
实验2：eco-ax120系列荧光分子的量子产率测定。
[0186]
测定分子选用eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120。
[0187]
1.方法与条件
[0188]
罗丹明b(rhb)是一种较好的荧光染料，它具有较大的摩尔吸光系数和较高的荧光量子产率，并因具有很好的稳定性而作为荧光量子产率标准物。配置一定浓度的待测样品和罗丹明b的dmso溶液，使两者的吸光度相近且小于0.05并记录在546nm处两者分别的吸光度数值。随后分别扫描待测样品和罗丹明b溶液在546nm激发光激发下的发射光谱，依据公式计算出待测样品的量子产率；式中yu为待测未知样品的量子产率；ys为标准物质的荧光量子产率；fu、fs为待测样、标准物稀溶液的积分荧光强度；au、as为待测样、标准物对在激发波长的最大吸光度值。罗丹明b在dmso中的量子产率由文献报道所得。
[0189]
2.结果与分析
[0190]
待测未知样品代表荧光分子(例如为eco-a1120)，标准物质为罗丹明b。
[0191]
eco-a1120的量子产率为0.23；eco-a4120的量子产率为0.19；eco-a5120的量子产率为0.20；eco-aa120的量子产率为0.18；eco-ab120的量子产率为0.22；eco-ad120的量子产率为0.16。
[0192]
实验3：eco-ax120系列荧光分子的聚集诱导发光(aie)性能测定。
[0193]
测定分子选用eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120。
[0194]
1.方法与条件
[0195]
聚集诱导发光(aie)是指一类在溶液中单分子状态时不发射荧光的分子在聚集状态时呈现高荧光亮度的现象。因待测物分子均溶于thf而不溶于水，当测物分子的thf/水混合溶液中水的占比不断增加时，溶剂体系中的待测分子将逐渐聚集。配制各待测分子不同配比(水占比为0～99％)的thf/水混合溶液(保持待测物分子的浓度为10μm)，使用岛津rf-6000荧光光谱仪用特定的激发波长测定分子在不同体积比例下的thf/水混合溶液中的最大荧光发射强度，激发波长的选择为：eco-a1120采用546nm波长激发，eco-a4120采用543nm波长激发，eco-a5120采用549nm波长激发，eco-aa120采用543nm波长激发，eco-ab120采用547nm波长激发，eco-ad120采用551nm波长激发。
[0196]
2.结果与分析
[0197]
如图13～18所示，eco-a1120、eco-a5120、eco-aa120、eco-ab120、eco-ad120荧光分子在不同体积比例下的thf/水混合溶液下均具有一定的荧光发射亮度，且随着不良溶剂的含量增加，荧光分子聚集状态下呈现荧光亮度先降低后逐步提高至亮度峰值的现象，具有显著的聚集诱导发光特性。而eco-a4120荧光分子的thf/水混合溶液，随着不良溶剂的含
量增加，荧光分子聚集状态下呈现荧光亮度逐步降低直至淬灭的现象，因而无明显聚集诱导发光特性。
[0198]
实验4：eco-ax120系列荧光分子的光动力性能测定。
[0199]
测定分子选用eco-ax120系列荧光分子中预测具有较佳ros产生能力的eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-ab120。
[0200]
1.方法与条件
[0201]
待测分子的光动力性能通过测定ros的生成量来衡量，本实验使用的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(h2dcfda)是一种常用的ros指示剂。先使用naoh水溶液将h2dcfda水解为2',7'-二氯二氢荧光素(dcfh)，将其与待测物分子混合配制为pbs缓冲液测试样品。在白光照射条件下，待测物分子产生的ros可使不具有荧光发射能力的dcfh氧化为具有荧光发射能力的2',7'-二氯荧光素(dcf)，如体系中的dcfh被不断消耗，测试样品荧光强度不断提高，则测试样品在光照条件下具有ros产生能力；如荧光强度无变化，则说明测试样品在光照条件下无ros产生能力。在测定时，所使用照射白光波长范围为380nm～780nm，光照功率为50mw
·
cm-2
，待测化合物与dcfh混合配置的pbs缓冲液测试样品中，dcfh的浓度为5μm,待测物分子浓度为1μm。已配置的测试样品经照射光不同时长照射(0～240s)后，使用岛津rf-6000荧光光谱仪测定样品的最大荧光发射强度，激发波长设定为dcf最大吸收波长，即488nm。
[0202]
2.结果与分析
[0203]
eco-a1120所对应测定样品在不同的光照时间下的荧光发射曲线变化如图19所示，四种待测化合物：eco-a1120、eco-a4120、eco-a5120、eco-ab120所对应测定样品在不同的光照时间下荧光最大发射强度变化对比如图20所示。从图中可知随着光照时间的增加，各待测样品中dcf的荧光强度均稳定地逐渐提高，证明各待测分子在上述光照条件下都可高效地产生ros，因而具有光动力治疗的应用潜力。
[0204]
细胞与动物实验
[0205]
为了评估eco-ax120系列荧光分子能否指导肿瘤切除手术，本发明建立了细胞与动物实验模型，应用上述荧光分子中综合性能较好(量子产率较高且聚集诱导发光特性良好)、具有代表性的eco-a1120与eco-ab120分别制备为纳米颗粒，并应用于存在epha2高表达的乳腺癌细胞的体外及体内荧光成像，观察成像分布、代谢与手术导航效果，以下用实验案例对实施方案进行描述。
[0206]
实验5：eco-a1120纳米颗粒的制备与表征。
[0207]
1.eco-a1120纳米颗粒的制备
[0208]
将1mg脂溶性光敏剂eco-a1120和2mg两亲性聚合物dspe-peg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)在1.0ml四氢呋喃中溶清，在超声条件下将混合液快速加入10ml超纯水中，随后继续超声10min促进体系分散均匀，此后向样品中鼓入氮气去除四氢呋喃，最后冷藏保存备用。所制备的eco-a1120纳米颗粒(eco-a1120 nps)的表现浓度为2000μg/ml。
[0209]
2.eco-a1120纳米颗粒的表征方法
[0210]
粒径测试方法：将3ml浓度为0.5mg/ml的eco-a1120纳米颗粒悬浮液置于荧光比色皿中，通过动态光散射仪扫描，得到粒径的正态分布图，每个样品重复3次。
a1120 nps(图23b)的荧光信号，再叠加图23a和图23b获得图23c。
[0230]
2.实验结果与分析
[0231]
如图23所示，证明eco-a1120 nps能够应用于细胞染色，且纳米颗粒可以被4t1细胞有效地内化并滞留在细胞质中。
[0232]
实验9：eco-a1120荧光分子所制备纳米颗粒在移植小鼠乳腺癌细胞(4t1)腹腔转移瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0233]
1.建立表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型
[0234]
为了建立荷表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，给予小鼠腹腔注射100μl的表达萤火虫素酶的4t1细胞悬浮液(3
×
105个细胞)。
[0235]
2.配制注射液
[0236]
取上述eco-a1120纳米颗粒超纯水样品，通过生理盐水稀释配置成1mg/ml的注射液。
[0237]
3.给药并成像
[0238]
从已移植表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型的balb/c小鼠中随机分出1只，注射200μl配制好的eco-a1120纳米颗粒注射液(1mg/ml)，通过尾静脉给药。
[0239]
24小时后，向小鼠体内注射150mg/ml的萤火虫素酶底物100μl，全程麻醉下打开小鼠的腹腔，使用ivis lmmina ii小动物活体成像仪对肿瘤病灶组织荧光成像进行观察，从而确定术前4t1腹腔转移瘤病灶组织的位置分布。随后，对肿瘤组织进行裸眼手术清除，摘除视觉与触感所能判定的所有肿瘤组织后，对腹腔再次进行荧光成像，观察遗留的未清除肿瘤组织，并借助荧光的导航性能对剩余病灶再次进行手术清除，两种手术方式进行术前术后荧光成像图以及切除肿瘤组织大小的对比，验证探针导航对于小于5mm的肿瘤的有效识别率与导航条件下手术清除的彻底性，所清除的肿瘤通过ivis lmmina ii生物自发光成像来判断是否清除的即为肿瘤组织。
[0240]
4.实验结果
[0241]
如图24所示，证明本发明制备的eco-a1120纳米颗粒样品能够有效富集在肿瘤部位，成像清晰，边界清楚，并能精准指示微小转移灶(图中白色箭头指示位置)；此外，利用手术导航切除相较非导航条件，清除的肿瘤组织更小，切除更高效精准且更为彻底，具有明显的应用优势。
[0242]
实验10：eco-ab120荧光分子所制备纳米颗粒在移植小鼠乳腺癌细胞(4t1)腹腔转移瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0243]
1.eco-ab120纳米颗粒的制备
[0244]
将1mg脂溶性光敏剂eco-ab120和2mg两亲性聚合物dspe-peg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000)在1.0ml四氢呋喃中溶清，在超声条件下将混合液快速加入10ml超纯水中，随后继续超声10min促进体系分散均匀，此后向样品中鼓入氮气去除四氢呋喃，最后冷藏保存备用。
[0245]
所制备的eco-ab120纳米颗粒(eco-a1120 nps)的表现浓度为2000μg/ml，纳米颗粒直径如图19所示，约为100nm。
[0246]
2.建立表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型
[0247]
为了建立荷表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，给予小鼠腹腔注射100μl的表达萤火虫素酶的4t1细胞悬浮液(3
×
105个细胞)。
[0248]
3.配制注射液
[0249]
取上述eco-ab120纳米颗粒超纯水样品，通过生理盐水稀释配置成1mg/ml的注射液。
[0250]
4.给药并成像
[0251]
从已移植表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型的balb/c小鼠中随机分出1只，注射200μl配制好的eco-ab120纳米颗粒注射液(1mg/ml)，通过尾静脉给药。
[0252]
24小时后，向小鼠体内注射150mg/ml的萤火虫素酶底物100μl，全程麻醉下打开小鼠的腹腔，使用ivis lmmina ii小动物活体成像仪对肿瘤病灶组织荧光成像进行观察，判断纳米颗粒荧光信号能否准确对应表达萤火虫素酶的4t1肿瘤生物自发光所产生的信号，从而检测荧光信号对肿瘤识别的准确性。随后，对肿瘤组织进行裸眼手术清除，摘除视觉与触感所能判定的所有肿瘤组织后，对腹腔再次进行荧光成像，观察遗留的未清除肿瘤组织，并借助荧光的导航性能对剩余病灶再次进行手术清除，两种手术方式进行术前术后荧光成像图以及切除肿瘤组织大小的对比，验证探针导航对于小于5mm的肿瘤的有效识别率与导航条件下手术清除的彻底性，所清除的肿瘤通过ivis lmmina ii生物自发光成像来判断是否清除的即为肿瘤组织。
[0253]
5.实验结果
[0254]
如附图25所示，证明实施例制备的eco-ab120纳米颗粒样品能够有效富集在肿瘤部位，成像清晰且边界清楚，同时纳米颗粒荧光信号也准确对应表达萤火虫素酶的4t1肿瘤生物自发光所产生的信号，证明了荧光分子纳米颗粒对肿瘤识别的准确性；此外，非导航条件下手术切除仍有较多遗留病灶组织，而利用手术导航切除基本无病灶组织残留，切除更高效、精准且更为彻底，具有明显的应用优势。
[0255]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，其特征在于，化学结构如式(ⅰ)所示：式(ⅰ)中：r1为碳原子数为1-20的直链或支链烷基；r2为氢、碳原子数为1-20的直链或支链烷基、或者碳原子数为1-20的直链或支链烷氧基；r3为氢、芳代乙烯基、碳原子数为1-20的直链或支链烷基、碳原子数为1-20的直链或支链烷氧基、或者碳原子数为1-20的直链羧基。2.根据权利要求1所述的具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，其特征在于式(ⅰ)中：r1为碳原子数为1-10的直链或支链烷基；r2为氢、碳原子数为1-10的直链或支链烷基、或者碳原子数为1-10的直链或支链烷氧基中的一种；r3为氢、芳代乙烯基、碳原子数为1-10的直链或支链烷基、碳原子数为1-10的直链或支链烷氧基、或者碳原子数为1-10的直链羧基中的一种。3.根据权利要求2所述的具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，其特征在于式(ⅰ)中：r1为正己基，r2为氢、甲基或甲氧基中的一种，r3为氢、甲基、甲氧基、丙酸基或三苯乙烯基中的一种。4.根据权利要求1～3任一所述的具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，其特征在于：荧光分子结构式为以下任一：
5.如权利要求1～4任一所述的具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)、制备化合物1：4，9-二溴萘并噻二唑与2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷在四(三苯基磷)钯催化和碳酸钾碱性环境作用下发生suzuki偶联反应，于(100
±
10)℃下反应12-24h；4，9-二溴萘并噻二唑、2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷、四(三苯基磷)钯、碳酸钾的摩尔比为1：2-3：0.03-0.1：10-20；
反应所得物进行纯化后得到化合物1；2-(4-r1烷基-2-噻吩基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧戊硼烷选用4-己基-2-噻吩硼酸频哪醇酯；2)、制备化合物2：化合物1在四氢呋喃溶剂中被n-溴代丁二酰亚胺溴化，于室温下反应5
±
1h，化合物1与n-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：2-3；反应所得物进行纯化后得到得到化合物2；3)、化合物5或者苯胺类化合物与化合物2在四(三苯基磷)钯催化和碳酸钾碱性环境作用下发生suzuki偶联反应，于100
±
10℃下反应12-24h，化合物2、化合物5/三苯胺类化合物、四(三苯基磷)钯、碳酸钾的摩尔比为1：2-4：0.03-0.1：10-20；苯胺类化合物为4-(二苯基氨基)苯硼酸、4-甲氧基-n-(4-甲氧基苯基)-n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)苯胺；反应所得物进行纯化后得到具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子或者得到荧光分子前期产物。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：将荧光分子前期产物制备成荧光分子：向荧光分子前期产物加入氢氧化钠进行反应，70
±
10℃反应10
±
1h；荧光分子前期产物：氢氧化钠的摩尔比为1:(20
±
1)；反应所得物进行纯化后，得到具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，化合物5的制备方法为包括以下步骤：
①
、将作为原料的化合物3或者4，4'-二甲基三苯胺在氯仿溶剂中被n-溴代丁二酰亚胺溴化，得到化合物4；反应温度为冰浴～室温，反应时间为6-21h；
原料与n-溴代丁二酰亚胺的摩尔比为1：1-1.5；
②
、化合物4与联硼酸频那醇酯在三(二亚苄基丙酮)二钯催化，1,1'-双(二苯基膦)二茂铁作为配体和醋酸盐(醋酸钠、醋酸钾)碱性环境作用下与发生miyaura硼化反应，在100
±
10℃下反应12-24h；化合物4、联硼酸频那醇酯、三(二亚苄基丙酮)二钯、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、醋酸盐的摩尔比为1：1-1.5：0.01-0.06：0.03-0.04：2-4；联硼酸频那醇酯为双(频哪醇合)二硼；反应所得物进行纯化后得到化合物5；8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，化合物3的制备方法为包括以下步骤：1-r3取代基-4-溴苯与4-r2取代基-n-苯基苯胺在醋酸钯催化，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦作为配体和碳酸铯碱性环境作用下发生c-n偶联反应，在(100
±
10)℃下反应12-24h；1-r3取代基-4-溴苯、4-r2取代基-n-苯基苯胺、醋酸钯、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、碳酸铯的摩尔比为1：1-1.5：0.05-0.15；0.1-0.2；1.5-3；反应所得物进行纯化后得到化合物3；1-r3取代基-4-溴苯为1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯乙烯、对溴苯丙酸乙酯；4-r2取代基-n-苯基苯胺为4-甲基-n-苯基苯胺、4-甲氧基二苯胺。9.如权利要求1-4任意一项所述的具有聚集诱导发光特性的近红外一区成像荧光分子
在肿瘤光动力治疗光敏剂和/或在肿瘤手术导航显影剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：作为在肿瘤光动力治疗光敏剂的应用：将eco-ax120系列荧光分子与两亲性聚合物在有机溶剂中溶解，再向体系中加入超纯水，超声，促进体系分散均匀，随后除去有机溶剂，从而得到水溶性荧光分子纳米颗粒，所述荧光分子纳米颗粒的表观浓度≥20μg/ml；作为在肿瘤手术导航显影剂中的应用：所述的荧光分子可以用于原位乳腺癌等癌症的成像与辅助治疗药剂。

技术总结
本发明属于生物成像与抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种可用于近红外荧光成像、肿瘤手术导航且具有聚集诱导发光特性的荧光分子及其制备方法和应用。本发明公开了一种具有聚集诱导发光特性的用于肿瘤成像的荧光分子，其化学结构为：本发明还同时提供了其制备方法。本发明还同时提供了上述具有聚集诱导发光特性的近红外一区成像荧光分子在肿瘤光动力治疗光敏剂和/或在肿瘤手术导航显影剂中的应用。术导航显影剂中的应用。术导航显影剂中的应用。


技术研发人员：骆晨希 金健飞 张焕民 斯云
受保护的技术使用者：浙江义氪生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/19