一种大肠杆菌培养基、其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及微生物培养基领域，更具体涉及大肠杆菌培养基、其制备方法及应用。


背景技术：

2.大肠杆菌是寄居在人体大肠中的一类普通的原核生物，因其能够方便的易于培养和传代且生长速度快，营养需求简单等优势，并具备完善的基因组序列信息和清晰的遗传学背景，目前被广泛的基因工程、生物能源、微生物工业等研究中。因此，获得高生物量和高活性的大肠杆菌是很多科研工作者们研究的一大热点。
3.培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。选择合适的培养基，使之既能满足微生物生长的需要，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。
4.现有技术中，常使用lb(luria broth)、sob(super optimal broth)、soc(super optimal broth with catabolite repression)、tb(terrific broth)等培养基用于大肠杆菌的扩增培养，具有成本高、不易大批量配制、培养基成分不明确(如应用胰蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉膏等成分复杂原料)等缺点。近年来，也有一些以特定产物产量为目标的培养基，例如cn108048501 a、cn114381476a都披露了以l-苏氨酸的产量/产率为主要关注目标的大肠杆菌用培养基，主要成分包括葡萄糖、玉米浆、酵母粉、钴胺素、牛肉膏等；cn101323840a公开了用于生产l-色氨酸的escherichia coli k-12w3110用培养基，在tc溶液中加入胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂等。但发酵产生l-苏氨酸、l-色氨酸仅仅是大肠杆菌工业应用中的部分用途，在上述发酵过程中，代谢副产物乙酸和nh4
+
等的过量累积会对菌体生长、菌体活力和产酸产生严重影响，因此这类培养基的应用范围极为有限，仅使用于以相应产物为目标的大肠杆菌在工业量产阶段的应用，对于处于需要提高生长活力、提高增殖效率阶段的菌体，上述培养基并不能起到良好的培养效果。此外，如cn105238718a等的专利申请中公开了大肠杆菌的多级培养方法，分别用三种不同组成的培养基培养大肠杆菌，得到一级、二级和三级培养种子，这样的培养方法虽然考虑到了不同阶段菌种所需的不同营养物质，但进行该种分级培养需要分别配制三种组分完全不同的培养基，不同阶段的培养基或组分不可混用，且一级、二级培养基中依然添加了酵母提取物等成分复杂的物质。成分复杂物质的应用，往往导致培养基中存在大量悬浮颗粒而呈现轻微浑浊状态，如果感染其它杂菌，不能及时通过液体澄清度进行判断，从而可能对目标菌群的培养带来损失。


技术实现要素：

5.本发明基于上述现有技术中的缺陷，意在提供一种用于大肠杆菌诱导表达前的培养基，以获得更高的生物量和菌体活力，为外源蛋白的高效表达打下基础，主要适用于≤6l摇瓶阶段或相近规模的小型生物反应器。
6.相较于现有技术中的培养基，例如前述列举的类型，本发明中适用的氮源是大豆
14g/l，维生素b6 14g/l，余量为溶剂。
17.本发明大肠杆菌培养基，其所含的原料主要作用如下：
18.葡萄糖：常见形式包括一水合葡萄糖(dextrose monohydrate)(化学式c6h
12
o6·
h2o)可作为微生物利用的快速碳源。
19.大豆低分子多肽：大豆多肽也称肽基大豆蛋白水解物，是大豆蛋白质经蛋白酶作用得到的蛋白质水解产物，是平均肽链长度为23 10的短肽(以233的低分子肽为主)，以分子质量低于1 000da的多肽为主体，并通常含有少量大分子多肽、游离氨基酸、糖类和无机盐成分。大豆多肽的相对分子质量大小、肽链长短以及各种理化性质由所选用的酶类、水解条件和分离方法而定。本发明使用相对分子质量≤1 000da的低盐大豆低分子多肽作为微生物利用的植物源氮源，大豆低分子多肽保留了大豆蛋白的营养特性，但更容易被微生物摄取、利用，有利于菌类生长繁殖。
20.无水氯化钙：无水氯化钙(anhydrous calcium chloride)(化学式cacl2)，可为微生物提供钙离子。
21.肌醇：肌醇(inositol)(化学式c6h6o6)，可作为微生物生长因子。
22.硫酸铵：硫酸铵(ammonium sulphate)(化学式(nh4)2so4)，可为微生物提供铵离子。
23.无水硫酸镁：无水硫酸镁(magnesium sulfate anhydrous)(化学式mgso)，可为微生物提供镁离子。
24.氯化钠：氯化钠(sodium chloride)(化学式nacl)，可为微生物提供钠离子。
25.磷酸二氢钾：磷酸二氢钾(potassium dihydrogen phosphate)(化学式kh2po4)，可为微生物提供磷酸根离子和钾离子。
26.本发明的另一个目的是提供一种大肠杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：
27.按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；
28.将葡萄糖、大豆低分子多肽、肌醇，用不低于40℃的溶剂溶解得到组分a溶液，室温待用；
29.将无水氯化钙，用溶剂充分溶解后为组分b溶液，室温待用；
30.将硫酸铵，无水硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钾，使用溶剂充分溶解后为组分c溶液，室温待用；
31.将生物素，维生素b1，维生素和维生素b6，使用溶剂充分溶解后为生物素溶液；
32.将上述所述组分a、b、c溶液分别使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤后；合并后使用无菌氢氧化钠溶液将其ph值调节在6.8-7.0范围内，为溶液d；
33.将生物素溶液使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤；
34.将无菌溶液d与除菌后的生物素溶液合并混匀后，即为大肠杆菌培养基。
35.本发明的另一个目的是提供一种大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：
36.复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；
37.扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于本发明的大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h，得大肠杆菌菌液。
38.本发明中大肠杆菌培养步骤中，第0代次复苏种子液的制备中大肠杆菌接种量为0.2ml，第1代次复苏种子液的制备中大肠杆菌接种量为0.2ml，扩增培养液接种量为1ml。
39.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
40.本发明培养基添加的蛋白胨是大豆低分子多肽，更易提供给大肠杆菌所需的氮源等；且本发明培养基选用化学成分明确的营养物质作为培养基成分，避免了复杂的不明成分对菌群活力、易观察程度带来的负面影响。本发明培养基能够满足大肠杆菌的高生物量和较高菌体活力的培养扩增需求，适用于≤6l摇瓶阶段或相近规模的小型生物反应器的培养规模，合理调节大肠杆菌的代谢负荷，维持菌群高生物量和高活力，为外源蛋白的高效表达打下基础。其中，高密度型大肠杆菌培养基可提供高生物量和高菌体活力的培养结果，高密度经济型大肠杆菌培养基可在兼顾培养基成本经济性前提下提供较高生物量和较高菌体活力的培养结果。
附图说明
41.附图1是本技术高密度型、高密度经济型、对比例组别的培养基培养大肠杆菌效果对比结果。
42.其中：
43.a.为各组别培养基培养菌液a
600nm
的测定结果；
44.b.为各组别培养基培养菌液湿菌重的测定结果；
45.c.为各组别培养基培养菌体活力的测定结果。
具体实施方式
46.以下结合具体实施例对本发明的大肠杆菌培养基作进一步详细的说明。
47.实施例1高密度型大肠杆菌培养基
48.组成如下：葡萄糖26g/l，大豆低分子多肽26g/l，无水氯化钙0.19g/l，肌醇0.02g/l，硫酸铵9.5g/l，无水硫酸镁0.95g/l，氯化钠0.18g/l，磷酸二氢钾1.94g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。
49.本实施例1提供的一种高密度型大肠杆菌培养基中生物素溶液组成如下：生物素0.56g/l，维生素b1 14g/l，维生素b2 14g/l，维生素b6 14g/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。
50.上述高密度型大肠杆菌培养基制备方法，包括以下步骤：
51.按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；
52.将葡萄糖、大豆低分子多肽、肌醇，使用不高于40℃的溶剂溶解得到组分a溶液，室温待用；
53.将无水氯化钙，用溶剂充分溶解后为组分b溶液，室温待用；
54.将硫酸铵，无水硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钾，使用溶剂充分溶解后为组分c溶液，室温待用；
55.将生物素，维生素b1，维生素和维生素b6，使用不高于40℃的溶剂充分溶解后为生物素溶液；
56.所述溶剂为纯化水/注射用水；
57.将上述所述组分a、b、c溶液分别使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤后；合并后使用无菌氢氧化钠溶液将其ph值调节在6.8-7.0范围内，为溶液d；
58.将生物素溶液使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤；
59.将无菌溶液d与除菌后的生物素溶液合并混匀后，即为高密度型大肠杆菌培养基。
60.上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
61.复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；
62.扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于上述所述高密度型大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h，得大肠杆菌菌液。
63.实施例2高密度经济型大肠杆菌培养基
64.组成如下：葡萄糖14.3g/l，大豆低分子多肽14.3g/l，无水氯化钙0.10g/l，肌醇0.011g/l，硫酸铵5.35g/l，无水硫酸镁0.53g/l，氯化钠0.11g/l，磷酸二氢钾1.1g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。
65.本实施例2提供的一种高密度经济型大肠杆菌培养基中生物素溶液组成如下：生物素0.56g/l，维生素b1 14g/l，维生素b2 14g/l，维生素b6 14g/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。
66.上述高密度经济型大肠杆菌培养基制备方法，包括以下步骤：
67.按上述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；
68.将葡萄糖、大豆低分子多肽、肌醇，用不高于40℃的溶剂溶解得到组分a溶液，室温待用；
69.将无水氯化钙，用溶剂充分溶解后为组分b溶液，室温待用；
70.将硫酸铵，无水硫酸镁，氯化钠，磷酸二氢钾，使用溶剂充分溶解后为组分c溶液，室温待用；
71.将生物素，维生素b1，维生素和维生素b6，使用不高于40℃的溶剂充分溶解后为生物素溶液；
72.所述溶剂为纯化水/注射用水；
73.将上述所述组分a、b、c溶液分别使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤后；合并后使用无菌氢氧化钠溶液将其ph值调节在6.8-7.0范围内，为溶液d；
74.将生物素溶液使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤；
75.将无菌溶液d与除菌后的生物素溶液合并混匀后，即为高密度经济型大肠杆菌培养基。
76.上述大肠杆菌培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
77.复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；
78.扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于上述所述高密度经济型大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h，得大肠杆菌菌液。
79.实施例3对比例
80.配置对比例培养基，由以下原料组成：胰蛋白胨20g/l，酵母提取物7g/l，葡萄糖5g/l，二水合硫酸镁2.5g/l，氯化钠2g/l，余量为溶剂。所述溶剂为纯化水/注射用水。
81.上述对照组培养基制备方法，包括以下步骤：称量所需质量胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、二水合硫酸镁和氯化钠，使用溶剂成分溶解后，115℃，30min湿热灭菌待冷却后为可使用培养基。
82.上述对照组培养基培养大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
83.复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；
84.扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于权利要求1所述的大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h，得大肠杆菌菌液。
85.实施例4不同培养基对大肠杆菌的培养效果
86.4.1菌液a
600nm
的测定
87.将大肠杆菌菌液离心(6000g，5min)去上清获得湿菌泥；后将湿菌泥使用pbs(ph＝7.4)溶液同体积重悬获得菌体悬浮液，使用可见光-紫外分光光度计在波长600nm处测定菌体悬液的a值，稀释要求：使用pbs(ph＝7.4)溶液稀释大肠杆菌悬浮液制备待测物，使待测物在600nm处a值落在0.3-0.8之间；菌液a
600nm
值计算方法：a
600nm
值＝待测物a值
×
稀释倍数。
88.4.2菌液湿菌重的测定
89.使用离心机分离大肠杆菌菌液获得湿菌泥；离心参数：6000g，8min；湿菌重值计算方法：湿菌重值(g/l)＝培养物湿菌泥重量(g)/培养物体积(l)。
90.4.3菌体活力的测定
91.使用pbs(ph＝7.4)溶液稀释的大肠杆菌悬浮液制备待孵育物，使待孵育物a
600nm
值范围落在0.95-1.05之内；将待孵育物加入的cck-8试剂，充分混合后37℃孵育4h；等待孵育结束后使用离心机将孵育物离心分离获得上清液，离心参数：6000g，8min；使用可见光-紫外分光光度计在波长460nm处测定此上清液a值，菌体活力值计算方法：a
460nm
值＝上清液a值
×
稀释倍数。
92.4.4验证试验
93.对大肠杆菌培养基配方进行连续10次的验证试验。结果见表1和图1。图1中，a.为各组别培养基培养菌液a
600nm
的测定结果；b.为各组别培养基培养菌液湿菌重的测定结果；c.为各组别培养基培养菌体活力的测定结果。
94.表1对比结果统计量
[0095][0096]
表1中，p
shapiro-wilk
、p
levene's
、p
t-test
、p
mann-whitney
、p
welch
分别为按照shapiro-wilk、levene's、t-test、mann-whitney、welch等检验方法获得的p值；置信区间：95％cl。
[0097]
综合考虑实验中各项考察指标的平均值、中位数与众数，认为取得良好培养效果的培养基应达到：a
600nm
值》12(效果优秀)或a
600nm
值》10(效果良好)；湿菌重值≥75g/l(效果优秀)或湿菌重值≥45g/l(效果良好)；菌体活力值≥10(效果优秀)或菌体活力值≥8(效果良好)。具体数据见表2。
[0098]
通过表1、表和图1对比结果可知，本发明的两种类型培养基分别相比于对比例的培养基，培养结果各项指标值的差异具有统计学意义，高密度型组与高密度经济型组三项对比项目数据中位数均＞对比例数据中位数；高密度型培养基与高密度经济型培养基具均有较高a
600nm
值、湿菌重和菌体活力值的培养结果，且高密度型培养基与高密度经济型培养基培养结果获得较高a
600nm
值，湿菌重和菌体活力值的概率较高；高密度经济型培养基相较高密度型培养基有效组分质量降低约40％情况下，仍可获得较高a
600nm
值，湿菌重和菌体活力值的培养结果，其培养成本具有一定经济性。
[0099]
表2培养结果数据汇总
[0100][0101]
以上所述的实施例仅表示本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因其而理解为本发明专利范围的限制，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

技术特征：
1.一种大肠杆菌培养基，其特征在于组成如下：葡萄糖13-28g/l，大豆低分子多肽10-30g/l，无水氯化钙0.10-0.20g/l，肌醇0.010-0.02g/l，硫酸铵5-10g/l，无水硫酸镁0.50-1.00g/l，氯化钠0.10-0.20g/l，磷酸二氢钾1.00-2.10g/l，生物素溶液10-12ml/l，余量为溶剂。2.如权利要求1所述的大肠杆菌培养基，其特征在于，所述的生物素溶液组成如下：生物素0.5-0.6g/l，维生素b1 12-15g/l，维生素b2 12-15g/l，维生素b6 12-15g/l，余量为溶剂。3.如权利要求1所述的大肠杆菌培养基，其特征进一步在于组成如下：葡萄糖25-28g/l，大豆低分子多肽26-30g/l，无水氯化钙0.19-0.20g/l，肌醇0.018-0.02g/l，硫酸铵9.5-10g/l，无水硫酸镁0.95-1.00g/l，氯化钠0.18-0.20g/l，磷酸二氢钾1.94-2.10g/l，生物素溶液10-12ml/l，余量为溶剂；或，葡萄糖13.0-14.5g/l，大豆低分子多肽10-14.5g/l，无水氯化钙0.10-0.12g/l，肌醇0.010-0.011g/l，硫酸铵5.00-5.35g/l，无水硫酸镁0.50-0.53g/l，氯化钠0.10-0.11g/l，磷酸二氢钾1.0-1.1g/l，生物素溶液10-11ml/l，余量为溶剂。4.如权利要求1所述的大肠杆菌培养基，其特征进一步在于组成如下：葡萄糖26g/l，大豆低分子多肽26g/l，无水合氯化钙0.19g/l，肌醇0.02g/l，硫酸铵9.5g/l，无水硫酸镁0.95g/l，氯化钠0.18g/l，磷酸二氢钾1.94g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂；或，葡萄糖14.3g/l，大豆低分子多肽14.3g/l，无水氯化钙0.10g/l，肌醇0.011g/l，硫酸铵5.35g/l，无水硫酸镁0.53g/l，氯化钠0.11g/l，磷酸二氢钾1.1g/l，生物素溶液10ml/l，余量为溶剂。5.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌培养基，其特征进一步在于，所述的生物素溶液组成如下：生物素0.56g/l，维生素b1 14g/l，维生素b2 14g/l，维生素b6 14g/l，余量为溶剂。6.如权利要求1-4任一项所述的大肠杆菌培养基，其特征进一步在于，所述溶剂为纯化水或注射用水。7.一种大肠杆菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按权利要求1-6任一项所述大肠杆菌培养基的原料配比称取各原料；将葡萄糖、大豆低分子多肽、肌醇溶解得到组分a溶液；将无水氯化钙溶解得到组分b溶液；将硫酸铵、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钾溶解后得到组分c溶液；将生物素、维生素b1、维生素b2、维生素b6溶解得到生物素溶液；将上述所述组分a、b、c溶液分别除菌过滤；合并后将其ph值调节在6.8-7.0范围内，为溶液d；将生物素溶液除菌过滤；将溶液d与除菌后的生物素溶液合并混匀；所述溶解使用纯化水或注射用水。
8.如权利要求7所述的大肠杆菌培养基的制备方法，其特征进一步在于，所述除菌过滤为使用装有0.22/0.20μm低吸附滤芯/滤器的过滤除菌装置除菌过滤。9.一种大肠杆菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：复苏种子液的制备：在无菌条件下，取大肠杆菌接种于大肠杆菌复苏培养基中，在37℃、220rpm恒温摇床中培养24h，得种子培养液；扩增培养：在无菌条件下，取2代次复苏种子培养液接种于权利要求1-6任一项所述的大肠杆菌培养基中，在35339℃、2303270rpm恒温摇床中培养24h。10.如权利要求9所述的大肠杆菌的培养方法，其特征进一步在于所述2代次复苏种子培养液的制备包括：第0代次复苏种子液的大肠杆菌接种量为0.2ml，第1代次复苏种子液的大肠杆菌接种量为0.2ml，扩增培养液接种量为1ml。

技术总结
本发明涉及微生物培养基领域，具体涉及一种大肠杆菌培养基、其制备方法及应用，所述培养基组成为：葡萄糖13-28g/L，大豆低分子多肽10-30g/L，无水氯化钙0.10-0.20g/L，肌醇0.010-0.02g/L，硫酸铵5-10g/L，无水硫酸镁0.50-1.00g/L，氯化钠0.10-0.20g/L，磷酸二氢钾1.00-2.10g/L，生物素溶液10-12ml/L，余量为溶剂；其中所述生物素溶液组成为：生物素0.5-0.6g/L，维生素B1 12-15g/L，维生素B2 12-15g/L，维生素B6 12-15g/L，余量为溶剂。大肠杆菌在本发明的培养基中具有较高的生物量及菌体活力。力。力。


技术研发人员：徐世友 李薇 周静 雷清
受保护的技术使用者：兰州生物制品研究所有限责任公司
技术研发日：2023.02.09
技术公布日：2023/7/19