一种基于MTRmRNA的m6A甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法及其应用与流程

一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法及其应用。


背景技术：

2.反复自然流产(recurrent spontaneous abortion，rsa)是最常见的妊娠并发症之一，因其复杂的病因而成为妇产科疾病的一个难题，其中不明原因反复自然流产(ursa)约占rsa的50％。rsa不仅影响妇女的生殖健康，而且增加了她们的心理和精神负担。
3.胎盘功能不全是导致植入失败和早期流产的主要原因。母胎界面滋养层细胞的迁移和侵袭是胚胎着床的关键过程。滋养层细胞侵袭不足可导致流产、胎儿生长受限、胎儿死亡、先兆子痫。随着生殖免疫学、遗传学和分子生物学的快速发展，研究表明m6a甲基化的减少可能抑制绒毛细胞的侵袭与rsa有关。然而，m6a修饰是否能导致rsa及其确切机制尚无相关记载。
4.n6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine，m6a)甲基化修饰作为表观遗传调控机制之一，是哺乳动物细胞中mrna和lncrna最丰富的修饰。m6a修饰在转录后水平调节mrna的稳定性、选择性剪切、转运和翻译，从而影响胚胎发育、癌细胞增殖和迁移、干细胞自我更新等，具有动态性和可逆性。
5.m6a甲基化修饰受到甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化结合蛋白的共同调控。m6a甲基转移酶如mettl3和mettl14以二聚体的形式存在，协同对腺嘌呤位点进行甲基化修饰；m6a去甲基化酶如fto和alkbh5,逆转甲基化；m6a结合蛋白如hnrnpc和ythdf1/2/3，共同调控，最终实现m6a修饰的动态平衡。rna甲基化免疫共沉淀高通量测序(methylated rna immunoprecipitation sequencing，merip-seq)和rna测序(rna-seq)检测和分析，可以得到m6a修饰在全转录组范围内的分布特征。
6.异质核糖核蛋白c(heterogeneous nuclear ribonucleprotein c，hnrnpc)是hnrnps亚家族中的一员，作为m6a修饰调控的“读者”，研究发现hnrn pc与免疫细胞浸润、增殖、迁移和癌细胞侵袭相关。
7.甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，mtr)，作为叶酸代谢的关键基因之一，催化同型半胱氨酸的再甲基化，形成甲硫氨酸以及s-腺苷甲硫氨酸(s-ad enosylmethionine，sam)。甲硫氨酸及sam均被报道具有抑制细胞的迁移及侵袭能力，提示mtr的表达异常可能通过影响滋养层细胞迁移和侵袭能力，参与胚胎着床过程。
8.依据2022年复发性流产诊治专家共识，目前检测rsa主要侧重于从染色体或者基因异常、自身免疫、易栓症、内分泌因素及感染等寻找病因，需进行的检测种类繁多。本发明公开一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法。


技术实现要素：

9.本发明为一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法及其应用，它通过系统比较rsa患者绒毛组织与对照组组织中rna的m6a修饰，鉴定出rsa患者绒毛组织中m6a差异修饰对mtr的调控后，进一步验证了m6a修饰对mtr的调控，并探索了调控机制，至少基于此完成了本发明。
10.本发明实现上述目的采用以下技术方案：
11.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法，它包括以下步骤：
12.a.测量从所述采集的受试者组织样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
13.b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
14.c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为rsa的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为rsa的风险低。
15.进一步的，所述的组织样品为绒毛组织。
16.进一步的，所述的所述m6a甲基化修饰的测量方法包括：提取所述组织r na，片段化、与结合有磁珠的m6a抗体孵育、构建文库，进行高通量测序，根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6a富集峰相关的转录本。
17.所述方法进一步包括使用体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或转染sirna。
18.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，它包括以下步骤：
19.a.测量样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平获得第一测量值的步骤；
20.b.测量施用试验化合物后样品中的所述mtr mrna的m6a甲基化修饰水平获得第二测量值的步骤；
21.c.比较第一测量值第二测量值的步骤；
22.(i)如果第二测量值高于第一测量值，即所述试验化合物提高mtr mrna的m6a甲基化的修饰水平，则将所述试验化合物鉴定为对rsa有用；(ii)如果第二测量值等于或低于第一测量值，即所述试验化合物对mtr mrna的m6a甲基化修饰水平没有影响或具有降低作用，则将所述化合物鉴定为对rsa不是有用的。
23.进一步的，所述样品来源于rsa患者的流产绒毛组织或胎儿绒毛组织。
24.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，它包括用于于检测mtr mrna的m6a甲基化修饰的试剂在制备诊断rsa试剂盒中的用途。
25.进一步的，所述试剂包括针对mtr mrna的引物或探针。
26.进一步的，所述的探针序列如下：
[0027][0028]
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
[0029]
本发明通过探索m6a甲基化修饰在rsa患者的特征，揭示了一种通过m6a甲基化修饰来提高mtr的mrna衰减，引起mtr过表达的新机制。揭示了rsa潜在的分子机制以及与rsa治疗相关的新理论。
附图说明
[0030]
图1为rsa患者流产绒毛组织样本中m6a甲基化修饰及m6a差异修饰(其中图1中的a、b为m6a的分布区域可视化展示图；c、d为m6a峰中富集的顶部m6a基序；e、f为m6a修饰峰的分布图；g、h为m6a差异修饰相关的转录本go和kegg分析。
[0031]
图2为rsa患者流产绒毛组织中差异表达基因及关联分析中重叠差异表达基因结果(其中图中a表示rsa患者流产绒毛组织中鉴定的差异表达基因统计图；b为差异表达的mrna的go分析结果；c为merip-seq和rna-seq数据进行联合分析统计结果；d为重叠的差异表达基因中可能与rsa相关的kegg通路分析结果)。
[0032]
图3为rsa中mtr m6a甲基化修饰和mrna的表达结果(其中图中a为m6a水平；b为mrna的表达水平)。
[0033]
图4为过表达或敲低hnrnpc后，m6a修饰的mtr mrna的水平，以及过表达或敲低hnrnpc后mtr蛋白的表达结果(其中图4中的a显示过表达h nrnpc后，mtr的mrna的水平降低；b显示敲低hnrnpc后，mtr的mr na的水平升高；c显示hnrnpc的sirna在rna水平显著敲低hnrnpc的表达；d和e显示hnrnpc的sirna敲低hnrnpc蛋白表达的同时，mtr蛋白的表达水平升高，过表达hnrnpc后，mtr的蛋白表达水平降低。
[0034]
图5为验证hnrnpc调控mtr表达的基质迁移和浸润试验。过表达hnr npc的细胞迁移能力显著增加，而sihnrnpc细胞的侵袭力降低(图5a、b)。浸润试验结果与基质迁移试验一致(图5c、d)。
具体实施方式
[0035]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0036]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立
地包括或排除在范围内。
[0037]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0038]
本发明提供一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰筛查rsa的方法，所述方法包括：
[0039]
]a.测量从所述受试者采集的组织样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
[0040]
b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
[0041]
c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患rsa的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患rsa的风险低。
[0042]
本发明提供一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰筛查rsa的方法。本发明中，绒毛组织中的mtr是作为m6a甲基化修饰的靶标，m6a甲基化修饰水平差异参与调控其表达水平的上调或下调。具体地。
[0043]
本发明的步骤a为测量从所述受试者采集的组织样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平得到测量值的步骤。
[0044]
本发明中，首先确定m6a修饰在rsa患者胚胎发育中的作用，通过对rsa患者绒毛组织和对照组绒毛组织提取rna进行merip-seq，对全转录组范围m6a甲基化修饰水平进行测定，并根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6a富集峰相关的转录本。
[0045]
进行rna提取的方式不作特别限定，可使用市售试剂盒，例如life technologies公司生产的trizol reagent试剂盒进行提取。
[0046]
本发明通过对rsa组织样品和对照组织样品进行rna-seq及生物信息学数据分析，鉴定在rna水平和m6a水平上均发生显著变化的富集峰的分布。通过rna-seq在转录水平对样本组织整体转录活动进行检测，筛选出所述受试者组织和对照组中的差异表达。
[0047]
本发明进一步包括通过merip-qpcr和qpcr以分别验证merip-seq和rna-seq结果的步骤，其中包括mrna的纯化和m6a富集。mrna的纯化和m6a富集可使用市售试剂盒，例如使用thermo公司生产的dynabeads mrna纯化试剂盒进行纯化以及使用neb epimark m6a富集试剂盒进行m6a的富集。
[0048]
为了进一步分析hnrnpc对mtr m6a修饰对其表达量的影响，优选地，通过体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或sirna。进一步优选地，所述细胞系为htr-8/svneo细胞系。更优选地，所述质粒包括plvx-mcmv-zsgreen-ires-puro-hnrnpc和过表达的对照野生型的所述质粒。
[0049]
优选地，所述sirna为敲低m6a甲基化修饰相关基因得到的用于转染所述细胞系的sirna。优选地，m6a甲基化修饰相关基因为hnrnpc。
[0050]
进行m6a甲基化修饰依赖的方式调节mtr的表达的验证包括以下步骤：将细胞系的细胞接种后培养过夜，然后进行转染；将hnrnpc的过表达质粒或sirna加入opti-mem无血清培养基中，按照操作室温孵育后，置于培养箱中48h后裂解细胞。
[0051]
本发明中，当样品为用于获得基于mtr mrna的m6a甲基化修饰诊断反复自然流产
中的测量值时，此时的样品为组织样品，优选为离体组织样品。更优选地，离体组织样品为绒毛组织样品。当样品为用于获得鉴定对反复自然流产有用的化合物的测量值时，此时的样品来源于反复自然流产患者的胎儿绒毛组织。
[0052]
实施例
[0053]
本实施例为探究hnrnpc介导的m6a甲基化修饰在反复自然流产患者绒毛组织中的变化以及对rsa患者绒毛中表达异常的mtr的影响。
[0054]
一、实验方法
[0055]
1.merip-seq：通过m6a特异性抗体对绒毛组织中具有m6a修饰的rna片段进行免疫共沉淀，随后进行高通量测序，结合生物信息学分析，在转录组范围内对m6a修饰进行系统分析，具体方法如下：
[0056]
利用trizol reagent(life technologies)提取组织rna，nanodrop-2000检测rna的浓度、纯度和完整性。使用超声波对rna样本进行片段化(100nt)。将rna片段样本分为输入对照组和免疫沉淀(ip)组两部分。然后使用n6-甲基化腺嘌呤富集试剂盒(美国neb公司)对ip组进行富集。最后通过逆转录合成双链cdna，随机引物cdna文库生成，接头连接和高通量测序。
[0057]
2.rna-seq在转录水平对绒毛组织整体转录活动进行检测，筛选出两组组织中的差异表达，具体方法如下：
[0058]
提取组织总rna，并进行浓度、纯度和完整性的检测。依据ultra
tm
rna library prep试剂盒进行rna文库构建(美国neb公司)，进行illumina hiseq测序。
[0059]
3.merip-qpcr：使用提取rsa组和对照组的流产绒毛组织的总rna，依据rna-binding protein immunoprecipitation试剂盒(美国millipore公司)进行操作。之后依据neb epimark m6a富集试剂盒说明进行操作。nanodrop2000对所得rna的浓度和纯度进行检测，反转录后进行qpcr检测。
[0060]
4.western blotting和qpcr检测：用hnrnpc sirna寡核苷酸(#3)或hnrnpc过表达载体转染htr-8细胞，收集细胞按照实验室操作检测mtr的蛋白水平及mrna水平。
[0061]
5.基质迁移和浸润试验：使用上述构建好的hnrnpc sirna和过表达载体转染的细胞，依据biocoat及bd biosciences公司试剂盒进行操作。
[0062]
二、实验结果
[0063]
通过merip-seq检测，如图1中的a所示，在rsa组绒毛组织中共鉴定
[0064]
出转录组范围的2115个m6a富集峰相关的转录本，且m6a的分布主要位于富含终止密码子和3'utr的区域(图1中的a、e、f所示)。
[0065]
将rsa胎儿的m6a富集峰与对照组织进行比较。与对照组相比，在rsa组绒毛组织中共鉴定出101个上调的m6a富集峰和37个下调的m6a富集峰(图1中的b所示)。基因本体论(go)分析结果见图1中的g所示，结果表明差异m6a修饰相关的转录本的功能富集在细胞增殖、生物粘附和繁殖等方面。kegg分析显示，rsa中具有独特m6a峰的转录本参与toll样受体(tlr)信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、单纯疱疹病毒感染、坏死性细胞凋亡和肝细胞癌等(图1h所示)。
[0066]
通过rna-seq检测，和对照组相比，rsa患者绒毛组织中鉴定出4703个差异表达的基因，包括3634个表达上调的基因和1069个表达下调的基因(如图2中的a所示)。go分析表
明，差异表达的mrna与细胞增殖、细胞杀伤、细胞聚集、发育过程和免疫功能调节有关(如图2中的b所示)。对merip-seq和rna-seq数据进行联合分析，发现了65个重叠的差异表达基因(如图2中的c所示)。这些基因的kegg分析了20个与rsa相关的可能途径。包括th1和th2细胞分化，ras信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、mapk信号通路、pd-l1表达肿瘤中的pd-1检查点通路、催乳素信号传导途径等方面(如图2中的d所示)。
[0067]
甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，mtr)催化5-甲基-thf向同型半胱氨酸的甲基转移，产生蛋氨酸和四氢叶酸(thf)，与叶酸和同型半胱氨酸代谢有关。表达量增高的mtr促进了叶酸合成，而高浓度叶酸与胎儿宫内受限、妊娠糖尿病、低出生体重、成年期孤独症风险增加有关。如图3的a和b所示，通过qpcr检测发现，与对照组相比，rsa组中m6a修饰的mtr表达量下调，而mtr的mrna表达量却升高。
[0068]
如图4中的a和b所示，在htr-8细胞系中过表达hnrnpc，mtr的mrna表达量下降；而在htr-8细胞系中敲低hnrnpc，mtr的mrna表达量升高。提示：mtr作为hnrnpc修饰的靶标。如图4中的d和e所示，在hnrnpc敲低的细胞系中，hnrnpc的缺失增加了mtr蛋白的丰度，而hnrnpc的过表达下调了mtr蛋白的丰度。
[0069]
通过基质迁移和侵润试验，如图5a、b所示，过表达hnrnpc的细胞侵袭能力显著增加，而sihnrnpc细胞的侵袭力降低。如图5c、d所示，过表达hnrnpc的细胞侵润增强，而sihnrnpc细胞的侵润能力降低。
[0070]
三、实验结论
[0071]
我们探索了m6a甲基化修饰在反复自然流产患者绒毛组织的特征，并揭示了一种通过m6a甲基化修饰引起mtr过表达的新机制。揭示了mtr的mrna甲基化修饰水平降低在rsa中的新分子机制。
[0072]
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构。

技术特征：
1.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法，它包括以下步骤：a.测量从所述采集的受试者组织样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平得到测量值的步骤；b.将所述测量值与对照值比较的步骤；c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为rsa的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为rsa的风险低。2.根据权利要求1所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法其特征在于：所述的组织样品为绒毛组织。3.根据权利要求2所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法其特征在于：所述的所述m6a甲基化修饰的测量方法包括：提取所述组织rna，片段化、与结合有磁珠的m6a抗体孵育、构建文库，进行高通量测序，根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6a富集峰相关的转录本。4.根据权利要求3所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法，其特征在于：它包括使用体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或转染sirna。5.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，它包括以下步骤：a.测量样品中的mtr mrna的m6a甲基化修饰水平获得第一测量值的步骤；b.测量施用试验化合物后样品中的所述mtr mrna的m6a甲基化修饰水平获得第二测量值的步骤；c.比较第一测量值第二测量值的步骤；(i)如果第二测量值高于第一测量值，即所述试验化合物提高mtr mrna的m6a甲基化的修饰水平，则将所述试验化合物鉴定为对rsa有用；(ii)如果第二测量值等于或低于第一测量值，即所述试验化合物对mtr mrna的m6a甲基化修饰水平没有影响或具有降低作用，则将所述化合物鉴定为对rsa不是有用的。6.根据权利要求5所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，其特征在于：所述样品来源于rsa患者的流产绒毛组织或胎儿绒毛组织。7.一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，它包括用于检测mt r mrna的m6a甲基化修饰的试剂在制备诊断rsa试剂盒中的用途。8.根据权利要求7所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，其特征在于：所述试剂包括针对mtr mrna的引物或探针。9.根据权利要求8所述的一种基于mtr mrna的m6a甲基化修饰的应用，其特征在于：探针序列如下：
。

技术总结
本发明为一种基于MTR mRNA的m6A甲基化修饰评估反复自然流产风险的方法及其应用，它通过系统比较RSA患者绒毛组织与对照组组织中RNA的m6A修饰，鉴定出RSA患者绒毛组织中m6A差异修饰对MTR的调控后，进一步验证了m6A修饰对MTR的调控，并探索了调控机制，至少基于此完成了本发明。了本发明。了本发明。


技术研发人员：王红丹 张梦汀 高越 郭涵 秦利涛
受保护的技术使用者：河南省人民医院
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/19