一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂及其制备方法

1.本发明涉及农用微生物与土壤修复技术领域，尤其涉及一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.硒(se)是人体必需的微量元素之一，是多种酶和蛋白质的重要组成成分，对人体健康具有十分重要的意义。土壤中的硒包括有效态硒(水溶态、离子交换态和碳酸盐结合态)和难利用态硒(腐殖酸结合态、铁锰结合态、强有机结合态和残渣态)，有效态硒容易被作物所吸收利用，难利用态硒难以被作物吸收利用。土壤中的有效态硒水平越高，越能促进作物对硒的富集，因此水溶态硒等有效态硒由于其高的生物可利用性而备受关注。土壤有机质含量高时，土壤中有机结合态硒含量增加，不利于植物对硒的富集吸收。
3.在传统的促进植物富硒的方法中，以直接向土壤中施加无机硒、有机硒肥及富硒矿物居多，但此种方式存在着诸多弊端，不仅植物对其利用效果不理想，长期施加还可能造成土壤ph失衡、资源浪费等。微生物能够促进难利用态硒转化为有效态硒，从而提升作物的硒含量，达到作物的富硒效果。相比于传统的施肥方法，通过添加微生物菌剂的方式促进植物富硒不仅可以减小对土壤环境的扰动性，同时节约成本。
4.我国土壤有机质含量呈现由南向北逐渐增加，由东向西逐渐减少的总体趋势，其中东北片区土壤有机质含量最高，达36.41g kg-1
；江浙片区有机质平均含量达22.79g kg-1
；此外青海省南部、甘肃南部及新疆的伊宁市、阿勒泰市一带等区域，都是有机质含量高值区。这些地方硒形态主要以有机结合态以及腐殖酸结合态为主，而这两种形态的硒较为稳定，在正常情况下难以被植物所吸收利用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂及其制备方法。
6.本发明的一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
7.s1：富集有机质降解菌富集产物备用；
8.s2：活化有机质降解菌富集产物，制备有机质降解菌发酵液；
9.s3：将有机质降解菌发酵液与稻壳粉混合搅拌制成有机质降解菌剂，即富硒微生物菌剂；
10.所述富集有机质降解菌的过程如下：取高有机质新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液接种到lb培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体lb培养基恒温培养，挑取平板中菌落置于液体lb培养基中培养至指数生长期，将其保存于甘油中，作为有机质降解菌富集产物。
11.进一步的，所述有机质降解菌发酵液与稻壳粉的质量比为2:1。
12.进一步的，所述新鲜土壤来源于浙江省嘉兴市嘉善县干窑镇。
13.进一步的，富硒微生物菌剂包括芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
14.本发明制备的有机质降解菌富集产物主要优势菌属(相对丰度＞1％)包括芽孢杆菌属(bacillus)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，和肠杆菌属(enterobacter)，这些优势菌属都具有有机质降解能力，三个属的菌种具有协同作用，能够分泌多种的酶，从而降解土壤中的有机质，将有机质结合态硒释放，转化为生物有效性高的有效态硒。
15.本发明制备的微生物菌剂将大分子的有机质分解成小分子，显著降低土壤中腐殖酸结合态硒和有机结合态硒，提高了水溶态、离子交换态、碳酸盐结合态三种有效态硒的含量，能够显著促进土壤中难利用态硒向有效态硒转化，释放被吸附的硒，从而提高土壤硒的有效性；同时有机质的分解增加了土壤的肥力，促进作物的生长，使作物吸收更多的硒，显著提升作物中的总硒含量，起到促进作物富硒的作用；本发明制备的微生物菌剂高有机质含量的农田中具有良好的适用性。本发明制备的微生物菌剂在水稻、小麦的盆栽及大田实验中，显著提高了植株中的硒含量，得到符合国家富硒标准的水稻大米。
16.本发明制备的微生物菌剂能够在一定程度上改变土著土壤微生物菌群，且微生物菌剂中的部分种属能够在土壤中稳定存活并发挥作用，有利于植物的生长，增强群落对土壤环境变化的抗性。
17.本发明提供的微生物菌剂以稻壳粉作为吸附材料制得，能够预防微生物的流失，并在一定程度上提供营养；制备材料易得，制备方式简单，制作成本较低。
附图说明
18.图1a为有机质降解菌富集培养物添加至富硒土壤共同培养15天的状态；
19.图1b为富硒土壤中有机结合态硒和有效态硒的变化曲线图；
20.图2-水稻盆栽实验植株地上部分总硒含量(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
21.图3-盆栽水稻生长过程中土壤有效态硒含量变化(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
22.图4-水稻大田实验植株地上部分总硒含量(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
23.图5-大田水稻生长过程中土壤有效态硒含量变化(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
24.图6-小麦盆栽实验植株地上部分总硒含量(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
25.图7-小麦盆栽生长过程中土壤有效态硒含量变化(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
26.图8-大田小麦实验植株地上部分总硒含量(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)；
27.图9-大田小麦生长过程中土壤有效态硒含量变化(a：对照组；b：添加有机质降解菌剂实验组)。
具体实施方式
28.以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
29.本发明使用的有机质降解菌使用lb培养基富集：tryptone 10g，yeast extract 10g，nacl 5g，溶于1l的超纯水，121℃灭菌30min备用。筛菌土壤来源于浙江省嘉兴市嘉善县干窑镇。取10g新鲜土壤，加入到90ml的无菌水中，加入玻璃珠进行震荡，然后静置15min使得固液分离，取上清液接种到lb培养基中培养24h，将菌液稀释成不同浓度，按照不同梯度稀释菌液，然后选两个稀释梯度(稀释到10的-6次方、10的-7次方)的菌液都吸取100微升的量，均匀涂布到固体lb培养基上，置于30℃培养箱中，挑取平板中菌落置于液体无菌培养基中培养至指数生长期，将其保存于25％的甘油中，作为有机质降解菌富集产物。
30.本发明提供了如下微生物菌剂的制备方案：
31.1.菌剂的发酵及微生物的扩大培养：首先对有机质降解菌富集产物进行活化。
32.(1)室内(盆栽)操作方法：配制发酵培养液(牛肉膏：3g/l；蛋白胨：10g/l；ph：7.2-7.4)。高温高压灭菌。按照5％接种活化后的菌种。
33.(2)野外(大田)操作方法：按照配方(牛肉膏：3g/l；蛋白胨：10g/l)配制牛肉膏蛋白胨培养基。选用体积为25l的带盖白色发酵桶，桶盖上开两个合适大小的圆孔(用于厌氧菌发酵的桶不打孔)，一个孔作为进气孔与增氧泵相连接，另一个孔作为出气孔连接一根橡胶管，管口连接0.22μm滤膜，防止杂菌污染。发酵桶在使用前使用酒精擦拭内壁，起到灭菌效果。将配制好的培养基加入到发酵桶中，每桶加10l的培养基，按照5％接种活化后的菌种，接通增氧泵电源，将桶放置在常温下进行发酵，发酵3天。
34.菌剂的制备：将有机质降解菌富集产物发酵液与稻壳粉(50目)按照质量比菌液：稻壳粉＝2：1进行混合后充分的搅拌，然后静置24h，使得微生物充分吸附在稻壳粉上，制备完成有机质降解菌剂，即富硒微生物菌剂。
35.实施例1有机质降解菌富集培养物的富硒能力
36.将有机质降解菌富集产物添加到富硒土壤中进行培养。经过15天的共同培养，如图1b所示，富硒土壤中的有机结合态硒从0.13mg/kg下降到了0.10mg/kg，下降了23.08％，有效态硒(水溶态、离子交换态和碳酸盐结合态硒的总和)从0.055mg/kg上升到了0.075mg/kg，上升了36.36％，结果表明，有机质降解菌富集培养物能够有效的促进富硒土壤中的有机结合态硒转化为有效态硒，从而促进土壤硒有效性的提高。
37.图1a为有机质降解菌富集培养物添加至富硒土壤共同培养15天的状态。
38.图1b为富硒土壤中有机结合态硒和有效态硒的变化曲线图；
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为对照组有机结合态硒的变化；
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为对照组有效态硒的变化；
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为实验组有机结合态硒的变化；
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为实验组有效态硒的变化。
39.有机质降解菌富集培养物的主要优势菌属(相对丰度＞1％)包括芽孢杆菌属(bacillus)，克雷伯氏菌属(klebsiella)，和肠杆菌属(enterobacter)，这些优势菌属都具有有机质降解能力。
40.表1有机质降解菌富集培养物微生物群落组成
[0041][0042]
实施例2富硒微生物菌剂水稻盆栽试验
[0043]
从浙江省嘉兴市干窑镇的水稻田中采取盆栽土壤，自然风干后，挑去石子和植物残渣，使用粉碎机进行粉碎，过2mm筛。每个花盆中加入15kg土壤，将富硒微生物菌剂与土壤充分混匀后静置，每盆种植四株长势相近的水稻幼苗。种植120天后取水稻植株地上部分，使用超纯水清洗表面泥土，自然晾干水分后置于40℃烘箱中烘干至恒重，使用研钵磨碎后保存在自封袋中，做好标记进行植物总硒的提取测定。
[0044]
实验效果参见图2，实验结果表明，微生物菌剂的添加能够提升植株中的硒含量，提升了0.0031mg/kg，增长率为14.79％。有机质降解菌的添加对促进水稻植株富硒的效果明显。
[0045]
如图3所示，对照组a的有效态硒下降了19.08％，可能是因为植物在生长的过程中吸收了部分的有效态硒,实验组b的有效态硒提升了10.46％，说明有机质降解菌剂的添加能够显著提高土壤有效硒含量，进而促进水稻植株的富硒。
[0046]
实施例3富硒微生物菌剂水稻大田试验
[0047]
选取浙江省嘉兴市干窑镇南宙村的一块水稻田作为实验田，面积为380m2。大田试验使用的水稻品种与室内盆栽实验相同。将有机质降解菌剂均匀撒在实验田表面，使用拖拉机将添加的有机质降解菌剂与土壤充分混匀，平衡1天后插秧。
[0048]
分别于第0天，第30天，第60天，第90天和第120天取土样，采用“s”形取样法。种植120天后取植株地上部分，将茎叶部分与稻米部分分开提取测定。实验效果见附图4。
[0049]
野外大田实验与盆栽实验添加菌剂后植物富硒的效果相同，均能够显著提升植株的硒含量。添加有机质降解菌处理相对于对照组a提升了0.0066mg/kg，增长率为30.00％，相较于室内盆栽，植物的硒含量提升效果更为明显，说明有机质降解菌在促进植物富硒方面具有较好的应用前景。
[0050]
如图5所示，对照组a的有效态硒下降了23.26％，这可能是由于植物在生长的过程中吸收了部分的有效态硒；实验组b的有效态硒提升3.25％，说明有机质降解菌的添加能够显著提升土壤中有效态硒的含量。和盆栽实验的结果相似，在前30天时，土壤中的有效态硒提升最为明显，这是因为微生物菌剂在刚添加到土壤时功能最为活跃，使得土壤中的有效态硒含量快速提升。
[0051]
实施例4富硒微生物菌剂小麦盆栽试验
[0052]
实验前将实验用土进行风干和粉碎，选取直径为22cm的花盆作为实验用盆，每盆装5.0kg的土壤，然后添加有机质降解菌剂。
[0053]
如图6所示，实验结果表明，有机质降解菌的添加提高了麦穗的硒含量，提高了25.51％。和水稻盆栽试验的结果相似，菌剂的添加显著提升了植株的硒含量。
[0054]
表2小麦盆栽实验土壤微生物群落变化
[0055][0056]
如表2所示，盆栽实验土壤微生物初始群落前七的目包含有根瘤菌目，放线菌目，除硫单胞菌目，伯克氏菌目，嗜氢菌目等。在添加了菌剂并且种植植物60天以后，土壤的微生物群落结构出现了显著变化。另外，对比0天的微生物群落，60天后出现了新的优势种属，如鞘脂单胞菌目、芽单胞菌目和黏细菌。黏细菌能够分泌胞外酶从而分解复杂有机质(纤维素、几丁质、脂等)，从而降低土壤有机质的含量。
[0057]
如图7所示，相比于对照组a，添加有机质降解菌剂的实验组土壤有效态硒含量提升显著。表明添加有机质降解菌后土壤中难以被植物利用的腐殖酸结合态和强有机结合态的硒向容易被植物所利用的水溶态、离子交换态和碳酸盐结合态的硒转化，从而促进了植物对土壤中有效态硒的吸收，进而促进植物富硒。
[0058]
实施例5富硒微生物菌剂小麦大田试验
[0059]
如图8所示，相对于对照组，添加菌剂后植株的总硒含量提升了65.1％，富硒效果显著，达到0.0325mg/kg。再次证明有机质降解菌的添加能够促进农作物富硒。
[0060]
如图9所示，相较于对照组，实验组b的有效态硒提升了28.49％。从有效态硒变化的总体趋势来看，在前60天时，土壤中的有效态硒提升最为明显，这可能是因为微生物菌剂在刚添加到土壤时功能最为活跃，使得土壤中的有效态硒含量快速提升，60天后土壤中有效态硒变化较小，这可能是由于微生物菌剂在添加到土壤后逐渐的被同化，功能逐渐的减弱，同时土壤中的有效态硒不断的被植物所吸收利用，从而降低土壤有效态硒含量。
[0061]
以上未涉及之处，适用于现有技术。
[0062]
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1：富集有机质降解菌富集产物备用；s2：活化有机质降解菌富集产物，制备有机质降解菌发酵液；s3：将有机质降解菌发酵液与稻壳粉混合搅拌制成有机质降解菌剂，即富硒微生物菌剂；所述富集有机质降解菌的过程如下：取高有机质新鲜土壤于无菌水中震荡，静置后固液分离，取上清液接种到lb培养基中培养后，再将稀释后菌液均匀涂布到固体lb培养基恒温培养，挑取平板中菌落置于液体lb培养基中培养至指数生长期，将其保存于甘油中，作为有机质降解菌富集产物。2.如权利要求1所述的一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述有机质降解菌发酵液与稻壳粉的质量比为2:1。3.如权利要求1所述的一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述新鲜土壤来源于浙江省嘉兴市嘉善县干窑镇。4.采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的富硒微生物菌剂，其特征在于：富硒微生物菌剂包括芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

技术总结
本发明公开了一种适用于高有机质土壤的富硒微生物菌剂及其制备方法。制备方法包括如下步骤：S1：富集有机质降解菌备用；S2：活化有机质降解菌，制备有机质降解菌发酵液；S3：将有机质降解菌发酵液与稻壳粉混合搅拌制成有机质降解菌剂。本发明制备的微生物菌剂将大分子的有机质分解成小分子，显著降低土壤中腐殖酸结合态硒和有机结合态硒，提高了水溶态、离子交换态、碳酸盐结合态三种有效态硒的含量，能够显著促进土壤中难利用态硒向有效态硒转化，释放被吸附的硒，从而提高土壤硒的有效性；同时有机质的分解增加了土壤的肥力，促进作物的生长，使作物吸收更多的硒，显著提升作物中的总硒含量，起到促进作物富硒的作用。起到促进作物富硒的作用。起到促进作物富硒的作用。


技术研发人员：殷汉琴 黄春雷 邵一先 张艺博 黄显鑫 余岳 李平
受保护的技术使用者：中国地质大学（武汉）
技术研发日：2023.02.09
技术公布日：2023/7/19