一种DNA建库预混液的制作方法

一种dna建库预混液
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，具体涉及一种dna建库预混液。


背景技术：

2.在过去的5年里，ngs技术在生命科学领域得到了广泛应用。与此同时，随着测序技术的发展和进步，衍生了一些核酸提取和文库制备的方法。文库制备也是二代测序的基础，其基本步骤包括：(1)将待测序的dna分子用超声波打碎成200-500bp长的序列片段，或酶法打断(若是血液中游离的dna或其他已打断的dna可忽略此步骤)；(2)将打碎后的基因组进行3’端突出切平，5’端突出补平；(3)在切平或补平后的片段3’端加a和5’端进行磷酸化；(4)对修复后的片段进行接头连接；(5)对接头连接后的片段进行磁珠纯化；(6)对纯化后dna片段进行pcr扩增；(7)对扩增后的文库进行磁珠纯化；(8)将扩增纯化后的dna文库用探针捕获法或靶向引物法进行目标区富集制备测序文库。
3.目前，市面上现有的试剂盒都是采用分步式流程，操作相对比较繁琐，中间过程中不可避免地需要频繁开盖，有引入污染的风险。目前mngs技术检测流程中用到的试剂中包含常见的环境微生物，例如核酸提取试剂盒、文库构建试剂盒，这些微生物统称为“试剂背景菌”。salter s等(salter s j,cox m j,et al.reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.[j].bmc biology,2014,12(1).)研究发现，随着模拟样本(投入定量肠道沙门菌)稀释倍数增加，肠道沙门菌特异性序列占比逐步降低，其他微生物序列(试剂盒基因组)逐步占比提高。因此，尽可能减少样本和环境来源背景菌的存在和干扰，是mngs技术面临的一大挑战。


技术实现要素：

[0004]
本技术的目的在于提供一种dna建库预混液，其将末端补平、5’端磷酸化以及接头连接过程中需要的酶和buffer提前预混，一定程度上减少了操作步骤，中间无开盖或仅需一步开盖操作，极大程度地降低了背景菌引入的风险。
[0005]
本技术的第一方面提供一种dna建库预混液，所述预混液包含：缓冲成分、金属盐、dntp、atp、dtt(二硫苏糖醇)、多聚核苷酸激酶、dna聚合酶和dna连接酶。
[0006]
在一些实施方案中，所述缓冲成分是例如tris、hepes和mes中的一种或多种，优选tris，更优选100-500mmtris，最优选200-400mmtris，包括所述范围内的210mm，220mm，230mm，240mm，250mm，260mm，270mm，280mm，290mm，300mm，310mm，320mm，330mm，340mm，350mm，360mm，370mm，380mm，390mm和400mm。
[0007]
在一些实施方案中，所述金属盐包括mg
2+
盐、mn
2+
盐、ca
2+
盐、k
+
盐、na
+
盐、cs
+
盐、ni
2+
盐中的一种或者多种。在一些实施方案中，所述金属盐的浓度是100-500mm，优选100-300mm，包括所述范围内的100mm，110mm，120mm，130mm，140mm，150mm，160mm，170mm，180mm，190mm，200mm，210mm，220mm，230mm，240mm，250mm，260mm，270mm，280mm，290mm和300mm。
[0008]
在一些实施方案中，所述金属盐包括mg
2+
盐、k
+
盐和na
+
盐，优选包括mgcl2、nacl和
kcl，更优选地，所述mgcl2的浓度是20mm-100mm，包括所述范围内的20mm，25mm，30mm，35mm，40mm，45mm，50mm，55mm，60mm，65mm，70mm，75mm，80mm，85mm，90mm，95mm和100mm；所述nacl的浓度是50mm-200mm，包括所述范围内的50mm，60mm，70mm，80mm，90mm，100mm，110mm，120mm，130mm，140mm，150mm，160mm，170mm，180mm，190mm和200mm；所述kcl的浓度是20mm-100mm，包括所述范围内的20mm，25mm，30mm，35mm，40mm，45mm，50mm，55mm，60mm，65mm，70mm，75mm，80mm，85mm，90mm，95mm和100mm。
[0009]
在一些实施方案中，所述dntp的浓度是0.1mm-10mm，包括所述范围内的0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm和10mm。
[0010]
在一些实施方案中，所述atp的浓度是1-20mm，优选1-10mm，包括所述范围内的1mm，2mm，3mm，4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm和10mm。
[0011]
在一些实施方案中，所述dtt的浓度是10-50mm，优选10-30mm，包括所述范围内的10mm，12mm，15mm，18mm，20mm，21mm，22mm，23mm，24mm，25mm，26mm，27mm，28mm，29mm和30mm。
[0012]
在一些实施方案中，所述多聚核苷酸激酶是t4多聚核苷酸激酶，所述t4多聚核苷酸激酶的浓度是0.1-10u/μl，优选0.1-5u/μl，包括所述范围内的0.1u/μl，0.15u/μl，0.2u/μl，0.25u/μl，0.3u/μl，0.35u/μl，0.4u/μl，0.45u/μl，0.5u/μl，0.55u/μl，0.6u/μl，0.65u/μl，0.7u/μl，0.8u/μl，0.9u/μl，1u/μl，1.5u/μl，2u/μl，2.5u/μl，3u/μl，3.5u/μl，4u/μl和5u/μl。
[0013]
在一些实施方案中，所述dna聚合酶包括用于末端补平的dna聚合酶，例如选自t4dna聚合酶、t3dna聚合酶、t7dna聚合酶和大肠杆菌dna聚合酶中的一种或多种，优选大肠杆菌dna聚合酶，更优选地，所述大肠杆菌dna聚合酶的浓度是0.1-10u/μl，优选0.1-5u/μl，包括所述范围内的0.1u/μl，0.15u/μl，0.2u/μl，0.25u/μl，0.3u/μl，0.35u/μl，0.4u/μl，0.45u/μl，0.5u/μl，0.55u/μl，0.6u/μl，0.65u/μl，0.7u/μl，0.8u/μl，0.9u/μl，1u/μl，1.5u/μl，2u/μl，2.5u/μl，3u/μl，3.5u/μl，4u/μl和5u/μl。
[0014]
在一些实施方案中，所述dna聚合酶还包括用于完成末端加da(腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)的dna聚合酶，例如taqdna聚合酶、koddna聚合酶和klenowdna聚合酶(3'-5'exo-)中的一种或多种，优选klenowdna聚合酶(3'-5'exo-)。在一些实施方案中，所述预混液还包括datp。
[0015]
在一些实施方案中，所述dna连接酶是例如t4dna连接酶或大肠杆菌dna连接酶中的一种或多种，优选t4dna连接酶，所述t4dna连接酶的浓度是20-100u/μl，优选30-60u/μl，包括所述范围内的30u/μl，32u/μl，35u/μl，38u/μl，40u/μl，41u/μl，42u/μl，43u/μl，44u/μl，45u/μl，46u/μl，47u/μl，48u/μl，49u/μl，50u/μl，51u/μl，52u/μl，55u/μl，56u/μl，58u/μl和60u/μl。
[0016]
在一些实施方案中，所述预混液还包含表面活性剂，优选非离子表面活性剂，例如tritonx-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，np10(壬基酚聚氧乙烯醚(10))、np40(乙基苯基聚乙二醇)，吐温20(聚山梨酯20)，吐温80(聚山梨酯80)，peg2000(聚乙二醇2000)，peg8000(聚乙二醇8000)中的一种或多种；优选np40，更优选0.1-10％(体积分数)np40，包括所述范围内的0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.5％、2.8％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％和10％。
[0017]
在一些实施方案中，所述预混液包括tris、mg
2+
、na
+
、k
+
、dntp、atp、dtt、t4多聚核苷酸激酶、大肠杆菌dna聚合酶和t4dna连接酶。
[0018]
在一些实施方案中，所述预混液包括tris、mgcl2、nacl、kcl、dntp、atp、dtt、t4多聚核苷酸激酶、大肠杆菌dna聚合酶和t4dna连接酶，任选地，所述预混液还包括np40。
[0019]
在一些实施方案中，所述预混液包括100-500mmtris、20-100mmmgcl2、50-200mmnacl、20-100mmkcl、0.1-10mmdntp、1-20mmatp、10-50mm dtt、0.1-10u/μlt4多聚核苷酸激酶、0.1-10u/μl大肠杆菌dna聚合酶、20-100u/μlt4dna连接酶和任选地0.1-10％(体积分数)np40。
[0020]
在一些实施方案中，所述预混液包括200-400mmtris、20-80mmmgcl2、50-150mmnacl、20-80mmkcl、0.1-5mmdntp、1-10mmatp、10-30mmdtt、0.1-5u/μlt4多聚核苷酸激酶、1-5u/μl大肠杆菌dna聚合酶、20-80u/μlt4dna连接酶和任选地0.1-5％(体积分数)np40。
[0021]
在一些实施方案中，所述预混液包括200-300mmtris、40-60mmmgcl2、80-100mmnacl、30-60mmkcl、1-3mmdntp、3-6mmatp、20-30mmdtt、0.1-1u/μlt4多聚核苷酸激酶、1-3u/μl大肠杆菌dna聚合酶、40-60u/μlt4dna连接酶和任选地0.5-2％(体积分数)np40。
[0022]
在一些实施方案中，所述预混液包括282mmtris、50mmmgcl2、100mm nacl、40mmkcl、1mmdntp、5mmatp、22mmdtt、0.56u/μlt4多聚核苷酸激酶、1.78u/μl大肠杆菌dna聚合酶、44.4u/μlt4dna连接酶。
[0023]
在一些实施方案中，所述预混液包括250mmtris、50mmmgcl2、100mm nacl、40mmkcl、1mmdntp、5mmatp、20mmdtt、1％np40、0.56u/μlt4多聚核苷酸激酶、1.78u/μl大肠杆菌dna聚合酶、44.4u/μlt4dna连接酶。
[0024]
本技术的第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述的预混液。
[0025]
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括测序接头。
[0026]
在一些实施方案中，所述测序接头包括但不限于本领域已知的illumina平台、mgi平台和iontorrent平台的测序接头。在一些实施方案中，所述接头是y型衔接头或泡状接头或平端接头。在一些实施方案中，所述接头是illumina平台的测序长接头或短接头或华大智造mgi平台的泡状接头或iontorrent平台的平端接头。
[0027]
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括其他辅助检测试剂如纯水。
[0028]
本技术的第三方面提供一种构建dna文库的方法，所述方法包括：
[0029]
(1)提供片段化的dna样本，加入本技术第一方面所述的预混液，在适宜的条件下进行反应，对所述片段化的dna样本进行末端修复；
[0030]
(2)在步骤(1)反应产物中加入测序接头，在适宜的条件下进行接头连接反应，获得连接产物；
[0031]
(3)任选地，纯化或不纯化连接产物；
[0032]
(4)任选地，扩增连接产物或扩增纯化后的连接产物；
[0033]
(5)任选地，纯化扩增产物。
[0034]
在一些实施方案中，所述片段化的dna是采用例如酶切法、化学法和/或机械法对dna样本进行片段化得到的。在一些实施方案中，所述片段化的dna是例如gdna、cfdna或双链cdna。
[0035]
在一些实施方案中，所述末端修复包括末端补平和5’末端磷酸化，即末端修复后的dna片段的两端为平末端，其可以与所述接头进行平端连接，例如iontorrent平台的平端接头。
[0036]
在一些实施方案中，所述末端修复包括末端补平、5’末端磷酸化和3’末端加da，即在末端补平后的dna片段3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，其可以与所述接头通过a-t连接，例如illumina平台的y型接头。
[0037]
在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法进行纯化；优选磁珠法。
[0038]
在一些实施方案中，所述测序接头包括但不限于本领域已知的illumina平台、mgi平台和iontorrent平台的测序接头。在一些实施方案中，所述接头是平端接头、y型接头或泡状接头。
[0039]
在一些实施方案中，所述步骤(1)的反应条件是例如20-30℃反应10-20min，优选25-30℃反应10-15min，更优选25℃反应10min。
[0040]
在一些实施方案中，所述步骤(2)的反应条件是例如20-30℃反应5-20min，优选25-30℃反应5-15min，更优选25-30℃反应5-10min，最优选25℃反应5min。
[0041]
本技术的第四方面提供一种构建dna文库的方法，所述方法包括：
[0042]
(1)提供片段化的dna样本，加入本技术第一方面所述的预混液和接头，在适宜的条件下进行反应，对所述片段化的dna样本进行末端修复和接头连接；
[0043]
(2)任选地，纯化或不纯化连接产物；
[0044]
(3)任选地，扩增连接产物或扩增纯化后的连接产物；
[0045]
(4)任选地，纯化扩增产物。
[0046]
在一些实施方案中，所述片段化的dna是采用例如酶切法、化学法和/或机械法对dna样本进行片段化得到的。在一些实施方案中，所述片段化的dna是例如gdna或cfdna或双链cdna。
[0047]
在一些实施方案中，所述末端修复包括末端补平和5’末端磷酸化，即末端修复后的dna片段的两端为平末端，其可以与所述接头进行平端连接，例如iontorrent平台的平端接头。
[0048]
在一些实施方案中，所述末端修复包括末端补平、5’末端磷酸化和3’末端加da，即在末端补平后的dna片段3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，其可以与所述接头通过a-t连接，例如illumina平台的y型接头。
[0049]
在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法进行纯化；优选磁珠法。
[0050]
在一些实施方案中，所述测序接头包括但不限于本领域已知的illumina平台、mgi平台和ion torrent平台的测序接头。在一些实施方案中，所述接头是平端接头、y型接头或泡状接头。
[0051]
在一些实施方案中，所述步骤(1)的反应条件是例如30-40℃反应10-30min，例如35-40℃反应20-30min，例如35-40℃反应25-30min，例如37℃反应25min。
[0052]
本技术的第五方面提供第一方面所述的预混液或第二方面所述的试剂盒在构建dna文库中的应用。
附图说明
[0053]
图1：常规全流程dna建库和使用本发明预混液1进行dna建库得到的文库产出；
[0054]
图2：常规全流程dna建库和使用本发明预混液1进行dna建库得到的文库峰图；
[0055]
图3：常规全流程dna建库和使用本发明预混液2进行dna建库得到的文库产出；
[0056]
图4：常规全流程dna建库和使用本发明预混液2进行dna建库得到的文库峰图。
[0057]
具体实施方式(实施例)
[0058]
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本技术的技术方案，但下述的实例仅仅是本技术的简易例子，并不代表或限制本技术的权利保护范围，本技术的保护范围以权利要求书为准。
[0059]
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
[0060]
实验试剂
[0061]
末端修复buffer：tris 150mm，mgcl230mm，nacl 100mm、kcl 40mm、dntp 1mm、dtt 20mm，ph8.2；
[0062]
末端修复酶mix：e.coli dna polymerase(大肠杆菌dna聚合酶)16u/μl，t4 pnk(t4多聚核苷酸激酶)5u/μl；
[0063]
接头连接buffer：tris 132mm，mgcl220mm，dtt 2mm、atp 5mm，ph7.8；
[0064]
连接酶：t4 dnaligase(t4 dna连接酶)400u/μl；
[0065]
预混液1：tris 282mm，mgcl250mm、nacl 100mm、kcl 40mm、dntp 1mm、dtt 22mm、atp 5mm、t4 dnaligase 44.4u/μl，e.coli dna polymerase 1.78u/μl，t4 pnk 0.56u/μl；
[0066]
预混液2：tris 250mm、mgcl250mm、nacl 100mm、kcl 40mm、dntp 1mm、dtt 20mm、atp 5mm、1％np40、t4 dna ligase 44.4u/μl，e.coli dna polymerase 1.78u/μl，t4 pnk 0.56u/μl。
[0067]
注：其中t4多聚核苷酸激酶来自vazyme#n102，t4 dna连接酶来自vazyme#n103，其他试剂均购自本领域常规试剂厂商。
[0068]
实施例1
[0069]
以100ng片段化鲑鱼作为样本进行全流程dna建库作为对照，具体步骤如下：
[0070]
(1)末端修复：
[0071]
于灭菌pcr八联管中配制如下反应体系：
[0072][0073][0074]
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心后将反应液收集至管底。将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：
[0075]
温度时间105℃热盖25℃10min4℃hold
[0076]
(2)接头连接
[0077]
按照如下表配制反应体系(在冰上配制)，共100μl，其中dnaadapter按照1：2稀释使用：
[0078][0079]
将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：
[0080]
温度时间105℃热盖25℃5min4℃hold
[0081]
(3)磁珠纯化
[0082]
a.涡旋振荡混匀vahts dna cleanbeads(vazyme#n411)。
[0083]
b.吸取80μl(0.8
×
)vahts dna cleanbeads至100μl连接产物中，盖上盖子，轻轻涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底，拔掉管盖。
[0084]
c.室温孵育5分钟。
[0085]
d.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心移除上清。
[0086]
e.保持ep管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清。
[0087]
f.重复步骤e两次，总计漂洗2次。
[0088]
g.保持ep管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5分钟(时刻注意磁珠状态变化，当磁珠表面不再反光，表明磁珠已经晾干。磁珠晾的过干，表面会出现龟裂，影响回收效率；乙醇没有挥发干净，会影响下游酶促反应)。
[0089]
h.将ep管从磁力架中取出，加入22μl灭菌超纯水进行dna洗脱。盖上盖子，涡旋振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底，拔掉管盖。
[0090]
i.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5分钟)，小心吸取20μl上清至灭菌pcr管中。
[0091]
(4)pcr扩增
[0092]
按照如下表配制反应体系，共50μl：
[0093][0094]
将配制好的反应体系置于pcr仪器中，进行如下反应：
[0095][0096]
扩增结束后用1
×
磁珠(vazyme#n411)纯化，22.5μl ddw洗脱，取20μl，测浓度，计算文库产出如图1所示，对得到的文库产物进行agilent 2100bioanalyzer峰型检测，结果如图2所示。
[0097]
以100ng片段化鲑鱼作为样本进行一管式dna建库(接头单加)作为对照，具体步骤如下：
[0098]
(1)末端修复：
[0099]
于灭菌pcr八联管中配制如下反应体系，共100μl：
[0100]
组分体积样本(100ng/μl)1μl预混液145μlddh2o54μl
[0101]
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心后将反应液收集至管底。将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：
[0102]
温度时间105℃热盖25℃10min4℃hold
[0103]
(2)接头连接
[0104]
按照如下表配制反应体系(在冰上配制)，共100μl，其中dnaadapter按照1：2稀释使用：
[0105][0106]
将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：
[0107]
温度时间105℃热盖25℃5min4℃hold
[0108]
后续磁珠纯化和pcr扩增步骤同前述对照组全流程建库步骤(3)-(4)，扩增结束后使用1
×
磁珠(vazyme#n411)纯化，22.5μl ddw洗脱，取20μl，测浓度，计算文库产出如图1所示，对得到的文库产物进行agilent 2100bioanalyzer峰型检测，结果如图2所示。
[0109]
结果分析
[0110]
如图1-2所示，使用本发明的一管式dna建库预混液能正常建库，文库产出正常，2100峰型正常。使用预混液1，在一定条件下反应，开盖后加入接头，能形成正常的连接产物，说明该方法可行，在一定程度上能提高操作的简便性。
[0111]
实施例2
[0112]
以100ng片段化鲑鱼作为样本进行全流程dna建库作为对照，具体步骤同实施例1对照组全流程建库，得到的文库产出如图3，2100文库峰型如图4。
[0113]
以100ng片段化鲑鱼作为样本进行一管式dna建库(接头单加)作为对照，具体步骤如下：
[0114]
(1)末端修复和接头连接
[0115]
于灭菌pcr八联管中配制如下反应体系，其中dnaadapter按照1：2稀释使用：
[0116][0117]
使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心后将反应液收集至管底。将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：
[0118]
温度时间105℃热盖37℃25min4℃hold
[0119]
后续磁珠纯化和pcr扩增步骤同前述对照组全流程建库步骤(3)-(4)，扩增结束后使用1
×
磁珠(vazyme#n411)纯化，22.5μl ddw洗脱，取20μl，测浓度，计算文库产出如图3所示，对得到的文库产物进行agilent 2100bioanalyzer峰型检测，结果如图4所示。

技术特征：
1.一种dna建库预混液，所述预混液包含：缓冲成分、金属盐、dntp、atp、dtt(二硫苏糖醇)、多聚核苷酸激酶、dna聚合酶和dna连接酶。2.根据权利要求1所述的预混液，所述多聚核苷酸激酶是t4多聚核苷酸激酶，优选0.1-10u/μlt4多聚核苷酸激酶，更优选0.1-5u/μlt4多聚核苷酸激酶。3.根据权利要求1所述的预混液，所述dna连接酶是选自t4 dna连接酶或大肠杆菌dna连接酶中的一种或多种，优选t4 dna连接酶，更优选20-100u/μlt4 dna连接酶，最优选30-60u/μl t4 dna连接酶。4.根据权利要求1所述的预混液，所述dna聚合酶包括用于末端补平的dna聚合酶，优选自t4 dna聚合酶、t3 dna聚合酶、t7 dna聚合酶和大肠杆菌dna聚合酶中的一种或多种，更优选大肠杆菌dna聚合酶，更优选0.1-10u/μl大肠杆菌dna聚合酶，最优选0.1-5u/μl大肠杆菌dna聚合酶。5.根据权利要求1所述的预混液，所述缓冲物质包括tris，优选100-500mm tris；所述金属盐包括mg
2+
盐、k
+
盐和na
+
盐，优选mgcl2、kcl和nacl，更优选20-100mm mgcl2、20-100mm kcl和50-200mm nacl；所述dntp的浓度是0.1mm-10mm，优选1-5mm；所述atp的浓度是1-20mm，优选1-10mm；所述dtt的浓度是10-50mm，优选10-30mm。6.根据权利要求1所述的预混液，所述预混液还包括表面活性剂，优选非离子表面活性剂，更优选np40，最优选0.1-10％(体积分数)np40。7.根据权利要求1所述的预混液，所述预混液包括tris、mgcl2、nacl、kcl、dntp、atp、dtt、t4多聚核苷酸激酶、大肠杆菌dna聚合酶和t4 dna连接酶，任选地，所述预混液还包括np40；优选地，所述预混液包括100-500mm tris、20-100mm mgcl2、50-200mm nacl、20-100mm kcl、0.1-10mm dntp、1-20mmatp、10-50mm dtt、0.1-10u/μlt4多聚核苷酸激酶、0.1-10u/μl大肠杆菌dna聚合酶、20-100u/μl t4 dna连接酶和任选地0.1-10％(体积分数)np40；优选地，所述预混液包括200-400mm tris、20-80mm mgcl2、50-150mm nacl、20-80mm kcl、0.1-5mm dntp、1-10mmatp、10-30mm dtt、0.1-5u/μlt4多聚核苷酸激酶、1-5u/μl大肠杆菌dna聚合酶、20-80u/μl t4 dna连接酶和任选地0.1-5％(体积分数)np40。优选地，所述预混液包括200-300mm tris、40-60mm mgcl2、80-100mm nacl、30-60mm kcl、1-3mm dntp、3-6mmatp、20-30mm dtt、0.1-1u/μl t4多聚核苷酸激酶、1-3u/μl大肠杆菌dna聚合酶、40-60u/μl t4 dna连接酶和任选地0.5-2％(体积分数)np40。8.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-7任一项所述的预混液。9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包含测序接头。10.权利要求1-7任一项所述的预混液或权利要求8-9任一项所述的试剂盒在构建dna文库中的应用。11.一种构建dna文库的方法，所述方法包括：(1)提供片段化的dna样本，加入权利要求1-7任一项所述的预混液，在适宜的条件下进行反应，对所述片段化的dna样本进行末端修复；(2)在步骤(1)反应产物中加入测序接头，在适宜的条件下进行接头连接反应，获得连
接产物；(3)任选地，纯化或不纯化连接产物；(4)任选地，扩增连接产物或扩增纯化后的连接产物；(5)任选地，纯化扩增产物。12.根据权利要求11所述的方法，所述末端修复包括末端补平和5’末端磷酸化。13.根据权利要求12所述的方法，所述接头是平端接头，优选iontorrent平台的平端接头。14.根据权利要求11所述的方法，所述步骤(1)的反应条件是例如20-30℃反应10-20min，优选25-30℃反应10-15min，更优选25℃反应10min；所述步骤(2)的反应条件是例如20-30℃反应5-20min，优选25-30℃反应5-15min，更优选25-30℃反应5-10min，最优选25℃反应5min。15.一种构建dna文库的方法，所述方法包括：(1)提供片段化的dna样本，加入权利要求1-7任一项所述的预混液和接头，在适宜的条件下进行反应，对所述片段化的dna样本进行末端修复和接头连接；(2)任选地，纯化或不纯化连接产物；(3)任选地，扩增连接产物或扩增纯化后的连接产物；(4)任选地，纯化扩增产物。16.根据权利要求15所述的方法，所述末端修复包括末端补平和5’末端磷酸化。17.根据权利要求16所述的方法，所述接头是平端接头，优选ion torrent平台的平端接头。18.根据权利要求15所述的方法，所述步骤(1)的反应条件是例如30-40℃反应10-30min，例如35-40℃反应20-30min，例如35-40℃反应25-30min，例如37℃反应25min。

技术总结
本申请提供一种DNA建库预混液，属于生物技术领域。本申请提供的预混液将末端修复和接头连接所需的反应buffer和酶mix提前预混，只需要提供样本和接头即可实现一管式建库。相对于传统的全流程DNA建库方法，使用本申请的预混液进行DNA文库构建不仅更加方便快捷，还减少了在操作过程中开盖，能够有效降低污染和加样错误的风险。样错误的风险。


技术研发人员：曹林 张力军 甘世虎 江明扬 李亚丽
受保护的技术使用者：南京诺唯赞生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.12.23
技术公布日：2023/7/19