一种辣椒根结线虫抗性基因Me1紧密连锁的KASP分子标记及应用

一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子遗传育种技术领域，特别涉及一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记及应用。


背景技术：

2.根结线虫是引起作物减产的主要病原物，多发生在热带、亚热带和暖温带地区。专性寄生于寄主的根、块茎及球茎部位。根结线虫是辣椒产区中极难防治的土传性病害，根结线虫受温度影响尤其明显，一般来说最适生长温度是25～30℃，因此，根结线虫主要在南方地区危害辣椒生产。随着北方辣椒保护地种植面积不断扩大，根结线虫在北方也逐渐开始危害辣椒生产。利用线虫抗病基因并培育抗病辣椒品种是防止根结线虫最有效的方法。
3.目前在辣椒中发现的抗病基因主要有7个，分别是n，me1，me2，me3，me4，me7和mech1。其中me1具有广谱抗性，应用价值较大。me1基因从辣椒材料pm217中发现，随后将该基因转育到pm217与yolo wonder杂交获得的dh(双单倍体)群体中的材料dh330中。分子标记辅助育种基于基因型筛选种质资源，避免或降低表型选择的误差，能大大提高育种效率。开发根结线虫抗病基因连锁标记，有助于加速抗根结线虫辣椒品种的培育。目前已开发了许多与根结线虫抗病基因me1连锁的分子标记，如scar标记、ssr标记等。
4.kasp(kompetitiveallelespecific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)分型技术是近年来开发的可对基因组中snps和特定位点上的indels进行精准基因型分型，具有灵敏度高、高通量、低成本、快速等优点，但是目前还没有发现基于kasp分型技术的专门针对辣椒根结线虫抗性基因me1的kasp类型分子标记。
5.因此，一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记及应用的技术有待进一步研究。


技术实现要素：

6.本发明旨在解决上述问题，提供了一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记及其在鉴定辣椒根结线虫抗病辣椒品种中的应用以及鉴定方法，该鉴定方法的准确率高，效率快。
7.一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记，所述辣椒根结线虫抗性基因me基因簇位于辣椒9号染色体上28cm区域，在该28cm区域根据snp位点信息设计kasp标记，在双亲中进行多态性筛选，筛选获得4对kasp标记，在双亲中具有明显多态性，将4个kasp标记在bc1群体进行基因型分型，发现kasp标记pep-me1-k54与bc1群体中单株抗感表型最为吻合，该标记与me1基因重组率为3.13％，遗传距离为1.6cm；
8.该分子标记前的引物包括两条前引物a1、a2和一条共用后引物c；
9.所述前引物a1的核苷酸序列如seq id no.1所示为：
[0010]5′‑
catttaaatgcaatttgtttcccaagctgta-3
′
；
[0011]
所述前引物a2的核苷酸序列如seq id no.2所示为：
[0012]5′‑
catttaaatgcaatttgtttcccaagctgtc-3
′
；
[0013]
所述后引物c的核苷酸序列如seq id no.3为：
[0014]5′‑
tctttgcgaaagactcttttcccca-3
′
。
[0015]
在上述方案基础上，针对该snp位点，将所述前引物a1的5
′
端添加fam荧光标签序列，将所述前引物a2的5
′
端添加hex荧光标签序列；所述fam荧光标签序列如seq id no.4所示为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’；所述hex荧光标签序列如seq id no.5所示为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’；由此得到相应的辣椒根结线虫抗病基因me1相关的kasp高通量分子标记pep-me1-k54的专用引物序列。
[0016]
在上述方案基础上，所述kasp标记的pcr扩增体系为4.055μl，其中dna模板2μl，kasp v4.0 2x master mix 96/384low rox 2μl，引物混合液0.055μl；
[0017]
所述kasp标记的pcr扩增程序为：384孔pcr板扩增，
[0018][0019]
在上述方案基础上，所述kasp v4.0 2x master mix 96/384low rox由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等组成；所述荧光探针a的序列如seq id no.6所示为5
′‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3
′
，5
′
末端连接1个荧光基团fam；所述荧光探针b的序列如seq id no.7所示为5
′‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3
′
，5
′
末端连接1个荧光基团hex；所述淬灭探针a的序列如seq id no.8所示为5
′‑
agcatgaacttggtcaccttc-3
′
，3
′
末端连接淬灭基团q；所述淬灭探针b的序列如seq id no.9所示为5
′‑
aatccgttgactccgaccttc-3
′
，3
′
末端连接淬灭基团q；
[0020]
所述引物混合液体系为50μl，包含引物c15μl，引物a1 6μl，引物a2 6μl和灭菌h2o 23μl，其中引物浓度均为100μmol
·
l-1
。
[0021]
在上述方案基础上，若基因分型的检测结果不明显，可添加程序94℃20s，57℃60s，3个循环；37℃1min，再进行数据读取。
[0022]
在上述方案基础上，以含有根结线虫抗病基因me1的辣椒抗病品种dh330与感病品种0516为双亲，杂交获得f1，f1与0516回交获得bc1群体，以bc1群体为定位群体，群体大小
1600株。
[0023]
在上述方案基础上，还需要制备根结线虫悬浮液、根结线虫接种及鉴定；
[0024]
所述制备根结线虫悬浮液的方法为：挑取病株上的线虫卵块，孵化在辣椒植株上，对线虫进行扩繁；在扩繁植株上挑取卵块，置于无菌水中，黑暗条件下28℃孵化，3～5天收集二龄幼虫，制备悬浮液，将悬浮液浓度调至1000条/ml，16℃备用；
[0025]
所述根结线虫接种及鉴定的方法为：植株5～6叶期进行苗期接种；所有植株浇透水，在植株根系2cm处打孔，注入1ml制备好的线虫悬浮液。控水控温，温度控制在18～28℃，60天后，用清水小心洗净根系，注意不要洗掉卵块，装入自封袋4度保存。用伊红黄染根系10min左右，洗去浮色后统计卵块数目，卵块数目大于5为感病，卵块数目小于等于5为抗病。
[0026]
在上述方案基础上，对bc1群体进行鉴定结果为：bc1群体中825株抗病，775株为感病，抗感分离比为1.06:1，卡方检验符合1:1理论分离比。
[0027]
基于同一个发明构思，本发明还提供了一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记在鉴定辣椒后代群体中根结线虫抗病材料上的应用，辣椒根结线虫抗病辣椒品种的鉴定方法如下：
[0028]
步骤一：pcr扩增和基因分型；
[0029]
步骤二：结果判断：聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，a:a基因型，为抗病材料；聚合在接近y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，c:c基因型，为感病材料；中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，c:a基因型，为抗病材料；左下角显示黑色的样本为以h2o替代模板的空白对照。
[0030]
在上述方案基础上，所述kasp pcr扩增反应后读数需使用roche 480荧光定量仪，进行kasp genotying，读取荧光数据，将数据导入软件进行基因分型，所述基因分型数据处理软件为klustercaller软件。
[0031]
本发明具有如下优点：本发明发现了基于kasp分型技术的专门针对辣椒根结线虫抗性基因me1的kasp类型分析标记；利用该分子标记可不通过辣椒根结线虫病抗性人工接种鉴定，只在苗期对辣椒植株的dna检测，就可以对辣椒根结线虫病抗性基因进行判断，可广泛应用到分子标记辅助育种。此外，与传统的ssr，indel标记相比，本发明的kasp类型分子标记及检测方法操作简单，对样品质量和反应条件要求不严苛，具有检测灵敏度高、准确率高、高通量的优点，可对样品进行大批量检测，缩短鉴定时间。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0033]
图1：本发明利用高通量kasp分子标记pep-me1-k54在dh330和0516杂交获得的bc1群体中部分后代中的分型结果；
[0034]
图例说明：聚合在接近y轴的绿色点为辣椒根结线虫感病材料(c:c基因型)；聚合在中间的红色点为辣椒根结线虫抗病材料，基因型杂合(c:a基因型)杂合型单株；
[0035]
图2：本发明利用高通量kasp分子标记pep-me1-k54在回交后代中的kasp分型结果；
[0036]
图例说明：其中，聚合在接近y轴的绿色点为辣椒根结线虫感病材料(c:c基因型)；聚合在中间的红色点为辣椒根结线虫抗病材料，基因型杂合型单株(c:a基因型)；蓝色点为抗病对照dh330(a:a基因型)，灰色点表示空白对照(ntc)。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和实例对本发明作进一步说明：
[0038]
实施例一：辣椒根结线虫抗病基因me1高通量kasp标记的开发及利用该标记的检测方法
[0039]
本发明以含有根结线虫抗病基因me1的辣椒抗病品种dh330与感病品种0516为双亲，杂交获得f1，f1与材料0516回交获得bc1群体。群体大小1600株。以该群体为定位群体。
[0040]
制备线虫悬浮液：挑取病株上的线虫卵块，孵化在辣椒植株上，对线虫进行扩繁。用镊子在扩繁植株根部挑取卵块，置于无菌水中，黑暗条件下28℃孵化，3～5天收集二龄幼虫，制备悬浮液，在显微镜下，将悬浮液浓度调至1000条/ml，16℃备用。
[0041]
根结线虫接种及鉴定：植株5～6叶期进行苗期接种。所有植株浇透水，在植株根系2cm处打孔，注入1ml制备好的线虫悬浮液。控水控温，温度控制在18～28℃，60天后，用清水小心洗净根系，注意不要洗掉卵块，装入自封袋4度保存。用伊红黄染根系10min左右，洗去浮色后统计卵块数目，卵块数大于5为感病，卵块数目小于等于5为抗病。
[0042]
对bc1群体进行鉴定，结果表明：bc1群体中825株抗病，775株为感病，抗感分离比为1.06:1，卡方检验符合1:1理论分离比。
[0043]
kasp分子标记的引物设计：对双亲进行重测序，根据snp位点的测序深度、质量值和snp缺失度，挑选测序深度大于10，平均质量值高于20，双亲纯合的snp设计成kasp分子标记pep-me1-k54的引物，共设计了覆盖辣椒12条染色体的kasp引物。
[0044]
kasp分子标记筛选：据前人研究的得到抗根结线虫me基因簇定位在9号染色体上28cm区域，且开发了连锁标记scar_b94、scar_cd、caps_f4r4(djian-caporalino et al.，2007)。发明人根据标记在参考基因组的位置，在该区域根据存在的snp位点信息设计kasp标记，共设计了70对kasp标记。在双亲中进行多态性筛选，最终筛选获得4对kasp标记，在双亲中具有明显多态性，将4个kasp标记在bc1群体进行基因型分型，发现kasp标记pep-me1-k54与bc1群体中单株抗感表型最为吻合(图1)，基于重组率计算公式，重组率＝重组的配子数/总配子数
×
100％，该标记与me1基因重组率为3.13％，遗传距离为1.6cm，该结果表明kasp标记pep-me1-k54与根结线虫抗病基因me1紧密连锁。
[0045]
该标记前引物a1:5
′‑
catttaaatgcaatttgtttcccaagctgta-3
′
，如seq id no.1所示；
[0046]
前引物a2:5
′‑
catttaaatgcaatttgtttcccaagctgtc-3
′
，如seq id no.2所示；
[0047]
后引物c:5
′‑
tctttgcgaaagactcttttcccca-3
′
，如seq id no.3所示。
[0048]
将前引物a1、前引物a2的5’端分别添加如下的fam和hex荧光标签序列：
[0049]
fam荧光标签序列：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，如seq id no.4所示；
[0050]
hex荧光标签序列5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，如seq id no.5所示。
[0051]
由此得到相应的辣椒根结线虫抗病基因me1相关的kasp高通量分子标记pep-me1-k54的专用引物序列，并根据该引物序列安排上海生工公司北京合成部进行合成：
[0052]
引物1：
[0053]
gaaggtgaccaagttcatgctcatttaaatgcaatttgtttccca agctgta；
[0054]
引物2：
[0055]
gaaggtcggagtcaacggattcatttaaatgcaatttgtttccca agctgtc；
[0056]
引物3：tctttgcgaaagactcttttcccca。
[0057]
kasp标记的pcr扩增体系(4.055μl)：
[0058][0059]
其中，kasp v4.0 2
×
master mix 96/384,low rox为英国lgc公司产品，其产品目录号为kbs-1016-017。kasp v4.0 2
×
master mix 96/384,low rox由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等组成。荧光探针a的序列为5
′‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3
′
，5
′
末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b的序列为5
′‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3
′
，5
′
末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5
′‑
agcatgaacttggtcaccttc-3
′
，3
′
末端连接淬灭基团q；淬灭探针b的序列为5
′‑
aatccgttgactccgaccttc-3
′
，3
′
末端连接淬灭基团q。
[0060]
(2)引物混合液体系(50μl)：引物浓度均为100μmol
·
l-1
[0061]
c15μla16μla26μl灭菌h2o23μl
[0062]
(3)384孔pcr板扩增，程序如下：
[0063]
step194℃15minstep294℃20sstep361℃60sstep4go step210cylesstep594℃20sstep655℃60sstep7go step43cylesstep837℃1min
[0064]
(4)pcr产物的检测
[0065]
kasp pcr扩增反应后读数需使用roche 480荧光定量仪，进行kasp genotying，读
取荧光数据，若基因分型效果不理想，则需要添加程序：94℃20s，57℃60s，3个循环；37℃1min，再进行数据读取。
[0066]
lgc公司提供了在roche 480荧光定量仪上分析的说明书，可从www.lgcgenomics.com获的。x轴为fam(465-510)通道，y轴为hex(533-580)通道。根据分析结果按照如下确定待测基因的具体基因型：聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，左下角显示黑色的样本为以h2o替代模板的空白对照。
[0067]
具体而言，如图1所示：
①
若待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测辣椒不含有抗病基因me1(snp分型为c:c基因型)，辣椒的根结线虫病抗病性表型为“感病”；
②
若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测辣椒含有抗病基因me1(snp分型为a:a基因型)，辣椒的根结线虫病抗病性表型为“抗病”；
③
若所述待测辣椒的扩增产物的荧光信号数据经klustercaller软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测辣椒含有抗病基因me1(snp分型为c:a基因型)，辣椒的根结线虫病抗病性表型为“抗病”。
[0068]
实施例二：标记pep-me1-k54在辣椒根结线虫抗病基因me1回交转育中的应用
[0069]
供试材料：包括3个辣椒bc2群体，每个群体包含24个单株(详见表1)。群体构建是以3个辣椒自交系(分别为0516，yolo wonder，茄门)为轮回亲本与含有根结线虫抗病基因me1的材料dh330杂交后，利用轮回亲本回交2代获得。
[0070]
参照实施例一中的方法，利用高通量kasp标记对回交群体内单株进行辣椒根结线虫抗性基因me1的基因型进行鉴定，基因型鉴定结果与根结线虫抗性表型基本吻合，72个单株中检测出2个重组单株(即基因型结果和根结线虫抗性表型不一致)(结果见表1和图2)。
[0071]
表1供试材料me1抗性基因的基因型检测结果me1抗性基因分型结果
[0072][0073]
如表1和图2的基因型检测结果所示，基因分型结果符合预期，抗感分型结果与表型一致，表明该标记可用于抗病基因me1回交转育，可应用于选育鉴定辣椒根结线虫病抗病辣椒品种，可明显缩短遗传育种时间，提高遗传育种效率。
[0074]
上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于
本发明思路或方法所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记，其特征在于：所述分子标记引物包括两条前引物a1、a2和一条共用后引物c；所述前引物a1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述前引物a2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述后引物c的核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记，其特征在于：将所述前引物a1的5
′
端添加fam荧光标签序列，将所述前引物a2的5
′
端添加hex荧光标签序列；所述fam荧光标签序列如seq id no.4所示；所述hex荧光标签序列如seq id no.5所示。3.如权利要求1或2所述的kasp分子标记在鉴定辣椒根结线虫抗病品种上的应用。4.根据权利要求3所述的kasp分子标记在鉴定辣椒根结线虫抗病品种上的应用，其特征在于：辣椒根结线虫抗病品种的鉴定方法如下：步骤一：检测：采用上述引物对待测辣椒后代群体材料的基因组dna进行pcr扩增和基因分型；步骤二：结果判断：聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，a:a基因型，为抗病材料；聚合在接近y轴上的显示绿色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，c:c基因型，为感病材料；中间显示红色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，c:a基因型，为抗病材料。5.根据权利要求4所述的kasp分子标记在鉴定辣椒根结线虫抗病品种上的应用，其特征在于：所述kasp标记的pcr扩增体系为4.055μl，其中dna模板2μl，kasp v4.0 2x master mix 96/384low rox 2μl，引物混合液0.055μl；所述kasp标记的pcr扩增程序为：6.根据权利要求5所述的kasp分子标记在鉴定辣椒根结线虫抗病品种上的应用，其特征在于：所述kasp v4.0 2x master mix 96/384low rox包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b；
所述荧光探针a的序列如seq id no.6所示，其5
′
末端连接1个荧光基团fam；所述荧光探针b的序列如seq id no.7所示，其5
′
末端连接1个荧光基团hex；所述淬灭探针a的序列如seq id no.8所示，其3
′
末端连接淬灭基团q；所述淬灭探针b的序列如seq id no.9所示，其3
′
末端连接淬灭基团q。7.根据权利要求5所述的一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记，其特征在于：所述引物混合液体系为50μl，包含后引物c15μl，前引物a1 6μl，前引物a2 6μl和灭菌h2o 23μl，其中引物浓度均为100μmol
·
l-1
。8.根据权利要求5所述的一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记，其特征在于：若基因分型的检测结果不明显，可添加程序94℃20s，57℃60s，3个循环；37℃1min，再进行数据读取。9.根据权利要求6所述的一种辣椒根结线虫抗性基因me1紧密连锁的kasp分子标记在鉴定辣椒后代群体中根结线虫抗病材料上的应用，其特征在于：所述kasp pcr扩增反应后读数需使用roche 480荧光定量仪，进行kasp genotying，读取荧光数据，将数据导入软件进行基因分型，所述基因分型数据处理软件为klustercaller软件。

技术总结
本发明涉及植物分子遗传育种技术领域，具体涉及一种辣椒根结线虫抗性基因Me1紧密连锁的KASP分子标记及应用。所述辣椒根结线虫抗性基因Me基因簇位于辣椒9号染色体上28cM区域，发现KASP标记Pep-Me1-K54与BC1群体中单株抗感表型最吻合，该标记与Me1基因重组率为3.13％，遗传距离为1.6cM，所述分子标记包括两条前引物A1、A2和一条共用后引物C。本发明发现基于KASP分型技术针对辣椒根结线虫抗性基因Me1的KASP类型分析标记，利用该分子标记可不通过辣椒根结线虫病抗性人工接种鉴定，只在苗期对辣椒植株的DNA检测，就可以对辣椒根结线虫病抗性基因进行判断，进一步地提高了根结线虫抗病辣椒品种的鉴定效率，可广泛应用到分子标记辅助育种。标记辅助育种。标记辅助育种。


技术研发人员：王立浩 于海龙 冯锡刚 曹亚从 张正海 吴华茂 李雪桥
受保护的技术使用者：海南省农业科学院蔬菜研究所
技术研发日：2023.02.09
技术公布日：2023/7/19