屎肠球菌、含有该菌的菌剂及其在制备抑制致病菌产品中的应用

1.本发明涉及医药生物技术，具体地，涉及一种屎肠球菌、含有该菌的菌剂及其在制备抑制致病菌产品中的应用。


背景技术：

2.结肠癌是实体癌中发病率和死亡率最高的肿瘤之一，且发病率呈稳步上升趋势。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移，因此其恶性程度极高，转移性强，治愈率较低且预后差，并且出现越来越年轻化的趋势。
3.目前临床上结肠癌的主要治疗方法包括手术治疗、放化疗、靶向治疗、中医治疗等，但是，这些方式均存在一定的局限性，例如，手术治疗的复发率高，依从性差；化学疗法可通过诱导dna损伤或启动多种信号传导途径来诱导癌细胞死亡，对于分期较早的结肠癌患者，辅助化疗的治疗方法也逐渐成熟，但仍会出现强烈的副作用，且患者容易复发。因此，迫切需要寻求高效低毒的抗肿瘤药物来靶向治疗结肠癌。
4.近期的研究发现，具核梭菌的丰富度与结肠癌的发生存在显著性的相关性，具核梭菌作为致病菌，在结肠癌组织中富集，可影响结肠癌进展中的多个阶段，促进结肠癌细胞的增殖、肿瘤免疫逃逸、复发和化疗耐药性风险等。
5.鉴于上述手术和化疗方式存在的缺陷，如果能够针对结肠癌的致病菌具核梭菌进行靶向的抑制干预，对结肠癌的治疗具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种屎肠球菌、含有该菌的菌剂及其在制备抑制致病菌产品中的应用，该屎肠球菌能够有效拮抗抑制致病菌具核梭菌，且耐酸、耐胆盐、生物安全性高，具有潜在的临床结肠癌肿瘤辅助治疗效果。
7.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种屎肠球菌(enterococcus faecium)，所述屎肠球菌的保藏编号为cctcc no:m 20221902。
8.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的屎肠球菌。
9.优选地，所述菌剂含有所述屎肠球菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种；优选为活菌体。
10.优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。
11.优选地，所述菌剂为所述屎肠球菌的菌落浓度为10
6-108cfu/ml的液态菌剂。
12.本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将保藏编号为cctcc no:m 20221902的屎肠球菌进行活化得到活化菌体；
14.(2)将步骤(1)得到的活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，制得液态菌剂。
15.优选地，所述活化采用的活化培养基含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母
提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l、琼脂12-18g/l；所述发酵培养基含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l。
16.优选地，所述活化的条件至少满足：温度为30-45℃、时间为24-48h；所述发酵的条件至少满足：温度为30-45℃、转速为150-200rpm、时间为20-60h。
17.本发明第四方面提供上述的屎肠球菌、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备抑制致病菌产品的中的应用，所述致病菌为具核梭菌。
18.优选地，所述抑制致病菌产品选自药物、食品和动物饲料添加剂中的至少一者。
19.优选地，所述药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂中的至少一种。
20.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
21.本发明提供的屎肠球菌具有独特的抑制具核梭菌的特性，在应用于结肠癌的治疗时，该屎肠球菌不仅对结肠癌的致病菌具核梭菌具有显著的抑制效果，而且能够增敏奥沙利铂对结肠癌的抗肿瘤效果，对结肠癌的治疗具有辅助作用，抑制肿瘤疾病进展。
22.本发明提供的屎肠球菌还具有耐酸、耐胆盐等特性，不产生吲哚、胺等有害代谢物，生物安全性高，可用于生产药物、食品的添加剂，添加于药物、食品中，实现其对结肠癌患者的辅助治疗、保健作用等，尤其是结肠癌肿瘤组织中富集具核梭菌的患者，辅助治疗效果更佳。进一步地，本发明提供的屎肠球菌也可以用于动物饲料添加剂中，以对动物的结肠癌肿瘤进行辅助治疗、保健。
23.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
24.生物保藏
25.本发明提供的菌株为屎肠球菌(enterococcus faecium lmx47)，并于2022年12月09日被保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室，邮政编码：430072，保藏单位的缩写为cctcc)，保藏编号为cctcc no:m 20221902。
附图说明
26.图1是实施例1中屎肠球菌lmx46和lmx47特异性基因ddi、soda的鉴定结果；
27.图2是实施例2中屎肠球菌lmx46和lmx47的耐酸耐胆盐实验结果，其中a为模拟胃肠液耐受性实验，b为胆盐耐受性实验图；
28.图3是实施例3中屎肠球菌lmx46和lmx47的安全性检测结果，其中a为溶血活性实验结果，b为偶氮还原实验结果，c为明胶液化实验结果，d为吲哚实验结果，e为生物胺生产实验结果，odc为鸟氨酸脱羧酶，ldc为赖氨酸脱羧酶，hdc为组氨酸脱羧酶；
29.图4是实施例4中屎肠球菌lmx46和lmx47的培养上清液、细菌细胞和细菌悬浮液对具核梭菌的抑制作用图；
30.图5是实施例5中屎肠球菌lmx47辅助奥沙利铂在小鼠结肠癌模型中的治疗效果图；
31.图6是实施例6中屎肠球菌lmx47和屎肠球菌atcc 51559对金黄色葡萄球菌的抑制作用图，a为屎肠球菌lmx47、b为屎肠球菌atcc 51559。
具体实施方式
32.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
33.本发明第一方面提供一种屎肠球菌(enterococcus faecium)，所述屎肠球菌的保藏编号为cctcc no:m 20221902。
34.本发明提供的屎肠球菌分离自pd-1治疗响应性较好的肺癌患者粪便中(采集地为江苏省人民医院肿瘤科，南京)。所述屎肠球菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法。示例性地，本发明提供的屎肠球菌分离过程具体包括：将pd-1抗体治疗响应性好的肺癌患者的粪便分别在mrs培养基、tsa培养基和哥伦比亚血平板上进行稀释涂板，37℃培养24h-48h，挑取各个平板上的单菌落至对应的液体培养基中进行活化，37℃静置培养24h-48h；然后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)对细菌进行快速鉴定，初步筛选出了两株屎肠球菌，再根据细菌基因组dna提取试剂盒上的操作提取这两株的基因组dna并进行pcr扩增测序，对菌株进行分子生物学鉴定。
35.本发明的发明人从筛选出的菌株中选取了一株能够明显形成抑制具核梭菌的抑菌圈的菌株，进行了dna提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的16srdna序列与屎肠球菌(enterococcus faecium)高度相似，并具有屎肠球菌的特异性基因ddi、soda，可以确定该菌株为屎肠球菌(enterococcus faecium lmx47)，并于2022年12月09日被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20221902。
36.本发明提供的屎肠球菌经过培养能够产生大量的屎肠球菌的活菌体和/或发酵产物。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述屎肠球菌大量增殖即可，例如，可以按照不低于0.5体积％的接种量将屎肠球菌的活菌体接种于培养基中，并且在30-45℃的温度下培养不少于12h后，得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如，可以为mrs液体培养基。
37.本发明可以进一步分离上述培养液中的屎肠球菌的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件，此为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
38.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的屎肠球菌。
39.在本发明中，对所述菌剂中屎肠球菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
40.根据本发明，所述菌剂优选含有所述屎肠球菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种，更优选为活菌体。在本发明中，术语“发酵产物”指的是屎肠球菌在发酵或培养过程中产生的代谢产物(包括胞内代谢产物和/或胞外代谢产物)。
41.根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其
制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为屎肠球菌的菌液)和/或固态菌剂(例如可以为屎肠球菌干燥制成的粉剂或经分离纯化等步骤制备成高纯度制剂)。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所熟知，在此不再详细赘述。进一步优选地，所述菌剂为所述屎肠球菌的菌落浓度为10
6-108cfu/ml的液态菌剂。
42.本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，包括以下步骤：
43.(1)将保藏编号为cctcc no:m 20221902的屎肠球菌进行活化得到活化菌体；
44.(2)将步骤(1)得到的活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，制得液态菌剂。
45.根据本发明，所述活化采用的培养基可以是本领域中常见的培养基，优选情况下，所述活化采用的培养基的组分含有：碳源、氮源、钾盐、镁盐、铵盐、钠盐和锰盐，具体可以含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l、琼脂12-18g/l。
46.根据本发明，所述发酵培养基可以是本领域中常见的液态培养基，优选情况下，所述发酵培养基的组分含有：碳源、氮源、钾盐、镁盐、铵盐、钠盐和锰盐，具体可以含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l。
47.根据本发明，所述活化的条件至少满足：温度为30-45℃，具体可以为30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为24-48h，具体可以为24h、30h、36h、42h、48h，或者上述两个值之间的任意值；所述发酵的条件至少满足：温度为30-45℃，具体可以为30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃，或者上述两个值之间的任意值；转速为150-200rpm，具体可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或者上述两个值之间的任意值；时间为20-60h，具体可以为20h、30h、40h、50h、60h，或者上述两个值之间的任意值。
48.本发明提供的屎肠球菌不仅能够抑制金黄色葡萄球菌，还具有独特的抑制具核梭菌的特性，在应用于结肠癌的治疗时，该屎肠球菌不仅对结肠癌的致病菌具核梭菌具有显著的抑制效果，而且能够增敏奥沙利铂对结肠癌的抗肿瘤效果，对结肠癌的治疗具有辅助作用，抑制肿瘤疾病进展。基于此，本发明第四方面提供上述的屎肠球菌、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备抑制致病菌产品中的应用，其中，所述致病菌为具核梭菌。
49.根据本发明，优选地，所述抑制致病菌产品选自药物、食品和动物饲料添加剂中的至少一者。其中，所述抑制致病菌药物的剂型优选为选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂中的至少一种；所述食品可以是保健品。上述各种剂型的抑制致病菌药物均可以按照本领域的常规方法制备，也可以包含药学上可接受的载体。
50.根据本发明，所述抑制致病菌产品中屎肠球菌的含量可以根据剂量进行设计与调整。
51.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
52.以下实施例中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)为北京昊诺
斯科技有限公司生产、型号为5301455816；结肠癌ct-26细胞购自美国菌种保藏中心atcc、编号为atcc-9118，细菌基因组dna提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司、编号为b518225-0100，哥伦比亚血平板购自南京全隆生物技术有限公司，具核梭菌(fusobacterium nucleatum)由南京市口腔医院提供，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)购自购自美国菌种保藏中心atcc、编号为atcc 29213，大肠杆菌(escherichia coli)购自美国菌种保藏中心atcc、编号为atcc 25922，如无特殊说明，所用的实验材料均为常规生化试剂商店购买得到。
53.以下实施例中，活化培养基采用mrs固体培养基，其配方为：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母提取物5g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸二铵2g/l、乙酸钠5g/l、葡萄糖20g/l、吐温80 1g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.25g/l、琼脂15g/l，调ph为6.2-6.4，高压灭菌15min后备用；
54.发酵培养基采用mrs液体培养基，其配方为：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母提取物5g/l、磷酸氢二钾2g/l、柠檬酸二铵2g/l、乙酸钠5g/l、葡萄糖20g/l、吐温80 1g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.25g/l，调ph为6.2-6.4，高压灭菌15min后备用；
55.tsa培养基的配方为：胰酪胨15g/l、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/l、氯化钠5g/l、琼脂15g/l，调ph为7.1-7.5，高压灭菌15min后备用。
56.tsb培养基的配方为：胰蛋白胨15g/l、大豆蛋白胨5g/l、氯化钠5g/l、琼脂15g/l，调ph为7.0-7.4，高压灭菌15min后备用。
57.实施例1
58.1、菌株的分离
59.取pd-1抗体治疗响应性好的肺癌患者的粪便(采集地为江苏省人民医院肿瘤科，南京)，分别在mrs固体培养基、tsa培养基和哥伦比亚血平板上进行稀释涂板，37℃培养24-48h，挑取各个平板上的单菌落至对应的液体培养基中进行活化，37℃静置培养24-48h，然后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)对细菌进行快速鉴定，初步筛选出了两株屎肠球菌，编号分别为lmx46和lmx47；
60.2、菌株的分子生物学鉴定
61.根据细菌基因组dna提取试剂盒上的操作分别提取两株屎肠球菌lmx46和lmx47的基因组dna，并进行pcr扩增测序；
62.其中，细菌基因组dna提取步骤如下：
63.将筛选出来的两株屎肠球菌划线挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h后取1.5ml菌液，室温、8000rmp离心1min，收集菌体，加入180μl溶菌酶溶液(20mg/ml)重悬菌液，37℃水浴30min-60min(水浴期间每隔10min颠倒混匀一次)，再加入400μl buffer digestion，震荡混匀；接着65℃水浴1h至细胞完全裂解后加入20μl的rnasea(10mg/ml)，室温放置2-5min得到无rna的dna，再向其加入200μl buffer pb，充分颠倒混匀，-20℃放置5min，室温1000rmp离心5min，吸取上清液500μl转移到新的离心管中；加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2-3min，室温10000rmp离心5min，弃上清，加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1-3min，10000rmp离心2min，弃上清，如此重复两次；开盖室温倒置5-10min至乙醇完全挥发，将得到的dna用50μl te buffer溶解，得到基因组dna，于-20℃保存备用；
64.以两株屎肠球菌lmx46和lmx47提取的基因组dna为模板，采用细菌的通用引物对(核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示)进行pcr扩增，pcr扩增采用20μl体系为：正向引物1μl，反向引物1μl，prime star 10μl，dna模板1μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，56℃退火20s，72℃延伸1min，循环36次，再72℃延伸10min，4℃保存；
65.正向引物27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no.1)，反向引物1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’(seq id no.2)；
66.利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物的片段大小是否正确，将pcr产物送擎科生物科技有限公司测序，测序结果经ncbi数据库blast比对，与屎肠球菌(enterococcus faecium)高度相似。
67.屎肠球菌的管家基因具有高的保守性与差异性，比16s rrna基因测序具有更高的分辨率，更容易鉴别近亲细菌物种；因此选用屎肠球菌的两个种特异性基因ddl和soda进行pcr扩增，对lmx46和lmx47作进一步鉴定确认，其中，ddl基因是d-丙氨酸聚连接酶基因，序列大小约为550bp；soda基因是屎肠球菌的锰超氧化物歧化酶基因，是屎肠球菌aus0004菌株完全毒力所必需的重要抗氧化活性基因，序列大小约为216bp左右；pcr扩增均采用20μl体系：dna模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，prime star 10μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应条件为：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次，再72℃延伸7min，4℃保存；
68.pcr扩增ddl片段的引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示，
69.ddl正向引物27f：5
’‑
gcaaggcttcttagaga-3’(seq id no.3)，ddl反向引物1492r：5
’‑
catcgtgtaagctaacttc-3’(seq id no.4)，
70.pcr扩增soda片段的引物对的核苷酸序列如seq id no.5和seq idno.6所示，
71.soda正向引物27f：5
’‑
gaaaaaacaatagaagaattat-3’(seq id no.5)，
72.soda反向引物1492r：5
’‑
tgcttttttgaattcttcttta-3’(seq id no.6)；
73.利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物的片段是否与预期结果相一致，结果如图1所示，lmx46和lmx47两个菌株的特异性基因ddl和soda的pcr扩增结果与预期片段一致，证明两个菌株均确定为屎肠球菌；将两株屎肠球菌分别命名为屎肠球菌lmx46(enterococcus faecium lmx46)和屎肠球菌lmx47(enterococcus faecium lmx47)。
74.实施例2
75.对屎肠球菌lmx46和屎肠球菌lmx47进行耐酸耐胆盐的实验研究。
76.模拟胃肠液耐受性实验过程为：
77.a、模拟胃液的配制：吸取稀盐酸1.64ml，加水80ml与胃蛋白酶1g，摇匀后加水稀释至100ml，调ph为3.0，放入超净工作台灭菌半个小时，备用；
78.b、模拟肠液的配制：称取磷酸二氢钾0.68g，加水50ml溶解，用0.1mol/lnaoh调ph为6.8；另取胰蛋白酶1g，加水适量溶解，合并，加水稀释至100ml，放入超净工作台灭菌半个小时，备用；
79.c、将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到培养液，将培养液分别以10％(v/v)接种量接入到人工胃液中，37℃静置培养；取接种0h、1h、2h、3h的培养液，用无菌水连续10倍稀释至105倍、
106倍，取100μl涂于mrs平板，观察生长情况并进行菌落计数；接着取3h后的人工胃液培养液，以10％接种量接入到人工肠液中，37℃静置培养，取接种8h、13h、19h的培养液，用无菌水连续10倍稀释至105倍、106倍，取100μl涂于mrs平板，观察生长情况并进行菌落计数，结果见图2。
80.胆盐耐受性实验
81.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，以2％(v/v)接种量分别接种到胆盐质量浓度为0.1重量％、0.3重量％、0.5重量％的mrs液体培养基中，37℃静置培养3h后，采用mrs平板菌落计数法测定样品中的菌体数目，以不加胆盐的mrs液体培养基作对照，结果见图2。
82.结果如图2所示，lmx46和lmx47两株屎肠球菌均对ph为3.0的胃酸环境具有稳定的耐受性，3h以上仍保持100％的存活率。当胆盐浓度为0.1重量％和0.3重量％时，lmx47比lmx46具有较好的胆盐耐受性，胆盐培养基培养24h后，lmx47的存活率仍大于90％，表明屎肠球菌作为口服用益生菌，具有较好的耐酸、耐胆盐性质。
83.实施例3
84.对lmx46和lmx47两株屎肠球菌的安全性进行一系列检测，包括溶血活性实验、偶氮还原实验、明胶液化实验、吲哚实验、生物胺产生实验。
85.1、溶血活性分析
86.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，倒置培养24-48h，观察记录菌落周围是否有溶血的透明圈，以具有强溶血性质的金黄色葡萄球菌(s.aureus，atcc 29213)作为阳性对照；若菌落周围由于红细胞的不完全破裂形成草绿色环，则为α溶血；若菌落周围由于红细胞的完全破裂形成界限分明、完全透明的溶血环，则为β溶血；若菌落周围的培养基没有变化，为γ溶血，即不溶血，结果见图3。
87.2、偶氮还原实验
88.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，划线接种于含有直接蓝71(终质量浓度5mg/l)的mrs固体培养基平板上，37℃培养72h，观察是否有水解圈产生，有水解圈出现即为阳性，以金黄色葡萄球菌(s.aureus，atcc 29213)作为阳性对照，结果见图3。
89.3、明胶液化实验
90.明胶培养基的配制：氯化钠0.5g、蛋白胨1g、牛肉膏0.3g、明胶12g、蒸馏水100ml，调至ph＝7.2-7.4，115℃灭菌30min；
91.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，穿刺接种于5ml明胶培养基中，37℃下培养24-48h后，取出置于4℃冰箱中放置2h以使剩余明胶完全凝固，同时设置阴性对照组bc(以无菌生理盐水代替实验菌)和阳性对照组(以金黄色葡萄球菌s.aureus代替实验菌)，观察管内融化情况，出现明胶融化现象的试管判定为溶明胶的阳性反应，结果见图3。
92.4、吲哚实验
93.蛋白胨水培养基的配方：胰蛋白胨20g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调ph值为7.4
±
0.2，121℃灭菌15min；
94.吲哚试剂配方为：0.1g对二甲氨苯甲醛，用5ml体积分数95％乙醇溶液溶解，然后再缓慢加入2ml浓盐酸，现配现用，避光保存；
95.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，以2％(v/v)接种量接种于蛋白胨水培养基中，37℃培养24h，滴加吲哚试剂，液面出现玫瑰红色则为阳性结果，否则为阴性结果；实验以大肠杆菌(e.coli)为阳性对照，以不接种菌液的蛋白胨水培养基为空白对照(bc)，结果见图3。
96.5、生物胺产生实验
97.生物胺检测培养基的配方为：蛋白胨5g、酵母粉5g、牛肉膏5g、氯化钠2.5g、葡萄糖0.5g、吐温-80 1ml，硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、硫酸铁0.04g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙0.1g、vb
1 0.01g、吡哆醛-5-磷酸0.05g、溴甲酚紫0.06g、蒸馏水1000ml；分别在生物胺检测培养基加入10g/l的对应前体氨基酸(组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸)制成改良氨基脱羧酶检测培养基，调ph值至5.3-5.5，115℃灭菌30min；
98.将屎肠球菌lmx46和lmx47接种至mrs固态培养基平板上活化后，挑单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃培养24h得到菌悬液，分别在添加了前体氨基酸(组氨酸hdc、鸟氨酸odc、赖氨酸ldc)的改良氨基脱羧酶检测平板和未添加前体氨基酸的检测平板上划线，37℃培养并观察颜色变化，颜色变为紫色的为阳性结果，颜色未变的为阴性结果；实验以大肠杆菌(e.coli，atcc 25922)作为阳性对照，以未添加前体氨基酸作为阴性对照，结果见图3。
99.如图3所示的结果，溶血活性实验表明，lmx46和lmx47两株屎肠球菌不产生β溶血素(见图3a)；明胶液化实验表明，lmx46和lmx47两株屎肠球菌均不产生明胶酶，未发生明胶液化现象(见图3c)；此外，生物胺实验、偶氮还原实验和吲哚实验表明，lmx46和lmx47不产生生物胺和偶氮还原酶(见图3b和3e)，相比于lmx46菌株，lmx47菌株也不代谢色氨酸产生有害物质吲哚(见图3d)，进一步证明了lmx47的生物安全性。
100.实施例4
101.通过牛津杯法测定lmx46和lmx47两株屎肠球菌菌悬液、菌体悬液以及上清液对具核梭菌的抑菌活性。具体操作如下：
102.屎肠球菌菌悬液、菌体悬液和上清液的制备与处理：屎肠球菌以1％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基，37℃静置培养24h；具核梭菌以2％(v/v)接种量接种于含有5％无菌脱纤维羊血的tsb培养基中，置于厌氧培养箱37℃静置培养48h，然后将活化的屎肠球菌和具核梭菌菌液的od值平衡至0.8左右，得到活化后的具核梭菌菌悬液和两株屎肠球菌的菌悬液；分别取1ml平衡od值后的lmx46和lmx47两株屎肠球菌的菌悬液，5000rmp离心5min，分别取上清液与菌体沉淀，上清液重新转移到新的离心管中作为上清液，菌体沉淀用1ml pbs缓冲液重悬作为菌体悬液，以上制备的样品置于4℃备用。
103.牛津杯双层平板法的制备方法为在培养皿中倒入20-25ml含有琼脂的tsb培养基，水平放置至凝固，作为底层，并在表面放入牛津杯；取200μl活化后的具核梭菌菌悬液，与25ml温度在50-55℃的半固体含有5％无菌脱纤维羊血的tsb培养基混合，充分振荡混匀后，将混合物倾倒在已放有牛津杯的平板中，于无菌操作台中静置，待培养基凝固后取出牛津杯；然后，向孔中分别加入140μl的屎肠球菌菌悬液、菌体悬液以及上清液，于4℃扩散3h，厌氧条件下，37℃静置培养48h，测定抑菌圈直径，结果见图4。
104.如图4所示的结果表明，lmx47对具核梭菌的抑菌圈显著大于lmx46，表明了lmx对结肠癌的致病菌具核梭菌具有显著的抑制效果。
105.结合实施例1至实施例4的实验结果显示，屎肠球菌lmx47不仅具有独特的抑制结肠癌致病菌具核梭菌的特性，而且还具有耐酸、耐胆盐等特性，不产生吲哚、胺等有害代谢物，生物安全性高；将该菌株于2022年12月09日被保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学校内(武汉大学第一附属小学对面)，中国典型培养物保藏中心211室，邮政编码：430072，保藏单位的缩写为cctcc)，保藏编号为cctcc no:m20221902。
106.实施例5
107.通过结肠癌和具核梭菌共造模的小鼠模型进行屎肠球菌lmx47抗肿瘤的药效评价实验。体外培养结肠癌ct-26细胞，首先将细胞接种至细胞培养瓶中，然后加入dmem培养基，在5％ co2，37℃的细胞培养箱中进行培养，完全培养基组成中包含了10％的胎牛血清，1％的双抗(100iu/ml的青霉素和100iu/ml的链霉素)和rpmi 1640培养基；当细胞生长至70-90％合适密度后，可加入胰蛋白酶进行消化，3min后终止消化，收集细胞后加入pbs重悬至浓度为106/ml；将ct26细胞悬液与具核梭菌菌液(浓度为103cfu/ml)混合后，分别接种0.5ml至每只小鼠皮下，待肿瘤大小长至100-150mm3，按如下分组给药：1)pbs组，2)lmx47组，3)lmx47+oxa组，4)oxa组；其中，pbs组指的是每天口服灌胃0.5ml pbs缓冲液，lmx47组指的是每天口服灌胃0.5ml lmx47菌液(菌液浓度为108cfu/ml)，lmx47+oxa组指的是每天口服灌胃0.5ml lmx47菌液(菌液浓度为108cfu/ml)，并且每四天静脉注射奥沙利铂(oxa)0.1ml(剂量按小鼠体重换算为15mg/kg)，oxa组指的是每四天静脉注射奥沙利铂0.1ml(剂量按小鼠体重换算为15mg/kg)，第20天解剖小鼠肿瘤进行称重，计算肿瘤的抑制率，结果见图5。
108.如图5所示的结果表明，当屎肠球菌lmx47单独口服给药时，对结肠癌肿瘤的抑制率在18％左右，其抑制率主要是由于屎肠球菌lmx47抑制了具核梭菌的活性从而减缓了肿瘤的增殖；此外，屎肠球菌lmx47能够显著提升阳性药物奥沙利铂的抑瘤效果，联合用药后将抑瘤率从65％提升至80％。综上实验表明，屎肠球菌lmx47可增敏奥沙利铂的抗肿瘤效果，可作为潜在的结肠癌辅助治疗药物。
109.实施例6
110.通过实施例4中所述的牛津杯法测定屎肠球菌lmx47和屎肠球菌atcc 51559(购自于美国菌种保藏中心atcc，编号为atcc 51559)抑制金黄色葡萄球菌(s.aureus，atcc 29213)的抑菌圈，结果见图6。结果显示，屎肠球菌lmx47对金黄色葡萄球菌也具有明显的抑制作用，而屎肠球菌atcc 51559对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。
111.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种屎肠球菌(enterococcus faecium)，其特征在于，所述屎肠球菌的保藏编号为cctcc no:m 20221902。2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的屎肠球菌。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述屎肠球菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种；优选为活菌体。4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂。5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为所述屎肠球菌的菌落浓度为10
6-108cfu/ml的液态菌剂。6.一种菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将保藏编号为cctcc no:m 20221902的屎肠球菌进行活化得到活化菌体；(2)将步骤(1)得到的活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，制得液态菌剂。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述活化采用的活化培养基含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l、琼脂12-18g/l；所述发酵培养基含有：蛋白胨8-12g/l、牛肉膏8-12g/l、酵母提取物3-8g/l、磷酸氢二钾1-3g/l、柠檬酸二铵1-3g/l、乙酸钠3-8g/l、葡萄糖15-25g/l、吐温80 0.5-1.5g/l、硫酸镁0.2-0.8g/l、硫酸锰0.15-0.4g/l。8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述活化的条件至少满足：温度为30-45℃、时间为24-48h；所述发酵的条件至少满足：温度为30-45℃、转速为150-200rpm、时间为20-60h。9.权利要求1所述的屎肠球菌、权利要求2至5中任意一项所述的菌剂、权利要求6至8中任意一项所述的制备方法制得的菌剂在制备抑制致病菌产品的中的应用，所述致病菌为具核梭菌。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制致病菌产品选自药物、食品和动物饲料添加剂中的至少一者；优选地，所述药物的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂中的至少一种。

技术总结
本发明涉及医药生物技术，公开了一种屎肠球菌、含有该菌的菌剂及其在制备抑制致病菌产品中的应用。所述屎肠球菌(Enterococcus faecium)的保藏编号为CCTCC NO:M 20221902。本发明提供的菌剂含有上述的屎肠球菌。本发明还提供了菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述屎肠球菌进行活化得到活化菌体；将活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，制得液态菌剂。本发明还提供所述屎肠球菌、所述菌剂、所述制备方法制得的菌剂在制备抑制致病菌产品中的应用，其中，所述致病菌为具核梭菌。该屎肠球菌能够有效拮抗抑制致病菌具核梭菌，且耐酸、耐胆盐、生物安全性高，具有潜在的临床结肠癌肿瘤辅助治疗效果。瘤辅助治疗效果。瘤辅助治疗效果。


技术研发人员：黄和 李亚楠 常天阳 朱彭荣 孟丽娟 吴艳 杨靖鹏
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2023.02.24
技术公布日：2023/7/19