一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂及其制备方法与流程

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂。


背景技术：

2.神经系统由中枢神经和周围神经系统组成，并通过复杂的神经网络结构传输电信号来协调身体各部位的活动。中枢神经系统创伤其主要包括颅脑创伤和脊髓损伤，其发病机制是一个复杂的过程，主要由原发性和继发性损伤导致，这些损伤将导致暂时性或永久性神经功能缺损。周围神经损伤主要包括糖尿病或由于外伤、手术及肿瘤压迫出现周围神经损伤。
3.无论是中枢神经还是外周神经系统损伤都会破坏脑组织与目标组织之间的信号传导。导致患者功能的丧失，因此要恢复损伤功能，必须促进受损的神经再生并与远端目标组织重新形成连接。为解决神经再生相关的问题，越来越多的修复策略被用于神经损伤修复治疗中。目前主要的治疗策略包括手术治疗、药物治疗、细胞治疗、外泌体治疗、组织工程支架治疗等。
4.目前以干细胞为基础的治疗，在中枢神经系统及周围神经系统损伤的治疗中已取得一系列成果。采用局部细胞植入，可促进神经再生，轴突再生和髓鞘形成。在此过程中，相对于细胞的替代治疗，干细胞的旁分泌作用起着更加重要的作用，其可以调控损伤周围神经细胞的存活和神经再生。
5.间充质干细胞(mscs)来源的外泌体(msc-exos)是活细胞分泌的膜性囊泡，直径约30～100nm，内含蛋白质、mrna、microrna等。目前，外泌体提取方法有超速离心法、试剂盒法、超滤法、蔗糖密度梯度离心法等。
6.msc-exos具有分化潜能高、移植后存活率高、无明显不良反应等特点，已在糖尿病、阿尔茨海默症、脑血管疾病等多种疾病中开展临床研究。研究表明，mscs外泌体中富集了大量与代谢调控密切相关的蛋白及多肽成分，在神经再生中有促进作用及在急性神经损伤过程中起保护作用，其疗效类似于mscs的功能。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，为外泌体相关研究提供了新的给药方式，为神经功能缺失患者提供了治疗新策略。
8.本发明提供的这种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，按质量组计份，包括以下成分：外泌体10-30份、去离子水40-60份、吸收促进剂5-8份、稳定剂3-5份、防腐剂3-5份。
9.进一步的，所述吸收促进剂为聚山梨酯。
10.进一步的，所述稳定剂为甘露醇。
11.进一步的，所述防腐剂为苯甲酸钠。
12.进一步的，按质量组计份，包括以下成分：外泌体15份、去离子水50份、吸收促进剂6份、稳定剂4份、防腐剂4份。
13.进一步的，所述按质量组计份，包括以下成分：外泌体20份、去离子水50份、吸收促进剂7份、稳定剂4份、防腐剂4份。
14.进一步的，所述按质量组计份，包括以下成分：外泌体10份、去离子水45份、吸收促进剂7份、稳定剂4份、防腐剂4份。
15.进一步的，所述用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂的制备方法是：将制备原料按配方混合，混和后进行搅拌，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min；搅拌后所得混合液体进行超声分散，超声分散时间为30min；超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体的鼻喷雾剂。
16.进一步的，所述外泌体的鼻喷雾剂为溶液，其ph值为6。
17.本发明提供的这种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，间充质干细胞外泌体的原料是脐带，其采集为无创性操作，且脐带属于废弃物再利用，不涉及法律伦理问题，脐带的来源广泛、数量充足，能够满足规模化生产需求；该外泌体鼻喷雾剂可获得与mscs输注类似的疗效，避免了干细胞治疗带来的风险，为神经功能缺失患者提供了治疗新策略，并且鼻腔喷雾的给药方式便捷无痛，接受度更高，避免了干细胞治疗带来的植入失败风险及排斥风险。
附图说明
18.图1为各时间点外泌体蛋白浓度曲线。
19.下面通过实施例对本发明做详细说明。
具体实施方式
20.为进一步阐述本实施例达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例对本实施例的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。
21.实施例1
22.本实施例的目的在于提供一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂。这种外泌体能获得与mscs输注类似的疗效，调控损伤周围神经细胞的存活和神经再生，有效治疗神经功能缺失。
23.第一方面，本实施例提供一种间充质干细胞来源的外泌体，所述间充质干细胞来源的外泌体是人脐带间充质干细胞分泌得到。
24.人脐带间充质干细胞(mscs)以1
×
106/cm2的密度接种于培养瓶中，培养基用完全间充质干细胞培养基，将细胞培养瓶置于37℃、5％co2饱和湿度孵育箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化，待细胞长至培养瓶底60％面积时，换液培养，加无血清间充质干细胞培养液，48h后，收集培养上清液，合并于4℃冷藏备用。
25.进一步，所述间充质干细胞完全培养基是90％专用间充质干细胞培养液+10％fbs。
26.优选地，所述间充质干细胞为传代3-6代的人脐带间充质干细胞。
27.第二方面，本实施例提供一种超速离心法提取上述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法，所述方法为：
28.将mscs培养上清液收集至50ml离心管中，4℃、300g离心10min，以去除死细胞；将上清液转移至新的离心管中，4℃、2000g离心10min，以去除大的碎片；将上清液转移至新的离心管中，4℃，10000g离心30min，以去除细胞器及小颗粒。小心将上清液转移至无菌超速离心管中，进行第一次超速离心，4℃、100000g离心70min；用移液器将上清小心的移除，离心管底的沉淀用无菌pbs重悬，进行第二次超速离心，4℃、100000g离心70min；用移液器将上清小心的移除，得到的沉淀为外泌体。根据收集培养基的体积，加入适量无菌pbs重悬(每50ml收集的培养基最终使用不超过50μl的pbs重悬)，然后用0.22μm离心式过滤器过滤；获得的无菌外泌体重悬液用bca蛋白浓度检测试剂盒检测总蛋白浓度，分装后于-80℃保存。
29.实施例2
30.一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其原料成分组成按质量组计份，包括以下成分实施例2中的外泌体10份、去离子水50份、吸收促进剂6份、稳定剂2份、防腐剂2份。
31.取上述成分按配方混合，混和后进行搅拌，搅拌后所得混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
32.更进一步地，喷雾剂配方溶液的ph值为6。
33.更进一步地，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min。
34.更进一步地，超声分散时间为30min。
35.更进一步地，吸收促进剂为聚山梨酯。
36.更进一步地，稳定剂为甘露醇。
37.更进一步地，防腐剂为苯甲酸钠。
38.实施例3
39.一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其原料成分组成按质量组计份，包括以下成分实施例2中的外泌体20份、去离子水50份、吸收促进剂6份、稳定剂2份、防腐剂2份。
40.取上述成分按配方混合，混和后进行搅拌，搅拌后所得混合液体进行超声分散，超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
41.更进一步地，喷雾剂配方溶液的ph值为6。
42.更进一步地，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min。
43.更进一步地，超声分散时间为30min。
44.更进一步地，吸收促进剂为聚山梨酯。
45.更进一步地，稳定剂为甘露醇。
46.更进一步地，防腐剂为苯甲酸钠。
47.实施例4
48.一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其原料成分组成按质量组计份，包括以下成分实施例2中的外泌体30份、去离子水50份、吸收促进剂6份、稳定剂2份、防腐剂2份。
49.取上述成分按配方混合，混和后进行搅拌，搅拌后所得混合液体进行超声分散，超
声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体喷雾。
50.更进一步地，喷雾剂配方溶液的ph值为6。
51.更进一步地，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min。
52.更进一步地，超声分散时间为30min。
53.更进一步地，吸收促进剂为聚山梨酯。
54.更进一步地，稳定剂为甘露醇。
55.更进一步地，防腐剂为苯甲酸钠。
56.实施例5
57.外泌体鼻喷雾剂的稳定性实验
58.用bca蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白质浓度测定方法研究实施例2、实施例3、实施例4制备的外泌体鼻喷雾剂的稳定性，具体步骤如下：
59.(1)分别于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、15d、30d各收集实施例2、实施例3、实施例4制备的外泌体鼻喷雾剂。
60.(2)bca蛋白浓度检测试剂盒及酶标仪检测收集溶液中的外泌体蛋白浓度，重复3次。
61.(3)各时间点外泌体蛋白浓度曲线绘制,如图1所示。
62.综上所述，本实施例提供这种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，间充质干细胞外泌体的原料是脐带，其采集为无创性操作，且脐带属于废弃物再利用，不涉及法律伦理问题，脐带的来源广泛、数量充足，能够满足规模化生产需求；该外泌体鼻喷雾剂可获得与mscs输注类似的疗效，避免了干细胞治疗带来的风险，为神经功能缺失患者提供了治疗新策略，并且鼻腔喷雾的给药方式便捷无痛，接受度更高，避免了干细胞治疗带来的植入失败风险及排斥风险。
63.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：按质量组计份，包括以下成分：外泌体10-30份、去离子水40-60份、吸收促进剂5-8份、稳定剂3-5份、防腐剂3-5份。2.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：所述吸收促进剂为聚山梨酯。3.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：所述稳定剂为甘露醇。4.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：所述防腐剂为苯甲酸钠。5.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：按质量组计份，包括以下成分：外泌体15份、去离子水50份、吸收促进剂6份、稳定剂4份、防腐剂4份。6.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：所述按质量组计份，包括以下成分：外泌体20份、去离子水50份、吸收促进剂7份、稳定剂4份、防腐剂4份。7.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，其特征在于：所述按质量组计份，包括以下成分：外泌体10份、去离子水45份、吸收促进剂7份、稳定剂4份、防腐剂4份。8.如权利要求1所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂的制备方法，其特征在于：将制备原料按配方混合，混和后进行搅拌，搅拌速率为260r/min，搅拌时间为12min；搅拌后所得混合液体进行超声分散，超声分散时间为30min；超声分散后将其分装至喷壶内，所得即为外泌体的鼻喷雾剂。9.如权利要求8所述的一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂的制备方法，其特征在于：所述外泌体的鼻喷雾剂为溶液，其ph值为6。

技术总结
本发明提供了一种用于治疗神经功能缺失的外泌体的鼻喷雾剂，按质量组计份，包括以下成分：外泌体10-30份、去离子水40-60份、吸收促进剂5-8份、稳定剂3-5份、防腐剂3-5份；该外泌体鼻喷雾剂可获得与MSCs输注类似的疗效，避免了干细胞治疗带来的风险，为神经功能缺失患者提供了治疗新策略，并且鼻腔喷雾的给药方式便捷无痛，接受度更高，避免了干细胞治疗带来的植入失败风险及排斥风险。植入失败风险及排斥风险。植入失败风险及排斥风险。


技术研发人员：晁晓东 蔡敏
受保护的技术使用者：陕西初源外泌体生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/19