傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用

1.本发明涉及一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。


背景技术：

2.骨转移是前列腺癌(prostate cancer，pca)患者的主要死因，目前化疗仍然是pca骨转移的主要治疗方法之一。但化疗易导致胃肠道反应、神经病变等副作用，因此探索有效且毒副作用小的治疗药物具有重要临床价值。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用解决上述提到的技术问题，具体采用如下的技术方案：
4.一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。
5.进一步地，所述傣百解提取物的提取方法为：
6.傣百解切段粉碎，加入10倍量95％乙醇浸润，回流提取一定时间，提取液冷却后过滤，减压浓缩得到提取物浸膏，浸膏用蒸馏水混悬后，用等量的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位。
7.进一步地，所述傣百解提取物为甾体皂苷化合物。
8.进一步地，所述药物通过所述傣百解提取物抑制fdx1蛋白以治疗前列腺癌。
9.进一步地，所述药物通过所述傣百解提取物抑制fdx1蛋白以下调前列腺癌的肿瘤转移相关蛋白的表达。
10.进一步地，所述肿瘤转移相关蛋白包含vimentin、snail2、twist1、vegfa、il-11、mmp1、mmp6、mmp9、mmp10、mmp12和mmp13中的至少一种。
11.进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
12.进一步地，所述药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。
13.进一步地，所述药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。
14.本发明的有益之处在于所提供的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，揭示了傣百解提取物能有效抑制前列腺癌pc-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
15.本发明的有益之处在于所提供的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，揭示了傣百解提取物能抑制fdx1蛋白表达，进而影响前列腺癌骨转移pc-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
附图说明
16.图1为傣百解提取物抑制pc-3细胞增值的示意图；
17.图2为傣百解提取物诱导pc-3细胞迁移的示意图；
18.图3为傣百解提取物抑制pc-3细胞侵袭的示意图；
19.图4为傣百解提取物抑制pc-3细胞中的fdx1的表达的示意图；
20.图5为fdx1可逆转傣百解提取物对pc-3细胞侵袭和迁移的抑制作用的示意图；
21.图6为fdx1可逆转傣百解提取物对pc-3中细胞因子表达的抑制作用的示意图。
具体实施方式
22.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
23.傣百解为萝藦科牛奶菜属植物通光散的木质藤本，傣百解傣名“雅解先打”，意为解百毒的药，是傣族最具特色的“解药”品种之一，具有清火解毒、消肿止痛之功效，常用于咽喉肿痛、疗疡斑疹、肺热咳嗽、解药食毒等。本技术以前列腺癌细胞pc-3为研究对象，确认了傣百解及fdx1在pca中的相互作用。
24.1.材料
25.1.1人前列腺癌pc-3细胞(购自美国典型培养物atcc保藏中心)，使用补充有10％胎牛血清、5％青霉素和链霉素的1640培养基培养(购自美国gibco公司)；
26.1.2rpmi 1640培养基、0.25％胰蛋白酶-edta(购自美国hyclone公司)；
27.1.3胎牛血清、青霉素/链霉素(购自美国gibco公司)；fdx1抗体(购自美国cell signaling technology公司)；cck-8细胞活性检测试剂盒(购自中国北京全式金生物技术有限公司)；
28.1.4rna提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量pcr试剂盒(购自日本takar公司)；
29.1.5pcr引物(购自广州四和生物科技股份有限公司)；
30.1.6bca蛋白浓度测定试剂盒、超敏ecl化学发光试剂盒(购自中国碧云天生物科技公司)；
31.1.7细胞因子抗体阵列(购自abcam公司)；
32.1.8傣百解采自中国医学科学院药用植物研究所云南分所栽培基地，生长年限为2年，集同一植株的地上部分和根，切成段后晒干后粉碎备用；
33.1.9co2细胞培养箱、冷冻高速离心机、超净生物安全工作台(美国thermo fisher公司)，荧光显微镜(德国leica公司)，垂直凝胶转印系统(美国biorad公司)，美国biotek公司)。
34.2.实验
35.2.1傣百解提取物的制备、萃取与鉴定
36.傣百解切段粉碎，取粉末400g，加入10倍量95％乙醇浸润，回流提取2h，提取液冷却后过滤，减压浓缩得到提取物浸膏，提取率为13.0％。浸膏用蒸馏水500ml混悬后，实用等量的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位(ethyl acetate fraction，efa)，即本技术的得率为5.9％。采用试管法、滤纸片法等方法检测efa活性部位中可能存在的化学成分类型，结果显示，efa中主要含有甾体皂苷和有机酸类化合物。
37.2.2cck8检测细胞活力
38.使用0.25％的胰酶消化pc-3细胞制备细胞悬液，以3
×
103个/孔密度接种至96孔培养板中，待细胞贴壁后按以下分组加药。正常对照组:培养细胞不加药物处理，只加培养液。给药组：分6个剂量组，在培养液中加入傣百解提取物eaf，药液终浓度分别为0.75、1.5、
3、6、12、24μg/ml，继续培养24h后各孔加入10μl cck8试剂孵育2小时，然后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值，每组设3个重复。
39.2.3transwell试验
40.使用0.25％胰酶消化pc-3细胞后用制成细胞悬液，将调整好的密度1
×
106个/ml的pc-3细胞悬液100μl接种于transwell上室，下室加入不同浓度傣百解提取物eaf溶液(0、1.5、3、6μg/ml)，然后继续培养24h。取出transwell小室，固定pc-3细胞30min，洗涤后小心去除上室面的pc-3细胞，选用0.1％的结晶紫染色剂对标本染色20min，晾干，倒置显微镜下观察细胞特点，然后随机选取5个高倍视野，对pc-3细胞进行拍照并且计算数量，算出平均值。在检测细胞的迁移能力时，不需要在上室中添加matrigel基质胶，而在检测细胞侵袭能力时，需要将matrigel基质胶稀释液(1：5)包被在transwell上室中，其余条件同迁移试验。
41.2.4qrt-pcr分析
42.pc-3细胞分别与浓度为0、1.5、3、6μg/ml的傣百解提取物eaf溶液共同培养24h，低温环境下抽提细胞中总的rna，然后将总rna样本立即逆转录成cdna。使用实时pcr试剂盒进行pcr扩增共40个循环。采用2-δδct法计算fdx1 mrna的相对表达水平。
43.2.5细胞转染
44.使用0.25％胰酶消化pc-3细胞后制成细胞悬液，接种至6孔平板中(1
×
106个/孔)，在37℃、5％ co2培养箱中培养细胞密度至40％，使用lipofectamine 3000转染试剂将fdx1、fdx1-rnai转染入pc-3细胞。
45.2.6western blot分析
46.在100mm2培养皿中分别接种四组pc-3细胞，使用混合裂解液提取各组处理24h后pc-3的细胞总蛋白，对总蛋白进行bca标准法定量。在10％～12％的sds-page凝胶中对其进行电泳，然后pvdf膜中电转，2h后用2％ bsa封闭，1h后加入一抗稀释液fdx1，避光低温中孵育。然后加入二抗低速震荡1h，洗涤3次，选用ecl发光检测，曝光条带成像。所有实验均重复3次。
47.2.7细胞因子检测
48.首先按以下eaf组、si-fdx1组、fdx1组、si-fdx1+eaf组及fdx1+eaf分组处理细胞24小时后，收集各处理组的细胞上清液并通过细胞因子抗体阵列检测了11种细胞因子的表达，操作方法按照试剂标准方案进行。
49.2.8统计学方法
50.用spss 20.0及graphpad prism进行统计分析和作图，用均数
±
标准差表示资料的数据。通过t检验、单因素方差分析方法对数据进行分析，p＜0.05代表差异有统计学意义。
51.3.结果
52.3.1傣百解提取物eaf抑制pc-3细胞增殖
53.分别用0、0.75、1.5、3、6、12μg/ml的eaf溶液处理pc-3细胞，然后通过cck8验检测细胞增殖。如图1所示，与对照组相比，eaf对pc-3细胞增殖具有抑制作用，且显示出浓度依赖关系(p＜0.01)。
54.3.2傣百解提取物eaf抑制pc-3细胞迁移能力
55.分别用0、1.5、3、6μg/ml的eaf溶液处理pc-3细胞24h后，如图2所示，transwell实
验结果显示eaf可抑制pc-3细胞的迁移能力，与对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.01)。
56.3.3傣百解提取物eaf抑制pc-3细胞侵袭能力
57.pc-3细胞分别用0、1.5、3、6μg/ml的eaf溶液处理24h后，采用基质包被的transwell检测pc-3细胞的侵袭能力。如图3所示，eaf可抑制pc-3细胞的侵袭能力，差异与对照组相比具有统计学意义(p＜0.01)。
58.3.4傣百解提取物eaf抑制pc-3细胞中铜死亡关键基因fdx1的表达
59.用不同浓度0、1.5、3、6μg/ml的eaf溶液处理pc-3细胞24h，然后用pcr和western blot实验检测pc-3细胞中基因fdx1的表达情况。如图4所示，与对照组相比，eaf呈浓度依赖性抑制fdx1 mrna的表达(p＜0.01)。同时，eaf呈浓度依赖性下调pc-3细胞中fdx1蛋白的表达，与对照组相比差异具有统计学意义。
60.3.5过表达fdx1逆转傣百解提取物eaf对pc-3细胞迁移与侵袭的抑制能力
61.设置eaf组、si-fdx1组、fdx1组、si-fdx1+eaf组及fdx1+eaf组，通过transwell实验研究各组对pc-3细胞的侵袭和迁移的影响。如图5所示，与对照组比，eaf组、si-fdx1组及si-fdx1+eaf组中pc-3细胞的侵袭和迁移能力被显著抑制(p＜0.01)，而fdx1组及fdx1+eaf组细胞的侵袭和迁移能力较对照组无统计学差异(p＞0.05)。
62.3.6傣百解提取物eaf抑制pc-3细胞因子的表达
63.为了进一步研究eaf及fdx1对pc-3细胞内细胞因子表达的影响，本技术通过试验检测了eaf在对pc-3细胞中vimentin、snail2、twist1、vegfa、il-11、mmp1、mmp6、mmp9、mmp10、mmp12和mmp13表达变化的影响。如图6所示，结果显示eaf组、si-fdx1组及si-fdx1+eaf组中pc-3细胞上述细胞因子的表达被显著抑制，而过表达fdx1组细胞因子的表达明显升高。其中以twist1、mmp10最为显著。
64.在本技术的试验中，制备了eaf溶液，然后通过cck8检测了0、0.75、1.5、3、6、12μg/ml的eaf溶液对pc-3细胞增殖的影响，结果eaf能显著抑制pc-3细胞的增殖。在此基础上分别用0、1.5、3、6μg/ml的eaf溶液处理pc-3细胞，并通过transwell实验检测了ea对pc-3细胞转移能力的影响，结果显示eaf可抑制pc-3细胞的迁移与侵袭能力。上述结果表明来源于傣百解的eaf溶液具有一定的抗前列腺癌作用。
65.在本技术的试验中，通过pcr和western blot检测了0、1.5、3、6μg/ml的eaf溶液处理pc-3细后fdx1的表达情况，结果发现eaf呈浓度依赖性抑制fdx1 mrna及蛋白的表达。因此，eaf对pc-3细胞发挥的抗瘤作用与抑制铜死亡关键调节因子fdx1的表达相关，即eaf可能通过抑制fdx1蛋白表达，进而影响前列腺癌骨转移pc-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
66.多种细胞蛋白如vimentin、snail2、twist1、vegfa、il-11和mmps等与肿瘤的恶性行为密切相关，它们参与调控肿瘤细胞生长、增殖、侵袭、血管生成及转移。mmps是一类锌依赖性内源性蛋白酶，在组织重塑和细胞外基质各种蛋白质的降解中具有多种作用。目前已知mmps可促进细胞增殖、迁移和分化，并在细胞凋亡、血管生成、组织修复和免疫应答中发挥作用，同时影响细胞表面的生物活性分子并调节着各种细胞和信号传导途径。mmp-1、mmp-6、mmp-9、mmp-10、mmp-11及mmp-12是mmps家族成员之一，mmp可以水解细胞外基质相关成分从而使肿瘤细胞对周围组织具有更强的侵袭能力。此外，twist1是基本螺旋-环-螺旋转录因子家族的一员，是诱导癌细胞emt、迁移和侵袭的重要转录因子，twist1在许多侵袭
性癌症中高度表达并充当致癌基因。本技术的实验中，通过细胞因子抗体阵列检测了11种细胞因子的表达，结果显示eaf和抑制fdx1可以下调肿瘤转移相关蛋白的表达，而上调fdx1后肿瘤转移相关蛋白的表达明显上调，同时eaf和上调fdx1具有协同抑制肿瘤转移相关蛋白表达的作用。因此，eaf可以通过抑制肿瘤转移相关蛋白表达，进而影响前列腺癌骨转移pc-3细胞的增殖、迁移和侵袭黏附能力。
67.综上所述，傣百解提取物eaf可以抑制pc-3细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制与eaf抑制fdx1及肿瘤转移相关蛋白表达有关，这为eaf临床治疗前列腺癌提供了理论依据和新的希望。
68.本技术提出一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。傣百解提取物的提取方法为：傣百解切段粉碎，加入10倍量95％乙醇浸润，回流提取一定时间，提取液冷却后过滤，减压浓缩得到提取物浸膏，浸膏用蒸馏水混悬后，用等量的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位。进一步地，傣百解提取物为甾体皂苷化合物。
69.药物通过傣百解提取物抑制fdx1蛋白以治疗前列腺癌骨转移。
70.进一步地，药物通过傣百解提取物抑制fdx1蛋白以下调前列腺癌的肿瘤转移相关蛋白的表达。肿瘤转移相关蛋白包含vimentin、snail2、twist1、vegfa、il-11、mmp1、mmp6、mmp9、mmp10、mmp12和mmp13中的至少一种。
71.该药物还包括药学上可接受的载体。药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。该药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。
72.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述傣百解提取物的提取方法为：傣百解切段粉碎，加入10倍量95％乙醇浸润，回流提取一定时间，提取液冷却后过滤，减压浓缩得到提取物浸膏，浸膏用蒸馏水混悬后，用等量的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位。3.根据权利要求1或2所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述傣百解提取物为甾体皂苷化合物。4.根据权利要求1所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述药物通过所述傣百解提取物抑制fdx1蛋白以治疗前列腺癌骨转移。5.根据权利要求4所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述药物通过所述傣百解提取物抑制fdx1蛋白以下调前列腺癌的肿瘤转移相关蛋白的表达。6.根据权利要求5所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤转移相关蛋白包含vimentin、snail2、twist1、vegfa、il-11、mmp1、mmp6、mmp9、mmp10、mmp12和mmp13中的至少一种。7.根据权利要求1所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。8.根据权利要求7所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述药学可接受的载体包括稀释剂、赋形剂、崩解剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活化剂、稳定剂中的任何一种或多种组合。9.根据权利要求7所述的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂中的任一种。

技术总结
本发明公开了一种傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用。本发明的傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用，公开了傣百解提取物能有效抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。迁移和侵袭能力。迁移和侵袭能力。


技术研发人员：黄帅 瓦庆德 李晓花 唐欲博 黄彦
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第二医院
技术研发日：2023.03.06
技术公布日：2023/7/19