一种用于检测艾绒质量的显微检测方法

1.本发明涉及艾绒检测领域，特别是一种用于检测艾绒质量的显微检测方法。


背景技术：

2.艾绒是制作艾条的原材料，也是灸法所用的主要材料。传统方法制作艾绒是由干燥的艾叶经过反复晒杵、捶打、粉碎，筛除杂质、粉尘，而得到的细软绒状物。艾绒质量的优劣直接影响了艾灸疗效，古代医家认为灸用艾绒需要加工到“柔烂如绵”、“柔细黄熟”的程度。现代加工艾绒多采用大型机械对艾叶或茎叶相连的艾草进行粉碎和过筛，除去茎、叶肉、叶脉和叶梗等粉末得到。
3.艾绒加工的精细程度称为精细度，市售艾绒常用加工比例来表示，即原料艾叶与艾绒的产出比例，例如5
㎏
艾叶经加工制成1
㎏
艾绒，精细度即加工比例为5:1。有文献明确指出，“艾绒比例(精细度)越高越好，杂质越少越好”，而机器加工艾绒经过反复粉碎和过筛，可以不断除去叶肉组织、叶脉等杂质；在这种情况下，就会得出“反复粉碎过筛次数越多，所得艾绒的质量越高”的结论。然而，由于生产厂家不同、加工工艺不同等诸多不确定因素，对于市售艾绒是否达到其出厂所标示的加工比例，长期以来并无客观的鉴定方法及标准以规范地评判。目前，国家标准(灸用艾绒gb/t 40976-2021)，艾绒的显微检测中，用微观粉碎度来反映艾绒的精细度，微观粉碎度关注的是叶肉组织等杂质的粉碎度，若其粉碎度过低或杂质筛除不彻底，都会影响艾绒的精细度，导致其品质降低。该方法只能将艾绒做粗略分级，分为艾条灸用艾绒和直接灸用艾绒。
4.目前，被普遍认可的艾灸作用机制是物理效应、药化效应与综合效应三者共同作用。艾叶的背面(下表面)密被灰白色绒毛，这些是绒毛艾绒的主要来源；根据文献资料，精细度高的艾绒主要由来源于艾叶下表面的t形非腺毛构成。最新研究表明，t形非腺毛柄部能够自发荧光，柄部细胞中储存有复杂的次生代谢产物(多酚类、黄酮类、挥发油等)，同时柄部细胞壁角质化，这些成分不仅直接关系到艾绒的燃烧值，其在燃烧后的产物可能与艾绒的质量和艾灸的效果密切相关。因此，如果粉碎过度，过筛次数过多，就会使所得艾绒中t形非腺毛顶细胞和柄的长度不断减小，尤其是柄部细胞储存的有疗效的次生代谢物质也为因此而过度损失，反而影响艾绒和艾灸的质量。另一方面，t形非腺毛顶细胞和柄的长度都与艾绒的精细度密切相关，在一定的加工比例范围内，随着加工比例的提高，微观粉碎度不断提高，t形非腺毛顶细胞和柄的平均长度也会不断减小，艾绒的精细度也得以提高。然而，精细度过高时，艾绒会加工成灰状物，不但影响艾绒产品的加工制作，也会影响到实际疗效，因此，艾绒中t形非腺毛顶细胞和柄的平均长度或保留的完好程度都可以作为检测艾绒质量的指标。
5.在实际操作上由于t形非腺毛顶细胞极为细长扭曲，不同t形非腺毛顶细胞相互间交叉缠绕，直接测量其长度非常不便。实际测量表明，t形非腺毛的顶细胞长度变化特点与其柄的变化非常一致，如能对艾绒中t形非腺毛的柄进行计数和测量，就可成为检测艾绒加工质量的一个最佳显微检测指标。然而，要大量检测艾绒，如果仍采用人工逐个观察和测量
t形非腺毛柄的长度来完成，工作量大，耗费人力，效率低，实际可操作性差，因此，如何利用t形非腺毛柄实现对艾绒质量的检测，至今未见公开报道。


技术实现要素：

6.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于检测艾绒质量的显微检测方法，可有效解决现有并无利用t形非腺毛柄检测艾绒的加工质量，导致艾绒品质不稳定的问题。
7.为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种用于检测艾绒质量的显微检测方法，包括以下步骤：
8.s1、照相计算：用荧光显微镜在紫外光下对艾叶背面t形非腺毛进行照相，并对t形非腺毛柄的平均长度和平均宽度进行计算，得到其平均长度l0和平均宽度w0，然后将艾叶反复粉碎和过筛，得到艾绒；
9.s2、过筛：用镊子取1～2g粉碎后的艾绒，在解剖镜下摊开，使之蓬松，将蓬松的艾绒用20～100目的筛子过筛，并除去艾绒中大的颗粒状物，得过筛后的艾绒；
10.s3、甲醇处理：用镊子取10-20mg过筛后的艾绒，放在盛有3～5ml甲醇中，处理5～10min，得甲醇处理后的艾绒；
11.s4、染色：将甲醇处理后的艾绒取出，转入另一个培养皿中，再用0.1～0.5％的2-氨基乙基联苯基硼酸酯染色1～3min，得染色艾绒；
12.s5、制片：用镊子取1-2mg染色艾绒，在载玻片上展开，并滴加体积浓度20％～40％的稀甘油0.02ml，混匀，盖上盖玻片，用荧光显微镜在紫外光下对艾绒进行观察并拍照，用image j对图像进行处理，通过设定阈值去除小的荧光背景杂点，对t形非腺毛柄的总数量和总面积进行计数和测量，总面积除以总数量得到其平均面积s’；
13.s6、求柄保留度：将平均面积s’除以步骤s1中的平均宽度w0，得到过筛后的艾绒的柄的平均长度，并对每批样品制片三次，进行测量和计算，通过三次结果得到最终平均长度l’，计算得到柄保留度y＝l’/l0×
100％，柄保留度y最大为60％，柄保留度y越小，表明质量越差。
14.本发明方法简单，操作方便，检测成本低，工作量小，效率高，检测效果好，有效用于检测艾绒质量的显微检测方法，达到检测艾绒加工质量的目的，有显著的社会和经济效益。
附图说明
15.图1是本发明艾叶背面密被的绒毛图；
16.图2是本发明t形非腺毛形态图(柄部为短棒状，发出蓝色荧光)；
17.图3是本发明t形非腺毛形态图(柄部发出明亮的荧光)；
18.图4是本发明含较多叶肉等粉末的艾绒图；
19.图5是本发明荧光显微镜观察艾绒图(明场)；
20.图6是本发明荧光显微镜观察荧光染色后的艾绒t形非腺毛图(和图2为同一视野，紫外光激发)；
21.图7是本发明用image j处理图3后的处理图；
22.图8是本发明用image j计数和测量图。
具体实施方式
23.以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
24.本发明在具体实施时，由以下实施例给出。
25.一种用于检测艾绒质量的显微检测方法，包括以下步骤：
26.s1、照相计算：用荧光显微镜在紫外光下对艾叶背面t形非腺毛进行照相，并对t形非腺毛柄的平均长度和平均宽度进行计算，得到其平均长度l0和平均宽度w0，然后将艾叶反复粉碎和过筛，得到艾绒；
27.s2、过筛：用镊子取1～2g粉碎后的艾绒，在解剖镜下摊开，使之蓬松，将蓬松的艾绒用20～100目的超声波振动筛过筛，筛去艾绒中小的叶肉组织块、气孔和腺毛等存在于其中的细小粉末，并用镊子拣去留下的大的叶肉组织、叶梗等颗粒状物质，得过筛后的艾绒；
28.s3、甲醇处理：用镊子取10-20mg过筛后的艾绒，放在盛有3～5ml甲醇中，处理5～10min，得甲醇处理后的艾绒；
29.s4、染色：将甲醇处理后的艾绒取出，转入另一个培养皿中，再用0.1～0.5％的2-氨基乙基联苯基硼酸酯(dpba)(95％乙醇为溶剂)染色1～3min；
30.s5、制片：用镊子取1-2mg染色处理后的艾绒，在载玻片上展开，并滴加体积浓度20％～40％的稀甘油0.02ml，混匀，盖上盖玻片，用荧光显微镜在紫外光下对艾绒进行观察并拍照，用image j对图像进行处理，通过设定阈值去除小的荧光背景杂点，对t形非腺毛柄的总数量和总面积进行计数和测量，总面积除以总数量得到其平均面积s’；
31.s6、求柄保留度：将平均面积s’除以步骤s1中的平均宽度w0，得到过筛后的艾绒的柄的平均长度，并对每批样品制片三次，进行测量和计算，通过三次结果得到最终平均长度l’，计算得到柄保留度y＝l’/l0×
100％，柄保留度y最大为60％，柄保留度y越小，表明质量越差。
32.如图1所示，艾叶背面布满绒毛，利用荧光显微镜在紫外光下对艾叶背面t形非腺毛进行照相，如图2、3所示，并对t形非腺毛柄的平均长度和平均宽度进行计算，得到其平均长度l0和平均宽度w0，如下表1。
33.表1平均长度l0和平均宽度w034.柄的平均宽度(w0)12.53μm柄的平均长度(l0)35.07009224μm
35.将艾叶连续进行3次粉碎后用20目筛子过筛，得到的艾绒如图4所示，艾绒中仍含较多叶肉等粉末，用镊子取1～2g艾绒，在解剖镜下摊开，使之蓬松，将蓬松的艾绒用20～100目的筛子过筛，并除去艾绒中大的颗粒状物，得过筛后的艾绒，如图5所示。再将过筛后的艾绒进行染色处理，染色后的艾绒用荧光显微镜在紫外光下进行观察并拍照，如图6所示。然后利用image j对图像进行处理，此时艾绒柄部突出显示(图中黑色部分)，如图7所示。通过设定阈值去除小的荧光背景杂点后，得到图8，对图8中t形非腺毛柄的总数量和总面积进行计数和测量，结果见下表2。
36.表2柄长度的测量结果
37.柄的编号面积(μm2)柄的编号面积(μm2)
1138.19715449.918 252.01816302.404 3244.17517333.459 4110.24718102.872 5177.79319138.197 6237.96420126.552 7461.9522181.909 8703.02122284.159 9266.30223339.282 10148.2924835.007 11257.76125252.715 1256.28826148.679 13171.58227146.738 1469.87528161.489
38.根据t形非腺毛柄的总数量和总面积，得到平均面积s’为242.816μm2，将平均面积s’除以步骤s1中的平均宽度w0，并对每批样品制片三次，进行测量和计算，通过三次结果得到最终平均长度l’为19.3788μm。
39.计算得到柄保留度y＝l’/l0×
100％＝19.3788/35.07009224＝55.3％，与上限60％相差较少，说明本实施例所处理的艾绒质量较好。
40.表3柄的平均面积、长度和保留度的的计算
[0041][0042]
由上可以看出，本发明与现行的艾绒国家标准(灸用艾绒gb/t 40976-2021)中艾绒精细度检测关注于叶肉组织等杂质的粉碎度的做法迥然不同，本发明检测方法不仅可以检测艾绒加工的精细度，也能反映艾绒加工中t形非腺毛柄的保留程度，从而对目前普遍存在的艾绒过度加工问题有所规范。由于柄中贮藏有多酚类、黄酮类等药效成分，柄的数量特征直接关系到艾绒的优劣，本发明该指标关注于艾绒的t形非腺毛的标志—柄，更能直接精准反映艾绒的加工质量，具有目前国家标准(灸用艾绒gb/t 40976-2021)所用指标所不具备的优势。
[0043]
本发明方法经多次反复试用和实验表明，艾绒经过处理后，t形非腺毛柄的荧光图像清晰突出，背景暗，非常适合用image j对图像进行处理和分析，方便检测，实验时间短，工作量小有重要的价值。本发明根据t形非腺毛的结构特点，对柄进行计数和测量是本方法的核心，该方法有三大关键点，一是用超声波振动筛20～100目筛子可以筛去艾绒中叶肉组织块、气孔和腺毛等存在于其中的细小粉末，甚至是沾在t形非腺毛上的微小粉末颗粒都可以用超声波振动筛除去，避免其在后面的显微观察中产生干扰；再用镊子除去大的叶肉组织、叶梗等颗粒状物质，避免了这些非观察目标物的产生荧光干扰，二是用甲醇处理，以洗去非腺毛中残留有腺毛的荧光物质，避免其荧光干扰；再用2-氨基乙基联苯基硼酸酯(dpba)对柄荧光染色，增强其荧光成像；三是用image j对图像分析检测，提高了效率。操作
仪器简单，操作方便，成本低，工作量小，效率高，效果好，是一种有效用于检测艾绒质量的显微检测方法，此法可达到检测艾绒加工质量的目的，有显著的社会和经济效益。

技术特征：
1.一种用于检测艾绒质量的显微检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、照相计算：用荧光显微镜在紫外光下对艾叶背面t形非腺毛进行照相，并对t形非腺毛柄的平均长度和平均宽度进行计算，得到其平均长度l0和平均宽度w0，然后将艾叶反复粉碎和过筛，得到艾绒；s2、过筛：用镊子取1~2g粉碎后的艾绒，在解剖镜下摊开，使之蓬松，将蓬松的艾绒用20~100目的筛子过筛，并除去艾绒中大的颗粒状物，得过筛后的艾绒；s3、甲醇处理：用镊子取10-20mg过筛后的艾绒，放在盛有3~5ml甲醇中，处理5~10min，得甲醇处理后的艾绒；s4、染色：将甲醇处理后的艾绒取出，转入另一个培养皿中，再用0.1~0.5%的2-氨基乙基联苯基硼酸酯染色1~3min，得染色艾绒；s5、制片：用镊子取1-2mg染色艾绒，在载玻片上展开，并滴加体积浓度20%~40%的稀甘油0.02ml，混匀，盖上盖玻片，用荧光显微镜在紫外光下对艾绒进行观察并拍照，用image j对图像进行处理，通过设定阈值去除小的荧光背景杂点，对t形非腺毛柄的总数量和总面积进行计数和测量，总面积除以总数量得到其平均面积s’；s6、求柄保留度：将平均面积s’除以步骤s1中的平均宽度w0，得到过筛后的艾绒的柄的平均长度，并对每批样品制片三次，进行测量和计算，通过三次结果得到最终平均长度l’，计算得到柄保留度y=l
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100%，柄保留度y最大为60%，柄保留度y越小，表明质量越差。2.根据权利要求1所述的用于检测艾绒质量的显微检测方法，其特征在于，所述的过筛是用20~100目的超声波振动筛进行过滤。

技术总结
一种用于检测艾绒质量的显微检测方法，包括以下步骤：S1、照相计算；S2、过筛；S4、染色；S5、制片’；S6、求柄保留度：将平均面积S’除以步骤S1中的平均宽度W0，得到过筛后的艾绒的柄的平均长度，并对每批样品制片三次，进行测量和计算，通过三次结果得到最终平均长度L’，计算得到柄保留度Y=L’/L0×


技术研发人员：刘孟奇 王小巧 胡毅龙 兰金旭 陈随清
受保护的技术使用者：河南中医药大学
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/7/19