水稻耐盐相关分子标记及其应用

1.本发明属于农业生物技术领域，涉及一种水稻耐盐相关分子标记及其应用。


背景技术：

2.土壤盐渍化是我国农业生产面临的重大问题，我国受盐渍化威胁的土地面积占总耕地面积的20％以上，其中具有农业利用潜力的近2亿亩，占我国耕地总面积的10％以上。随着我国经济和社会的发展，城市化进程不断加快，将会不可避免的占用一部分高产农用耕地。在耕地面积不断减少的条件下，为保证我国人民粮食、蔬菜等产量基本满足需要，在广大面积的盐碱地中种植作物是一个具有潜在价值的重要途径。然而同多数作物相同水稻对盐胁迫敏感，严重制约滨海、东北及河套地区稻作区的水稻产量。通过常规育种培育水稻耐盐新品种周期长、成本高，而通过鉴定水稻耐盐相关相关位点，发掘耐盐基因资源，开发分子标记辅助育种设计及选择将加速耐盐水稻新品种培育进程。
3.植物耐盐性是受多基因调控，包括盐胁迫信号感受、信号传导、离子转运、盐胁迫导致的生长减缓、细胞分裂减少、细胞壁伸展调节、渗透调节及光合速率降低等多方面影响，已证明参与相关进程的基因超过100个。因为作物的耐盐性受多个微效基因控制，缺乏有效的耐盐相关基因资源是限制水稻耐盐育种的重要瓶颈。水稻自然资源因其遗传多样性丰富，是鉴定耐盐相关基因的重要材料。


技术实现要素：

4.本发明的目的是公布通过对水稻自然资源开展田间耐盐性鉴定、全基因组关联分析鉴定出一个新水稻耐盐相关位点，并开发出其分子标记，用于耐盐水稻分子设计和筛选。
5.本发明提供一种水稻耐盐相关分子标记，其位于5号染色体上发现gwas信号位点，，与该位点紧密连锁的snp为m5_29816，位于水稻参考基因组irgsp1.0 5号染色体29,816,575位，多态位点为g/a。
6.进而本发明提供一种鉴定水稻耐盐相关分子标记的方法，其检测所述的水稻耐盐相关分子标记的多态性，即水稻参考基因组irgsp1.0 5号染色体29,816,575位为g基因型或a基因型或ga混合基因型。
7.具体地，所述检测采用pcr扩增来进行。
8.优选地，所述pcr为kasp技术。
9.更具体地，采用的引物如下：
10.snp_g 5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctaccaagtgatatgttcgaagatagtctatg-3’；
11.snp_a 5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattaccaagtgatatgttcgaagatagtctata-3’；
12.common 5
’‑
tgaagcttcgttgttagatgcga-3’。
13.进一步地，利用所述引物及kasp master mix，以水稻基因组dna为模板，采用kasp进行实时定量荧光pcr仪上开展pcr扩增，荧光检测和数据分析。
14.在具体实施方式中，pcr程序为：94℃ 15分钟；94℃ 20秒，60℃ 60秒，10个循环，
每个循环降低0.6℃；94℃ 20秒，55℃ 60秒，30个循环。反应完成后读取fam和hex通道荧光信号，fam信号对应g基因型，hex信号对应a基因型。
15.本发明由此提供所述的水稻耐盐相关分子标记或所述的方法在水稻育种中的应用。
16.具体地，所述育种是培育或筛选耐盐的目的水稻品种；所述标记用于分子标记辅助选择。
17.优选地，所述目的水稻品种为aa基因型或ga杂合基因型。
18.本发明具有以下有益效果：
19.在耐盐水稻品种筛选中，可以利用本发明所述分子标记从水稻自然资源中筛选aa基因型，然后开展田间耐盐性评价，减少田间试验工作量，提高效率，降低成本。在分子标记辅助育种中，利用本发明所述分子标记可以确定f1真杂合子，将f1杂合子与亲本回交，加快耐盐水稻育种进程。
附图说明
20.图1盐胁迫下水稻产量gwas结果。其中，水平虚线表示显著性阈值p＝10-5
，箭头位置表示snp分子标记m5_29816的位置。
21.图2杂交群体子代中snp分子标记m5_29816检测的不同基因型盐胁迫下单株产量比较。其中，图中每个点代表一个重组自交系，以t检验作组间比较。
具体实施方式
22.实施例1：水稻耐盐相关位点的定位
23.首先选取500余份水稻自然资源开展田间水稻耐盐性鉴定，方法简述如下：水稻种子常温下浸种1天后，播种于苗床，苗龄4周时单株插秧，株距15cm，行距25cm。插秧15天后，灌溉含盐0.3％的盐水，直到成熟。期间不断测定稻田中含盐量，通过调整所灌溉盐水浓度使稻田中盐浓度保持在0.3-0.4％。成熟后单株收获，晒干，脱粒，称重，每个品种10个重复，最后计算产量平均值。
24.水稻基因型通过二代高通量测序方法鉴定，过程如下。取100mg水稻叶片，液氮冷冻后，研磨，以ctab法提取基因组dna。建库后在novaseq平台测序，获得测序数据fastaq文件，然后利用bwa比对到水稻参考基因组irgsp1.0。按照gatk流程分析snp/indel，从而获得水稻基因型数据。
25.水稻耐盐相关位点全基因组关联分析(gwas)。上述基因型数据经质量过滤、缺失值插补后，结合产量表型数据，以gemma混合线性模型开展关联分析，在5号染色体上发现gwas信号位点，与该位点紧密连锁的snp为m5_29816，如图1所示。
26.实施例2：分子标记pcr鉴定引物开发
27.snp分子标记m5_29816位于水稻参考基因组irgsp1.0 5号染色体29,816,575位，多态位点为g/a。从基因组组获取其300bp侧翼序列(序列表seq id no.1)，序列如下：
28.seq id no.1，分子标记m5_29816侧翼300bp序列
29.tccacaactctcggagtgaagagtacttagttgacaaaggtcaaaagatgattgatagaagatatcgaaaaagatgtttattaccaggcaaagaagtaggtcgaaaggtgattgataagagaaatcgggaaagaacacatcaag
gtcaaaggtgtaaaggaatacgttgaatgctaactgaggacaacatgaagagaatagtgggaagtgaaccaaatgtaaagaaagtgaatccgagttgcttgttcgtgagagctattcccagttatgaaccaagtgatatgttcgaagatagtctat[g/a]gaggtcagattaaaatcgcatctaacaacgaagcttcagatttggcaggataacgat cagaccataacaagtccagcagtaaagtcatttggggagacgtcaaagcatgtcaagtgggataagttggttctttttagaaacataattcaaaggcaaagttatcgaccctcgcatcgaatagcagaagtagctagcacccggagaccaggaaagctaatatgaggcagttggtggcaagttagaagtaaatgacaagcatgatattctcatgatgacaagcatggtatcctagtaatgacg
[0030]
利用primer3设计竞争性等位基因特异性pcr(kasp)引物如下：
[0031]
snp_g 5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctaccaagtgatatgttcgaagatagtctatg-3’；
[0032]
snp_a 5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattaccaagtgatatgttcgaagatagtctata-3’；
[0033]
common 5
’‑
tgaagcttcgttgttagatgcga-3’.
[0034]
利用上述引物及kasp master mix，以下表中水稻品种叶片dna为模板，采用kasp技术在lgc snpline平台，或abi7500/7900等实时定量荧光pcr仪上开展pcr扩增及荧光检测和数据分析。pcr程序为：94℃ 15分钟；94℃ 20秒，60℃ 60秒，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃ 20秒，55℃ 60秒，30个循环。反应完成后读取fam和hex通道荧光信号，fam信号对应g基因型，hex信号对应a基因型。
[0035]
用上述方法检测了20种水稻自然种质资源分子标记m5_29816基因型，结果如下表所示：
[0036][0037][0038]
实施例3：分子标记辅助选择应用
[0039]
为了验证snp分子标记m5_29816是否可以用于育种选择，我们将水稻品种盐丰47
(gg基因型)与pokkali(aa基因型)杂交，f2群体单粒传代，获得重组自交系群体，然后按照实施1的方法田间鉴定水稻产量，并按照实施2的方法用snp分子标记m5_29816鉴定重组自交系基因型，结果如下表及图2所示。结果表明基因型aa及杂合ga重组自交系的单株产量均显著高于gg基因型。这表明在耐盐水稻选育中可以利用分子标记m5_29816作辅助选择。
[0040]
[0041]
[0042]

技术特征：
1.一种水稻耐盐相关分子标记，其位于5号染色体上发现gwas信号位点，与该位点紧密连锁的snp为m5_29816，位于水稻参考基因组irgsp1.05号染色体29,816,575位，多态位点为g/a。2.一种鉴定水稻耐盐相关分子标记的方法，其特征在于，检测如权利要求1所述的水稻耐盐相关分子标记的多态性，即水稻参考基因组irgsp1.05号染色体29,816,575位为g基因型或a基因型或ga混合基因型。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测采用pcr扩增来进行。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pcr为kasp技术。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用的引物如下：snp_g5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctaccaagtgatatgttcgaagatagtctatg-3’;snp_a5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattaccaagtgatatgttcgaagatagtctata-3’;common5
’‑
tgaagcttcgttgttagatgcga-3’。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用所述引物及kaspmastermix，以水稻基因组dna为模板，采用kasp进行实时定量荧光pcr仪上开展pcr扩增，荧光检测和数据分析。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，pcr程序为：94
°
c15分钟；94
°
c20秒，60
°
c60秒，10个循环，每个循环降低0.6
°
c；94
°
c20秒，55
°
c60秒，30个循环，反应完成后读取fam和hex通道荧光信号，fam信号对应g基因型，hex信号对应a基因型。8.如权利要求1所述的水稻耐盐相关分子标记或如权利要求2至7任一项所述的方法在水稻育种中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述育种是培育或筛选耐盐的目的水稻品种；所述标记用于分子标记辅助选择。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的水稻品种为aa基因型或ga杂合基因型。

技术总结
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种水稻耐盐相关分子标记开发及应用。其位于5号染色体上发现GWAS信号位点，与该位点紧密连锁的SNP为m5_29816，位于水稻参考基因组IRGSP1.0 5号染色体29,816,575位，多态位点为G/A。利用该分子标记从水稻自然资源中快速筛选该位点AA基因型水稻品种，作为后期田间水稻耐盐性目标品种，减少田间试验工作量。在育种中，通过杂交将AA基因型导入GG基因型受体品种，利用该分子标记从分离群体鉴定AA基因型个体，结合农艺性状评价，加快耐盐分子标记育种进程。加快耐盐分子标记育种进程。


技术研发人员：权瑞党 王娟 秦华 黄荣峰
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：2023.03.09
技术公布日：2023/7/19