用于眼部适应症的载体化TNF-α拮抗剂的制作方法

用于眼部适应症的载体化tnf-α
拮抗剂
1.1.引言
2.描述了用于将与肿瘤坏死因子α(tnf-α)结合的完全人翻译后修饰的(huptm)治疗性肿瘤坏死因子受体(tnfr)融合蛋白递送至被诊断患有非感染性葡萄膜炎的人受试者的组合物和方法。
2.

背景技术：

3.治疗性抗tnfα fc融合蛋白已被证明可有效治疗多种疾病和疾患。然而，由于这些剂仅在短时间内有效，因此通常需要长时间反复注射，从而给患者造成相当大的治疗负担。
4.葡萄膜炎包括一组以葡萄膜的炎症为特征的异质性疾病。葡萄膜炎通常可根据炎症的病因分类为感染性葡萄膜炎或非感染性葡萄膜炎(自身免疫性病症)，这可能与全身性疾病有关或无关。另外，葡萄膜炎可以在解剖学上分类为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎或全葡萄膜炎，并且它们可能具有急性、慢性或复发性病程。临床表现多种多样，症状可包括视力模糊、畏光、眼痛和明显的视力受损(valenzuela等人，front pharmacol.2020；11：655)。
5.非感染性葡萄膜炎是一种以葡萄膜(虹膜、睫状体和脉络膜)的炎症为特征的威胁视力的严重眼内炎性疾患。非感染性葡萄膜炎被认为是由对眼部抗原的免疫介导反应引起的，并且是发达国家工作年龄人口中不可逆转失明的主要原因。葡萄膜炎治疗的目标是控制炎症、防止复发和保护视力，以及尽量减少药物的不利作用。目前，非感染性葡萄膜炎的护理标准包括施用皮质类固醇作为一线剂，但在一些情况下需要更积极的疗法。这包括合成免疫抑制剂，诸如抗代谢物(甲氨蝶呤、霉酚酸酯和硫唑嘌呤)、钙调磷酸酶抑制剂(环孢菌素、他克莫司)和烷化剂(环磷酰胺、苯丁酸氮芥)。在对皮质类固醇和常规免疫抑制治疗变得不耐受或难治的那些患者中，基于靶向疾病发病机制中涉及的相关免疫学途径，生物剂已成为儿童和成人葡萄膜炎的有效疗法。目前的免疫调节疗法包括用mab(诸如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)和聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab-pegol))或用tnf受体融合蛋白依那西普实现对tnfα的抑制。在这方面，抗tnf剂(英夫利昔单抗和阿达木单抗)已在有利的结果方面显示出最强的结果。阿达木单抗已被批准每隔一周通过皮下施用来治疗非感染性葡萄膜炎。当常规免疫抑制治疗和/或抗tnf-α治疗失败时，建议使用其他生物剂。
6.eys606编码将tnfαp55受体1(tnfr1)连接至igg1免疫球蛋白分子的fc部分的重组融合蛋白。目前正在研究eys606作为非病毒基因疗法用于治疗非感染性后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎或全葡萄膜炎。eys606通过电转移在患者的睫状肌中施用。
7.依那西普是一种二聚体融合蛋白，由与igg1免疫球蛋白分子的fc部分融合的人p75 tnfα受体(tnfr2)的两个细胞外结构域(tnfr：fc)组成，并且可用于治疗多种自身免疫炎性疾病，包括类风湿性关节炎、克罗恩病和银屑病性关节炎。依那西普以每周一次50mg或每周两次25mg的剂量皮下施用(valenzuela等人，front pharmacol.2020；11：655)。
8.需要更有效的治疗来减轻患有非感染性葡萄膜炎的患者的治疗负担。玻璃体内药
物已成为葡萄膜炎患者的一种有前途的药物施用模式，因为它们向靶组织提供大量药物，从而消除全身毒性的风险。减少或消除定期眼部施用的需要将减轻患者负担并改善疗法。
3.

技术实现要素：

9.通过基因疗法递送的生物抑制剂与注射或输注的治疗性生物抑制剂相比具有若干优点，所述治疗性生物抑制剂会随时间消散，从而产生峰值和谷值水平。与反复注射生物抑制剂相反，转基因产物生物抑制剂的持续表达允许在作用部位存在更一致水平的生物抑制剂，并且由于需要进行更少的注射，对于患者而言风险更低且更方便。此外，由于翻译期间和翻译之后存在不同的微环境，从转基因表达的生物抑制剂的翻译后修饰方式与直接注射的方式不同。不受任何特定理论的束缚，这使得生物抑制剂具有不同的扩散、生物活性、分布、亲和力、药代动力学和免疫原性特性，因此与直接注射的生物制剂相比，递送至作用部位的抗体是“生物改良物(biobetter)”。全身施用(诸如从肝脏中的贮库(depot)表达)或另外将治疗剂局部递送至眼组织可以减少受试者暴露于治疗剂并降低潜在副作用的风险。因此，本文提供了用于抗tnfα基因疗法、特别是重组aav基因疗法的组合物和方法，它们被设计成靶向眼睛并生成用于表达抗tnfα fc融合蛋白(tnfr：fc)、特别是依那西普(tnfr2：fc)和eys606(tnfr1：fc)的转基因的贮库，这使得在施用raav组合物的20天、30天、40天、50天、60天或90天内眼睛中产生治疗有效或预防水平的生物抑制剂。
10.描述了用于将抗tnfα fc融合蛋白全身递送至被诊断患有非感染性葡萄膜炎或指示用治疗性抗tnfα fc融合蛋白治疗的其他疾患的患者(人受试者)的组合物和方法。递送可有利地经由基因疗法来完成，例如通过将编码治疗性抗tnfα fc融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体施用于被诊断患有指示用治疗性抗tnfα fc融合蛋白治疗的疾患的受试者，以在患者的眼睛中(或在另选的实施方案中，在肝脏和/或肌肉中)产生将huptm抗tnfα fc融合蛋白(例如，人糖基化转基因产物)持续供应至受试者的适当眼组织(其中抗tnfα fc融合蛋白发挥其治疗或预防作用)(包括经由循环)的永久贮库。
11.用于递送转基因的重组载体包括非复制型重组腺相关病毒载体(“raav”)。在实施方案中，aav类型对眼睛具有嗜性，例如aav的aav8亚型、aav3b亚型、aav2.7m8或aavrh73亚型。然而，可使用其他病毒载体(包括但不限于慢病毒载体、痘苗病毒载体)或非病毒表达载体(称为“裸dna”构建体)。转基因的表达可以由组成型或组织特异性表达控制元件、特别是作为眼组织特异性控制元件的元件(例如，表1或另选地表1a的一个或多个元件)控制。构建体还可包含指导表达的抗tnfα fc融合蛋白的分泌的信号或前导肽，例如来自表2或表3或表4的肽。
12.在某些实施方案中，由转基因编码的huptm抗tnfα fc融合蛋白可以包括但不限于与tnfα结合的tnfr：fc融合蛋白，特别是依那西普(或其任何生物类似物版本)或eys606，参见例如图2a和图2b。
13.设计用于治疗性抗tnfα fc融合蛋白的基因疗法构建体，使得与fc部分融合的可溶性tnfr(tnfr1或tnfr2)表达为二聚体融合蛋白(seq id no：10和12)。
14.另外，从转基因体内表达的抗tnfα fc融合蛋白不太可能含有与通过重组技术(诸如蛋白质聚集和蛋白质氧化)产生的生物制剂相关的降解产物。由于蛋白质浓度高、与制造设备和容器的表面相互作用以及利用某些缓冲系统的纯化，聚集是与蛋白质生产和储存相
关的问题。这些促进聚集的条件在基因疗法中的转基因表达中不存在。氧化(诸如甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸氧化)也与蛋白质生产和储存相关，并且是由应激细胞培养条件、金属和空气接触以及缓冲液和赋形剂中的杂质引起的。从转基因体内表达的蛋白质也可在应激条件下氧化。然而，人和许多其他生物体具有抗氧化防御系统，该抗氧化防御系统不仅可以减少氧化应激，有时还可以修复和/或逆转氧化。因此，体内产生的蛋白质不太可能呈氧化形式。聚集和氧化都可能影响效力、药代动力学(清除率)和免疫原性。
15.在人受试者的眼中产生huptm抗tnfα fc融合蛋白应产生用于经由基因疗法来完成的疾病治疗的“生物改良物”分子，例如通过将编码huptm抗tnfα融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体施用于被诊断患有该fc融合蛋白的疾病适应症的患者(人受试者)，以在受试者体内产生持续供应由受试者的转导细胞产生的人糖基化的硫酸化转基因产物的永久贮库。huptm抗tnfα fc融合蛋白的cdna构建体应包括确保由转导的人细胞进行适当的共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。
16.作为基因疗法的替代或附加治疗，huptm抗tnfα fc融合蛋白可以通过重组dna技术在人细胞系中产生，并且可以将糖蛋白施用于患者。
17.本文提供的方法涵盖涉及将huptm抗tnfα融合蛋白全身递送至患者并伴随施用其他可用治疗的联合疗法。附加治疗可在基因疗法治疗之前、与其同时或之后施用。此类附加治疗可以包括但不限于与治疗性抗tnfα fc融合蛋白或抗tnfα mab的共同疗法。
18.还提供了制造病毒载体、特别是基于aav的病毒载体的方法。在具体的实施方案中，提供了产生重组aav的方法，所述方法包括培养含有人工基因组的宿主细胞，所述人工基因组包含：侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码治疗性抗体的转基因，所述转基因可操作地连接至将控制所述转基因在人细胞中表达的表达控制元件；缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和衣壳蛋白，所述aav rep和衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述rep和cap蛋白的表达控制元件；足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组；以及从所述细胞培养物中回收包裹所述人工基因组的重组aav。
19.提供了包含raav载体的组合物，所述raav载体包含优化的表达盒，所述表达盒含有光感受器特异性启动子或其他合适的启动子，包括cag启动子、best1/grk启动子(或表1或表1a中提供的其他启动子)，以及表达转基因的密码子优化和cpg耗尽的转基因，例如抗tnfα治疗性fc融合蛋白(包括依那西普和eys606)的可溶性tnfr(tnfr1或tnfr2)和fc结构域(包括铰链，ch2和ch3结构域)。还提供了施用和制造的方法。具体地，提供了包含raav的组合物和方法，所述raav包含构建体cag.依那西普或u1a.vh4i.依那西普.scaav(参见表7)。
20.适合施用于人受试者的药物组合物包含重组载体在配制缓冲液中的悬浮液，所述配制缓冲液包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂。
21.3.1例示性实施方案
22.1.一种用于治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含腺相关病毒(aav)载体，所述aav载体具有：
23.(a)对眼组织细胞具有嗜性的病毒衣壳；以及
24.(b)包含侧接aav内部串联重复序列(itr)的表达盒的人工基因组，其中所述表达
盒包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在人眼细胞中表达的一个或多个调控序列；
25.其中所述aav载体被配制用于视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用于所述人受试者。
26.2.如段落1所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接。
27.3.如段落1或2所述的药物组合物，其中所述病毒衣壳与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)、血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。
28.4.如段落1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述aav衣壳是aav8、aav3b、aav2.7m8或aavrh73。
29.5.如段落1至4所述的药物组合物，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
30.6.如段落1至5所述的药物组合物，其中所述调控序列包括来自表1或表1b的调控序列。
31.7.如段落5所述的药物组合物，其中所述调控序列是人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)、cb启动子(seq id no：159)、cb长启动子(seq id no：160)或bestl/grk启动子(seq id no：161)。
32.8.如段落1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因编码在所述抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述人眼细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。
33.9.如段落8所述的药物组合物，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)或者来自表2、表3或表4的信号序列。
34.10.如段落1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因从n端至c端具有以下结构：信号序列-可溶性tnfr细胞外结构域-铰链区-fc结构域-polya。
35.11.如段落10所述的组合物，其中所述转基因还包含在所述可溶性tnfr细胞外结构域的c端的seq id no：8的凝血酶切割位点。
36.12.如段落1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白表达为二聚体融合蛋白。
37.13.如段落1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是依那西普或eys606。
38.14.如段落1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因包含seq id no：15-18的核苷酸序列。
39.15.如段落1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白具有
seq id no：10或12的氨基酸序列。
40.16.如段落1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是高糖基化突变体，或者其中所述抗tnf α fc融合蛋白的所述fc多肽是糖基化的或无糖基化的。
41.17.如段落1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述fc结构域是igg1-fc结构域。
42.18.如段落1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述人工基因组是自身互补的。
43.19.如段落1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述人工基因组是构建体cag.依那西普(seq id no：15或16)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17或18)。
44.20.一种包含腺相关病毒(aav)载体的组合物，所述aav载体具有：
45.a.病毒aav衣壳，所述病毒aav衣壳任选地与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)、血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。
46.b.包含侧接aav反向末端重复序列(itr)的表达盒的人工基因组，其中所述表达盒包含编码抗tnf-α fc融合蛋白的转基因，所述tnf-α fc融合蛋白包含人可溶性tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)细胞外结构域，所述细胞外结构域通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；
47.其中所述转基因编码在所述抗tnf α fc融合蛋白的n端的指导所述抗tnf α fc融合物在眼组织细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。
48.21.如段落20所述的组合物，其中所述转基因还包含在所述可溶性人tnfr细胞外结构域的c端的seq id no：8的凝血酶切割位点。
49.22.如段落20或21中任一项所述的组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白具有seq id no：10或12的氨基酸序列。
50.23.如段落20至22所述的组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是依那西普或eys606。
51.24.如段落20至23所述的组合物，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
52.25.如段落20至24所述的组合物，其中所述转基因包含seq id no：13或14的核苷酸序列。
53.26.如段落20至25所述的组合物，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)或者来自表2、表3或表4的信号序列。
54.27.如段落20至26中任一项所述的组合物，其中所述人工基因组是自身互补的。
55.28.如段落20至27中任一项所述的组合物，其中所述人工基因组是构建体cag.依
那西普(seq id no：15)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17)。
56.治疗方法
57.29.一种治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用治疗有效量的包含重组aav的组合物，所述重组aav包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列。
58.30.一种治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括：向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列，使得形成释放人翻译后修饰(huptm)形式的抗tnfα fc融合蛋白的贮库。
59.31.如段落29和30所述的方法，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
60.32.如段落29至31所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含与igg fc结构域共价连接的人可溶性tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)细胞外结构域。
61.33.如段落29至32所述的方法，其中所述转基因是依那西普或eys606。
62.34.如段落29至33所述的方法，其中所述转基因具有seq id no：15-17的核苷酸序列。
63.35.如段落29至34所述的方法，其中所述重组核苷酸表达载体包装在具有病毒衣壳的raav中，其中所述病毒衣壳与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。
64.36.如段落29、31至35中任一项所述的方法，其中所述aav衣壳是aav8、aav2.7m8、aav3b或aavrh73。
65.37.如段落29至36中任一项所述的方法，其中所述调控序列包括来自表1或表1a的调控序列。
66.38.如段落37所述的方法，其中所述调控序列是人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)、cb启动子(seq id no：159)、cb长启动子(seq id no：160)或best1/grk启动子(seq id no：161)。
67.39.如段落29至38中任一项所述的方法，其中所述转基因编码在所述抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述人眼组织细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。
68.40.如段落39所述的方法，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)或者来自表2、表3或表4的信号序列。
69.41.如段落25至40中任一项所述的方法，其中所述转基因具有以下结构：信号序
列-9人可溶性tnfr细胞外结构域(1型或2型)-铰链区-fc结构域-polya。
70.42.如段落41所述的方法，其中所述转基因还包含在所述人可溶性tnfr细胞外结构域的c端的具有seq id no：8的凝血酶切割位点。
71.43.如段落29至42中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是高糖基化突变体，或者其中所述抗tnfα fc融合蛋白的所述fc结构域是糖基化的或无糖基化的。
72.44.如段落29至43中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白含有α2，6-唾液酸化聚糖。
73.45.如段落29至44中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是糖基化的，但不含有可检测的neugc和/或α-gal。
74.46.如段落29至45中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白含有酪氨酸硫酸化。
75.47.如段落29至46中任一项所述的方法，其中所述huptm形式的所述抗tnfα fc融合蛋白的产生通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养的人眼细胞并表达所述抗tnfα fc融合蛋白来证实。
76.48.如段落29或47中所述的方法，其中所述治疗有效量被确定为足以使最佳矫正视力(bcva)提高＞＝2个etdrs行或增加logmar、根据sun分类降低前房和后房的炎性活性以及/或者降低玻璃体混浊的等级。
77.49.如段落29至48中任一项所述的方法，其中所述raav是自身互补的。
78.50.如段落29至49中任一项所述的方法，其中所述转基因在构建体cag.依那西普(seq id no：15或16)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17或18)内。
79.制造方法
80.51.一种产生重组aav的方法，所述方法包括：
81.(a)培养宿主细胞，所述宿主细胞含有：
82.(i)人工基因组，所述人工基因组包含侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；
83.(ii)缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和aav衣壳蛋白，所述aav rep和aav衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和aav衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述aav rep和aav衣壳蛋白的表达控制元件，其中所述衣壳具有眼组织嗜性；
84.(iii)足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组；以及
85.(b)从所述细胞培养物中回收包裹所述人工基因组的重组aav。
86.52.如段落51所述的方法，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
87.53.如段落51或52所述的方法，其中所述转基因编码依那西普或eys606，其中所述aav衣壳蛋白是根据实施方案1所述的raav衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白来自aav血清型1
(aav1)、血清型2(aav2)、血清型2.7m8、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)、血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)中的至少一种aav血清型。
88.54.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有：
89.a.人工基因组，所述人工基因组包含侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码抗tnfα融合蛋白的转基因，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；
90.b.缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和aav衣壳蛋白，所述aav rep和aav衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和aav衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述aav rep和aav衣壳蛋白的表达控制元件，其中所述衣壳具有眼组织嗜性；
91.c.足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组。
92.55.如段落54所述的宿主细胞，其中所述转基因编码依那西普或eys606。
93.56.如段落53或54所述的宿主细胞，其中所述aav衣壳蛋白是aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)、血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)。
4.附图说明
94.图1.含有由表达元件控制且侧接aav itr的编码依那西普的表达盒的raav载体基因组构建体的示意图。
95.图2a和图2b.抗tnfα fc融合蛋白依那西普(a)和eys606(b)的氨基酸序列。糖基化位点加粗或加下划线。谷氨酰胺糖基化位点、天冬酰胺(n)糖基化位点、规范和非共有天冬酰胺(n)糖基化位点以及酪氨酸-o-硫酸化位点(斜体)如文字说明中所示。fc结构域(ch2和ch3结构域)以灰色突出显示。铰链区以斜体指示。凝血酶切割位点加下划线。
96.图3.具有眼组织嗜性的各种衣壳的群集多序列比对。可以通过从其他比对的aav衣壳的相应位置“招募”氨基酸残基来对aav8衣壳进行氨基酸取代(在底部行中以粗体显示)。以灰色显示的序列＝高变区。aav衣壳的氨基酸序列被指定如图3所示的序列id号。
97.图4.igg1(seq id no：47)、igg2(seq id no：48)和igg4(seq id no：49)的恒定重链区(ch2和ch3)的群集多序列比对。铰链区(从重链的残基219至残基230)以斜体显示。氨基酸的编号是eu格式。
98.图5a和b.a.载体化阿达木单抗igg和fab与tnfα跨模型物种(小鼠、大鼠和人)的结合。阴性对照包括来自未转染细胞的上清液。载体化拉那利尤单抗(1anadelumab)(paav.cag.拉那利尤单抗.igg)用作非特异性抗体对照。数据表示为平均值
±
sem。b.载体化阿达木单抗igg和依那西普与tnfα跨模型物种(小鼠、大鼠和人)的结合。阴性对照包括来自未转染细胞的上清液。载体化拉那利尤单抗(1anadelumab)(paav.cag.拉那利尤单抗.igg)用作非特异性抗体对照。数据表示为平均值
±
sem。
5.具体实施方式
99.描述了用于将与tnfα结合的完全人翻译后修饰的(huptm)治疗性抗tnfα fc融合蛋白全身递送至被诊断患有非感染性葡萄膜炎的人受试者的组合物和方法。递送可有利地经由基因疗法来完成，例如通过将编码治疗性抗tnfα fc融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体(或任一种的高糖基化衍生物)施用于被诊断患有非感染性葡萄膜炎的患者(人受试者)，以在患者的组合或器官、特别是眼组织(诸如视网膜)中产生将huptm抗tnfα fc融合蛋白(例如，人糖基化转基因产物)持续供应至抗tnfα fc融合蛋白发挥其治疗作用的部位的永久贮库。
100.在某些实施方案中，由转基因编码的huptm抗tnfα fc融合蛋白是但不限于结合tnfα的tnfr：fc融合蛋白，特别是依那西普或eys606(分别参见图2a和图2b的tnfr-fc融合蛋白依那西普和eys606的氨基酸序列)。在实施方案中，当表达时，tnfr fc融合蛋白是二聚体的。
101.由转基因编码的huptm抗tnfα fc融合蛋白可以包括但不限于与tnfα结合的治疗性抗tnfα tnfr1：fc融合物，包括但不限于eys606。上述氨基酸序列在下表6中提供。tnfr1结构域具有seq id no：1的氨基酸序列，fc结构域具有seq id no：6(或7，无铰链)的氨基酸序列，并且eys606蛋白具有seq id no：12的氨基酸序列。由转基因编码的huptm抗tnfα tnfr1：fc融合物可以包括但不限于被工程化以含有在fc结构域上的另外的糖基化位点的二聚体融合蛋白。
102.由转基因编码的huptm抗tnfα fc融合蛋白可以包括但不限于与tnfα结合的治疗性抗tnfα tnfr2：fc融合物，包括但不限于依那西普。上述氨基酸序列在下表6中提供。tnfr2结构域具有seq id no：2的氨基酸序列，fc结构域具有seq id no：3(seq id no 4，无铰链区)的氨基酸序列，依那西普具有seq id no：10(seq id no：11，包括前导序列)以及seq id no：13-18中的一个的转基因核酸序列)的氨基酸序列。由转基因编码的huptm抗tnfα tnfr2：fc融合物可以包括但不限于被工程化以含有在fc结构域上的另外的糖基化位点的二聚体融合蛋白。
103.本文提供的组合物和方法将抗tnfα fc融合蛋白、特别是依那西普和eys606以在眼组织中(例如，在玻璃状液或水状液中)或在血清中在治疗上或在预防上有效治疗或改善非感染性葡萄膜炎或可用抗tnfα fc融合蛋白治疗的其他适应症的症状的水平从病毒基因组的贮库全身性递送至例如受试者的眼睛或肝脏/肌肉中。本文鉴定了用于将编码治疗性抗tnfα fc融合蛋白的转基因递送至人受试者的细胞(在实施方案中包括一种或多种眼组织细胞)的病毒载体，以及可操作地连接至编码抗tnfα fc融合蛋白的核酸序列的调控元件，所述调控元件促进抗体在细胞中(在实施方案中在眼组织细胞中)表达。此类调控元件
(包括眼组织特异性调控元件)在本文的表1和表1a中提供。因此，此类病毒载体可以适当的剂量递送至人受试者，使得在施用后至少20、30、40、50或60天，抗tnfα fc融合蛋白以治疗有效水平存在于所述人受试者的血浆或眼组织中。在实施方案中，确定抗tnfα fc融合蛋白的治疗有效水平(在人试验、动物模型(诸如本文所述的那些等)中)以使最佳矫正视力(bcva)提高＞＝2个etdrs行或增加logmar、根据sun分类降低前房和后房的炎性活性以及/或者降低玻璃体混浊的等级。
104.用于递送转基因的重组载体包括非复制型重组腺相关病毒载体(“raav”)。出于多种原因，raav是特别有吸引力的载体-它们可以转导非复制型细胞，因此可以用于将转基因递送至细胞分裂水平较低的组织，诸如视网膜；它们可以被修饰以优先靶向选择的特定器官；并且有数百种衣壳血清型可供选择以获得所需的组织特异性，和/或避免被预先存在的患者针对一些aav的抗体中和。此类raav包括但不限于基于aav的载体，所述基于aav的载体包含来自aav1、aav2、aav2.7m8、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aav9、aav9e、aavrh10、aavrh20、aavrh39、aavhu.37、aavrh73、aavrh74、aav.hu51、aav.hu21、aav.hu12或aav.hu26中的一种或多种的衣壳组分。在某些实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自aav2.7m8、aav8、aav9、aav10或aavrh10血清型中的一种或多种的衣壳。
105.然而，可使用其他病毒载体(包括但不限于慢病毒载体、痘苗病毒载体)或非病毒表达载体(称为“裸dna”构建体)。转基因的表达可以由组成型或组织特异性表达控制元件控制。
106.设计用于治疗性抗tnfα fc融合蛋白的基因疗法构建体，使得共价连接的tnfr和fc部分表达为二聚体融合蛋白。例如，tnfr：fc融合物可包括连接至重链之间的二硫键形成的铰链区(例如，seq id no：5或9)的全部或一部分。优选地，tnfr1：fc是eys606的生物改良物或生物类似物，或更优选地，tnfr：fc是eys606。优选地，tnfr2：fc是依那西普的生物改良物或生物类似物，或更优选地，tnfr：fc是依那西普。
107.在某些实施方案中，本文公开的核酸(例如，多核苷酸)和核酸序列可被密码子优化，例如经由本领域技术人员已知的任何密码子优化技术(参见例如quax等人，2015，mol cell 59：149-161的综述)，并且还可被优化以减少cpg二聚体。可被密码子优化的治疗性抗tnfα fc融合蛋白的核酸序列在表7中公开。抗tnfα fc融合蛋白需要n端前导序列以确保适当的翻译后加工和分泌。本文公开了用于在人细胞中表达治疗性抗tnfα fc融合蛋白的有用前导序列。示例性重组表达构建体在图1中示出。
108.产生huptm抗tnfα fc融合蛋白应产生用于经由基因疗法来完成的疾病治疗的“生物改良物”分子，例如通过将编码huptm抗tnfα fc融合蛋白(诸如依那西普或eys606)的病毒载体或其他dna表达构建体施用于被诊断患有该抗tnfα fc融合蛋白的疾病适应症的患者(人受试者)，以在受试者体内产生持续供应由受试者的转导细胞产生的人糖基化的硫酸化转基因产物的永久贮库。huptm抗tnfα fc融合蛋白的cdna构建体应包括确保转导的人细胞进行适当的共翻译和翻译后加工(糖基化和蛋白质硫酸化)的信号肽。
109.适合施用于人受试者的药物组合物包含重组载体在配制缓冲液中的悬浮液，所述配制缓冲液包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂。这种配制缓冲液可以包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一种或多种。
110.作为基因疗法的替代或附加治疗，全长huptm抗tnfα fc融合蛋白可以通过重组
dna技术在人细胞系中产生，并且可以将糖蛋白施用于患者。可以用于这种重组糖蛋白产生的人细胞系包括但不限于人胚肾293细胞(hek293)、纤维肉瘤ht-1080、hkb-11、cap、huh-7和视网膜细胞系、per.c6或rpe等(例如参见dumont等人，2015，crit.rev.biotechnol.36(6)：1110-1122，该文献针对可以用于重组产生huptm生物制品的人细胞系的综述以其全文通过引用并入)。为了确保完全糖基化、特别是唾液酸化和酪氨酸硫酸化，可以通过工程化宿主细胞以共表达α-2，6-唾液酸转移酶(或α-2，3-和α-2，6-唾液酸转移酶两者)和/或负责人细胞中酪氨酸-o-硫酸化的tpst-1和tpst-2酶来增强用于生产的细胞系。
111.在基因疗法或蛋白疗法方法中产生的每个分子都是完全糖基化和硫酸化的并不是必需的。而是，产生的糖蛋白群体应具有足够的糖基化(包括2，6-唾液酸化)和硫酸化以证明功效。本发明的基因疗法治疗的目的是减缓或阻止疾病的进展。
112.本发明的方法涵盖涉及将huptm抗tnfα fc融合蛋白递送至患者并伴随施用其他可用治疗的联合疗法。附加治疗可在基因疗法治疗之前、与其同时或之后施用。此类附加治疗可以包括但不限于与治疗性抗tnfα fc融合蛋白的共同疗法。
113.还提供了制造病毒载体、特别是基于aav的病毒载体的方法。在具体的实施方案中，提供了产生重组aav的方法，所述方法包括培养含有人工基因组的宿主，所述人工基因组包含：侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码治疗性抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至将控制所述转基因在人细胞中表达的表达控制元件；缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和衣壳蛋白，所述aav rep和衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述rep和cap蛋白的表达控制元件；足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组；以及从所述细胞培养物中回收包裹所述人工基因组的重组aav。
114.5.1定义
115.短语“抗tnfα fc融合蛋白”意指包含tnfα受体(包括tnf-α受体p55或p75)的可溶性细胞外结构域或部分的多肽，该可溶性细胞外结构域或部分例如通过肽键与免疫球蛋白、特别是igg的fc结构域共价连接。
116.术语“调控元件”或“核酸调控元件”是控制相邻基因的转录的非编码核酸序列。顺式调控元件通常通过与转录因子结合来调节基因转录。这包括包含多于一个如本文所述的增强子或启动子元件的“复合核酸调控元件”。
117.术语“表达盒”或“核酸表达盒”是指包括一个或多个转录控制元件的核酸分子，所述转录控制元件包括但不限于启动子、增强子和/或调控元件、内含子和聚腺苷酸化序列。增强子和启动子通常在一种或多种所需细胞类型、组织或器官中起指导(反式)基因表达的作用。
118.术语“可操作地连接”和“可操作地连接至”是指核酸序列被连接并且通常是连续的或基本上连续的，并且在需要时接合两个蛋白质编码区、是连续的并且在阅读框中。然而，由于增强子通常在与启动子相隔几千碥基时发挥作用，并且内含子序列可能具有可变长度，因此一些多核苷酸元件可被可操作地连接并且仍然具有功能，同时不与下游启动子和转基因直接邻接。
119.术语“aav”或“腺相关病毒”是指细小病毒科(parvoviridae)病毒属中的依赖性细
小病毒(dependoparvovirus)。aav可以是源自天然存在的“野生型”病毒的aav、源自包装到包含由天然存在的cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的raav基因组和/或源自包装到包含由非天然存在的衣壳cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的raav基因组的aav。后者的实例包括具有衣壳蛋白的raav，所述衣壳蛋白包含肽插入天然存在的衣壳的氨基酸序列中或修饰天然存在的衣壳的氨基酸序列。
120.术语“raav”是指“重组aav”。在一些实施方案中，重组aav具有其中部分或全部rep和cap基因已被异源序列替代的aav基因组。
121.术语“rep-cap辅助质粒”是指提供病毒rep和cap基因功能并帮助由缺乏功能性rep和/或cap基因序列的raav基因组产生aav的质粒。
122.术语“cap基因”是指编码形成或帮助形成病毒衣壳的衣壳蛋白的核酸序列。对于aav，衣壳蛋白可以是vp1、vp2或vp3。
123.术语“rep基因”指编码病毒的复制和产生所需的非结构蛋白的核酸序列。
124.术语“核酸”和“核苷酸序列”包括dna分子(例如，cdna或基因组dna)、rna分子(例如，mrna)、dna和rna分子的组合或杂合dna/rna分子以及dna或rna分子的类似物。此类类似物可使用例如核苷酸类似物产生，所述核苷酸类似物包括但不限于肌苷或三苯甲基化碱基。此类类似物还可包含含有经修饰的主链的dna或rna分子，所述经修饰的主链赋予分子有益的属性，如例如核酸酶抗性或增加的穿过细胞膜的能力。核酸或核苷酸序列可以是单链的、双链的，可含有单链和双链部分，并且可含有三链部分，但优选地是双链dna。
125.术语“受试者”、“宿主”和“患者”可互换使用。如本文所用，受试者优选地是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)，最优选人。
126.术语“治疗剂”或“生物治疗剂”是指可用于治疗、控制或改善与疾病或病症相关的症状的任何剂，其中所述疾病或病症与转基因将提供的功能相关。如本文所用，“治疗有效量”是指当施用于患有目标疾病或病症的受试者时，在所述疾病或病症的治疗或控制中提供至少一种治疗益处的剂的量(例如，由转基因表达的产物的量)。此外，关于本发明的剂的治疗有效量是指单独或与其它疗法组合时在疾病或病症的治疗或控制中提供至少一种治疗益处的剂的量。
127.短语“肝脏特异性”或“肝脏定向”是指如下核酸元件：由于此类元件与肝细胞的细胞内环境的相互作用而已经调整它们在肝脏(肝)细胞或组织中的活性。在将基因疗法递送至肝脏组织的情况下，肝脏充当身体的生物反应器或“贮库”，并且在肝脏中增强表达的基因盒将产生分泌到循环中的生物治疗剂(翻译的蛋白质)。因此，生物治疗剂通过肝脏表达的方式全身递送至受试者。不受任何一种理论的束缚，肝脏产生生物治疗剂(诸如由递送的转基因产生)可以提供对该剂的免疫耐受性，使得产生该蛋白质的受试者的内源性t细胞会将该蛋白质识别为自身蛋白质，而不诱导先天免疫反应。
128.5.2构建体
129.本文提供了编码huptm抗tnfα fc融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体。本文提供的病毒载体和其他dna表达构建体包括用于将转基因递送至靶细胞的任何合适的方法。转基因的递送手段包括病毒载体、脂质体、其他含脂质复合物、其他大分子复合物、合成的修饰mrna、未修饰mrna、小分子、非生物活性分子(例如，金颗粒)、聚合分子(例如，树状
物)、裸dna、质粒、噬菌体、转座子、粘粒或附加体。在一些实施方案中，载体是靶向载体，例如靶向眼组织细胞的载体或对眼组织细胞具有嗜性的载体。
130.在一些方面，本公开提供了用于使用的核酸，其中所述核酸包含编码huptm抗tnfα fc融合蛋白的核酸序列，作为本文所述的转基因，所述转基因可操作地连接至被选择用于在靶向表达所述转基因的组织中表达的启动子，例如但不限于泛在启动子(诸如cb7/cag启动子(seq id no：50)和相关的上游调控序列、巨细胞病毒(cmv)启动子、ef-1α启动子(seq id no：53)、mu1a(seq id no：52)、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子)和眼组织特异性启动子(诸如人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红色视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)、cb启动子(seq id no：159)、cb长启动子(seq id no：160)或best1/grk启动子(seq id no：161))。关于有用启动子的列表参见表1和表1a。
131.在某些实施方案中，本文提供了包含一种或多种核酸(例如，多核苷酸)的重组载体。核酸可包括dna、rna或dna和rna的组合。在某些实施方案中，dna包含选自由启动子序列、感兴趣的基因序列(转基因，例如编码huptm抗tnfα fc融合蛋白的核苷酸序列)、非翻译区和终止序列组成的组的序列中的一种或多种。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含可操作地连接至感兴趣的基因的启动子。
132.在某些实施方案中，本文公开的核酸(例如，多核苷酸)和核酸序列可被密码子优化，例如经由本领域技术人员已知的任何密码子优化技术(参见例如quax等人，2015，mol cell 59：149-161的综述)。用于在人细胞中表达抗tnfα融合蛋白的核苷酸序列本文在表7中提供。
133.在一个具体的实施方案中，本文所述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的aav2反向末端重复序列；(2)一个或多个控制元件，b)任选地，鸡β-肌动蛋白或其他内含子，以及c)兔β-珠蛋白polya信号；以及(3)编码tnfr2的可溶性细胞外结构域的核酸序列，所述可溶性细胞外结构域与人igg1 fc结构域的n端连接，其中所述fc结构域从n端到c端包含：铰链区-ch2结构域-ch3结构域(依那西普)。示例性构建体在图1和图2a中示出。
134.在一个具体的实施方案中，本文所述的构建体包含以下组分：(1)侧接表达盒的aav2反向末端重复序列；(2)一个或多个控制元件，b)任选地，鸡β-肌动蛋白或其他内含子，以及c)兔β-珠蛋白polya信号；以及(3)编码tnfr1的可溶性细胞外结构域的核酸序列，所述可溶性细胞外结构域经由凝血酶切割位点与人igg1 fc结构域的n端连接，其中所述fc结构域从n端到c端包含：铰链区-ch2结构域-ch3结构域(eys060)。示例性构建体在图2b中示出。
135.5.2.1mrna载体
136.在某些实施方案中，作为dna载体的替代，本文提供的载体是编码感兴趣的基因(例如转基因，例如huptm非单克隆抗体生物制品)的经修饰的mrna。用于将转基因递送至视网膜色素上皮细胞的经修饰和未修饰的mrna的合成在例如hansson等人，j.biol.chem.，2015，290(9)：5661-5672中教导，该文献以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，本文提供了编码huptm抗tnfα fc融合蛋白的经修饰的mrna。
137.5.2.2病毒载体
138.病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒(aav，例如aav2.7m8、aav3、aav8、aav9、aavrh10、aav2.7m8和其他血清型、)、慢病毒、辅助依赖性腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、日
本血凝素病毒(hvj)、甲病毒、痘苗病毒和逆转录病毒载体。逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(mlv)和基于人免疫缺陷病毒(hiv)的载体。甲病毒载体包括塞姆利基森林病毒(sfv)和辛德毕斯病毒(sin)。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是重组病毒载体。在某些实施方案中，改变本文提供的病毒载体，使得它们在人体中是复制缺陷型的。在某些实施方案中，病毒载体是杂合载体，例如置于“无助”腺病毒载体中的aav载体。在某些实施方案中，本文提供了包含来自第一病毒的病毒衣壳和来自第二病毒的病毒包膜蛋白的病毒载体。在具体的实施方案中，第二病毒是水泡性口炎病毒(vsv)。在更具体的实施方案中，包膜蛋白是vsv-g蛋白。
139.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于hiv的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的基于hiv的载体包含至少两种多核苷酸，其中gag和pol基因来自hiv基因组，而env基因来自另一种病毒。
140.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于单纯疱疹病毒的病毒载体。在某些实施方案中，修饰本文提供的基于单纯疱疹病毒的载体，使得它们不包含一个或多个即刻早期(ie)基因，使它们无细胞毒性。
141.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于mlv的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的基于mlv的载体包含至多8kb的异源dna代替病毒基因。
142.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于慢病毒的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的慢病毒载体源自人慢病毒。在某些实施方案中，本文提供的慢病毒载体源自非人慢病毒。在某些实施方案中，本文提供的慢病毒载体被包装到慢病毒衣壳中。在某些实施方案中，本文提供的慢病毒载体包含以下元件中的一个或多个：长末端重复序列、引物结合位点、多嘌呤区、att位点和衣壳化位点。
143.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于甲病毒的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的甲病毒载体是重组的复制缺陷型甲病毒。在某些实施方案中，本文提供的甲病毒载体中的甲病毒复制子通过在其病毒粒子表面展示功能性异源配体而靶向特定细胞类型。
144.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体是基于aav的病毒载体。在某些实施方案中，本文提供的基于aav的载体不编码aav rep基因(复制所需)和/或aav cap基因(合成衣壳蛋白所需)(rep和cap蛋白可由包装细胞反式提供)。已鉴定了多种aav血清型。在某些实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自一种或多种aav血清型的组分。在优选的实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自对眼组织、肝脏和/或肌肉具有嗜性的aav的一种或多种血清型的组分。在整个说明书中，aav“血清型”是指具有免疫学上不同的衣壳、天然存在的衣壳或工程化衣壳的aav。在某些实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自aav1、aav2、aav2.7m8、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aav9、aav9e、aavrh10、aavrh20、aavrh39、aavhu.37、aavrh73、aavrh74、aav.hu51、aav.hu21、aav.hu12或aav.hu26中的一种或多种的衣壳组分。在某些实施方案中，本文提供的基于aav的载体是aav2.7m8、aav8、aav3b、aav9、aav10、aavrh73或aavrh10血清型中的一种或多种或者包含来自这些血清型中的一种或多种的组分。提供了病毒载体，其中衣壳蛋白是aav8衣壳蛋白(seq id no：32)、aav3b衣壳蛋白(seq id no：26)或aavrh73衣壳蛋白(seq id no：38)的变体，并且衣壳蛋白与aav8衣壳蛋白(seq id no：32)、aav3b衣壳蛋白(seq id no：26)或
aavrh73衣壳蛋白(seq id no：38)的氨基酸序列例如具有至少95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性，同时保留天然衣壳的生物学功能。在某些实施方案中，编码的aav衣壳具有seq id no：32的序列，该序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代并保留aav8、aav3b或aavrh73衣壳的生物学功能。图3提供了不同aav血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列与潜在氨基酸的比较比对，所述潜在氨基酸可基于标记为subs的行中的比较在比对序列中的某些位置被取代。因此，在具体的实施方案中，aav载体包含aav8、aav3b或aavrh73衣壳变体，所述衣壳变体具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个不存在于如图3的subs行中鉴定的天然aav衣壳序列中的该位置的氨基酸取代。aav8、aav3b或aavrh73衣壳的氨基酸序列在表3中提供。
145.在一些实施方案中，基于aav的载体包含来自一种或多种aav的血清型的组分。在一些实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自以下中的一种或多种的衣壳组分：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16或其他raav颗粒、或者它们中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，本文提供的基于aav的载体包含来自以下中的一种或多种的衣壳组分：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、aav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16或其他raav颗粒、或者它们中的两种或更多种血清型的组合。在一些实施方案中，raav颗粒包含与选自以下的aav衣壳血清型的例如vp1、vp2和/或vp3序列具有至少80％或更多同一性(例如，85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即，最多100％同一性)的衣壳蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aav14、aav15、aav16、aav.rh8、aav.rh10、aav.rh20、aav.rh39、aav.rh74、aav.rhm4-1、aav.hu37、aav.anc80、raav.anc80l65、aav.7m8、aav.php.b、aav.php.eb、aav2.5、aav2tyf、aav3b、aav.lk03、aav.hsc1、aav.hsc2、aav.hsc3、aav.hsc4、aav.hsc5、aav.hsc6、aav.hsc7、aav.hsc8、aav.hsc9、aav.hsc10、aav.hsc11、aav.hsc12、aav.hsc13、aav.hsc14、aav.hsc15或aav.hsc16或它们的衍生物、修饰物或假型。
146.在具体的实施方案中，用于本文的组合物和方法中的重组aav是anc80或anc80l65(参见例如zinn等人，2015，cell rep.12(6)：1056-1068，其以引用的方式整体并入)。在具体的实施方案中，用于本文的组合物和方法中的重组aav是aav.7m8(包括其变体)(参见例如us 9,193,956、us 9,458,517、us 9,587,282、us 2016/0376323和wo 2018/075798，其各自以引用的方式整体并入本文)。在具体的实施方案中，用于本文的组合物和方法中的aav
是us 9,585,971中公开的任何aav，诸如aav-php.b。在具体的实施方案中，用于本文的组合物和方法中的aav是aav2/rec2或aav2/rec3载体，该载体具有源自aav8和血清型cy5、rh20或rh39的杂合衣壳序列(参见例如issa等人，2013，plos one 8(4)：e60361，其关于这些载体以引用的方式并入本文)。在具体的实施方案中，用于本文的组合物和方法中的aav是在以下(其各自以引用的方式整体并入本文)中的任一项中公开的aav：us 7,282,199、us 7,906,111、us 8,524,446、us 8,999,678、us 8,628,966、us 8,927,514、us 8,734,809、us9,284,357、us 9,409,953、us 9,169,299、us 9,193,956、us 9,458,517、us 9,587,282、us 2015/0374803、us 2015/0126588、us 2017/0067908、us 2013/0224836、us 2016/0215024、us 2017/0051257、pct/us2015/034799和pct/ep2015/053335。在一些实施方案中，raav颗粒具有与以下专利和专利申请(其各自以引用的方式整体并入本文)中任一者中公开的aav衣壳的vp1、vp2和/或vp3序列具有至少80％或更多同一性(例如，85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即，最多100％同一性)的衣壳蛋白：美国专利号7,282,199、7,906,111、8,524,446、8,999,678、8,628,966、8,927,514、8,734,809、us 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9,458,517和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257；以及国际专利申请号pct/us2015/034799、pct/ep2015/053335。
147.在一些实施方案中，raav颗粒包含美国专利号9,840,719和wo 2015/013313中公开的任何aav衣壳，诸如aav.rh74和rhm4-1，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，raav颗粒包含wo 2014/172669中公开的任何aav衣壳，诸如aav rh.74，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，raav颗粒包含aav2/5的衣壳，如georgiadis等人，2016，gene therapy 23：857-862和georgiadis等人，2018，gene therapy 25：450中所描述，所述文献各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，raav颗粒包含wo 2017/070491中公开的任何aav衣壳，诸如aav2tyf，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，raav颗粒包含aavlk03或aav3b的衣壳，如puzzo等人，2017，sci.transl.med.29(9)：418中所描述，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，raav颗粒包含美国专利号8,628,966、us 8,927,514、us 9,923,120和wo 2016/049230号中公开的任何aav衣壳，诸如hsc1、hsc2、hsc3、hsc4、hsc5、hsc6、hsc7、hsc8、hsc9、hsc10、hsc11、hsc12、hsc13、hsc14、hsc15或hsc16，所述专利各自以引用的方式整体并入。
148.在一些实施方案中，raav颗粒具有以下文献中公开的衣壳蛋白：国际申请公布号wo 2003/052051(参见例如
′
051公布的seq id no：2)、wo 2005/033321(参见例如
′
321公布的seq id no：123和88)、wo 03/042397(参见例如
′
397公布的seq id no：2、81、85和97)、wo 2006/068888(参见例如
′
888公布的seq id no：1和3-6)、wo 2006/110689(参见例如
′
689公布的seq id no：5-38)、wo2009/104964(参见例如
′
964公布的seq id no：1-5、7、9、20、22、24和31)、wo 2010/127097(参见例如
′
097公布的seq id no：5-38)和wo 2015/191508(参见例如
′
508公布的seq id no：80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如
′
924公布的seq id no：1、5-10)，所述文献各自的内容以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，raav颗粒具有与以下文献中公开的aav衣壳的vp1、vp2和/或vp3序列具有至少80％或更多同一性(例如，85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％、99.5％等，即，最多100％同一性)的衣壳蛋白：国际申请公布号wo 2003/052051(参见例如
′
051公布的seq id no：2)、wo 2005/033321(参见例如
′
321公布的seq id no：123和88)、wo 03/042397(参见例如
′
397公布的seq id no：2、81、85和97)、wo 2006/068888(参见例如
′
888公布的seq id no：1和3-6)、wo 2006/110689(参见例如
′
689公布的seq id no：5-38)、wo2009/104964(参见例如964公布的seq id no：1-5、7、9、20、22、24和31)、w0 2010/127097(参见例如
′
097公布的seq id no：5-38)和wo 2015/191508(参见例如
′
508公布的seq id no：80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如
′
924公布的seq id no：1、5-10)。
149.在另外的实施方案中，raav颗粒包含假型化aav衣壳。在一些实施方案中，假型化aav衣壳是raav2/8或raav2/9假型化aav衣壳。用于产生和使用假型化raav颗粒的方法是本领域已知的(参见例如duan等人，j.virol.，75：7662-7671(2001)；halbert等人，j.virol.，74：1524-1532(2000)；zolotukhin等人，methods 28：158-167(2002)；以及auricchio等人，hum.molec.genet.10：3075-3081，(2001))。
150.基于aav2.7m8、基于aav8、基于aav9和基于aavrh10的病毒载体用于本文所述的某些方法中。基于aav的病毒载体的核苷酸序列以及制备重组aav和aav衣壳的方法在例如美国专利号9,193,956 b2、美国专利号7,282,199 b2、美国专利号7,790,449 b2、美国专利号8,318,480 b2、美国专利号8,962,332 b2和国际专利申请号pct/ep2014/076466中教导，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一个方面，本文提供了编码转基因(例如，huptm二聚体融合蛋白)的基于aav(例如，aav2.7m8、aav8、aav9或aavrh10)的病毒载体。aav衣壳(包括aav2.7m8、aav8、aav9和aavrh10)的氨基酸序列在图3中提供。
151.在某些实施方案中，单链aav(ssaav)可用于上文。在某些实施方案中，可使用自身互补载体，例如scaav(参见例如wu，2007，human gene therapy，18(2)：171-82；mccarty等人，2001，gene therapy，第8卷，第16期，第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535、7,125,717和7,456,683，其各自以引用的方式整体并入本文)。
152.在某些实施方案中，用于本文所述的方法中的病毒载体是基于腺病毒的病毒载体。重组腺病毒载体可用于转移编码huptm抗tnfαfc融合蛋白的转基因。重组腺病毒可以是具有e1缺失、具有或不具有e3缺失并且具有插入任一缺失区中的表达盒的第一代载体。重组腺病毒可以是含有e2和e4区的全部或部分缺失的第二代载体。辅助依赖性腺病毒仅保留腺病毒反向末端重复序列和包装信号(phi)。在有或没有填充序列的情况下，将转基因插入在包装信号与3
′
itr之间，以保持基因组接近大约36kb的野生型大小。用于产生腺病毒载体的示例性方案可见于alba等人，2005，“gutless adenovirus：last generation adenovirus for gene therapy，”gene therapy 12：s 18-s27中，其以引用的方式整体并入本文。
153.在某些实施方案中，用于本文所述的方法中的病毒载体是基于慢病毒的病毒载体。重组慢病毒载体可用于转移编码huptm抗tnfαfc融合蛋白的转基因。使用四种质粒来制备构建体：含有gag/pol序列的质粒、含有rev序列的质粒、含有包膜蛋白的质粒(例如，vsv-g)以及具有包装元件和抗tnfα fc融合蛋白的顺式质粒。
154.对于慢病毒载体产生，将四种质粒共转染到细胞(例如，基于hek293的细胞)中，其中聚乙烯亚胺或磷酸钙可以用作转染剂。然后在上清液中收获慢病毒(慢病毒需要从细胞
出芽才具有活性，因此不需要/不应进行细胞收获)。过滤上清液(0.45μm)，然后添加氯化镁和全能核酸酶(benzonase)。进一步的下游过程可能差别很大，其中使用tff和柱色谱法是最符合gmp的过程。其他在有/没有柱色谱法的情况下使用超速离心。用于产生慢病毒载体的示例性方案可见于lesch等人，2011，“production and purification of lentiviral vector generated in 293t suspension cells with baculoviral vectors，”gene therapy 18：531-538和ausubel等人，2012，“production of cgmp-grade lentiviral vectors，”bioprocess int.10(2)：32-43，这两篇文献都以引用的方式整体并入本文。
155.在一个具体的实施方案中，用于本文所述的方法中的载体是编码huptm抗tnfα fc融合蛋白的载体，使得在将该载体引入相关细胞后，该细胞表达huptm抗tnfα fc融合蛋白的糖基化和/或酪氨酸硫酸化变体。
156.5.2.3基因表达的启动子和修饰物
157.在某些实施方案中，本文提供的载体包含调节基因递送或基因表达的组分(例如，“表达控制元件”)。在某些实施方案中，本文提供的载体包含调节基因表达的组分。在某些实施方案中，本文提供的载体包含影响与细胞结合或靶向细胞的组分。在某些实施方案中，本文提供的载体包含影响多核苷酸(例如，转基因)在摄取后在细胞内定位的组分。在某些实施方案中，本文提供的载体包含可以用作可检测或可选择标记的组分，例如用于检测或选择已摄取多核苷酸的细胞。
158.在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含控制转基因的表达的一种或多种启动子。这些启动子(以及控制转录的其他调控元件，诸如增强子)可以是组成型的(促进泛在表达)或者可在眼组织中特异性或选择性表达。在某些实施方案中，启动子是组成型启动子。
159.在某些实施方案中，启动子是cb7(也称为cag启动子)(参见dinculescu等人，2005，hum gene ther 16：649-663，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，cag(seq id no：51)或cb7启动子(seq id no：50)包括增强载体驱动的转基因表达的其他表达控制元件。在某些实施方案中，其他表达控制元件包含鸡β-肌动蛋白内含子和/或兔β-珠蛋白polya信号(seq id no：55)。在某些实施方案中，启动子包含tata盒。在某些实施方案中，启动子包含一个或多个元件。在某些实施方案中，一个或多个启动子元件可相对于彼此倒置或移动。在某些实施方案中，启动子的元件被定位成协同发挥作用。在某些实施方案中，启动子的元件被定位成独立发挥作用。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含选自由以下组成的组的一种或多种启动子：人cmv即刻早期基因启动子、sv40早期启动子、劳斯肉瘤病毒(rs)长末端重复序列和大鼠胰岛素启动子。在某些实施方案中，本文提供的载体包含选自由以下组成的组的一个或多个长末端重复序列(ltr)启动子：aav、mlv、mmtv、sv40、rsv、hiv-1和hiv-2 ltr。
160.在某些实施方案中，本文提供的载体包含一种或多种组织特异性启动子(例如，视网膜特异性启动子)。在具体的实施方案中，本文提供的病毒载体包含眼组织细胞特异性启动子，诸如人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红色视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)或best1/grk启动子(seq id no：161)。
161.提供了关于串联元件在表达盒中的排列嵌合的核酸调控元件。一般而言，调控元
件具有多种功能，如转录起始或调节的识别位点、与细胞特异性机制协调以驱动在信号转导后表达以及增强下游基因的表达。
162.在某些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在某些实施方案中，启动子是缺氧诱导型启动子。在某些实施方案中，启动子包含缺氧诱导因子(hif)结合位点。在某些实施方案中，启动子包含hif-1α结合位点。在某些实施方案中，启动子包含hif-2α结合位点。在某些实施方案中，hif结合位点包含rcgtg基序。关于hif结合位点的位置和序列的细节，参见例如等人，blood，2011，117(23)：e207-e217，其以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，启动子包含缺氧诱导转录因子而不是hif转录因子的结合位点。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含在缺氧中优先翻译的一个或多个ires位点。关于缺氧诱导型基因表达和其中涉及的因子的教导，参见例如kenneth和rocha，biochem j.，2008，414：19-29，其以引用的方式整体并入本文。在具体的实施方案中，缺氧诱导型启动子是人n-wasp启动子，参见例如salvi，2017，biochemistry and biophysics reports 9：13-21(针对n-wasp启动子的教导通过引用并入)，或者是人epo的缺氧诱导型启动子，参见例如tsuchiya等人，1993，j.biochem.113：395-400(针对epo缺氧诱导型启动子的公开内容以引用的方式并入)。在其他实施方案中，启动子是药物诱导型启动子，例如通过施用雷帕霉素或其类似物诱导的启动子。参见例如pct公布wo94/18317、wo 96/20951、wo 96/41865、wo 99/10508、wo 99/10510、wo 99/36553和wo 99/41258以及us 7,067,526中雷帕霉素诱导型启动子的公开内容，这些文献针对药物诱导型启动子的公开内容以引用的方式整体据此并入。
163.本文提供了含有某些泛在和组织特异性启动子的构建体。此类启动子包括合成和串联启动子。启动子的示例和核苷酸序列在下表1和表1a中提供。表1还包括可用于本文提供的表达盒的其他调控元件的核苷酸序列。
164.表1.启动子和其他调控元件序列
165.166.167.168.169.170.171.[0172][0173]
表1a.其他调控序列
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180][0181]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含除启动子之外的一个或多个调控元件。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含增强子。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含阻遏蛋白。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含内含子(例如，vh4内含子(seq id no：57)或嵌合内含子(seq id no：56))。病毒载体还可包括kozak序列以促进转基因产物例如gccacc的翻译。
[0182]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含转基因的编码区下游的聚腺苷酸化序列。发出转录终止信号并指导polya尾合成的任何polya位点都适用于本公开的aav载体。
示例性polya信号源自但不限于以下：sv40晚期基因、兔β-珠蛋白基因(seq id no：55)、牛生长激素(bph)基因、人生长激素(hgh)基因、合成的polya(spa)位点和牛生长激素(bgh)基因。参见例如powell和rivera-soto，2015，discov.med.，19(102)：49-57。
[0183]
提供了基因表达盒和包含基因表达盒的raav，其中转基因的表达由具有多于一个调控元件(启动子或增强子)的工程化核酸调控元件控制。
[0184]
5.2.4信号肽
[0185]
在某些实施方案中，本文提供的载体包含调节蛋白质递送的组分。在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含与编码抗tnfα fc融合蛋白的核苷酸序列融合的一个或多个信号肽编码核苷酸序列，使得从转基因表达的蛋白质具有在n端的信号序列以指导分泌。信号肽在本文中也可称为“前导序列”或“前导肽”。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物在细胞中实现适当的包装(例如，糖基化)。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物在细胞中实现正确定位。在某些实施方案中，信号肽允许转基因产物实现从细胞中分泌。
[0186]
在基因疗法环境或在细胞培养中，有两种一般方法可以选择用于蛋白质产生的信号序列。一种方法是使用来自与被表达的蛋白质同源的蛋白质的信号肽。例如，人抗体信号肽可用于在cho或其他细胞中表达igg。另一种方法是鉴定针对用于表达的特定宿主细胞优化的信号肽。信号肽可在不同蛋白质之间或甚至在不同生物体的蛋白质之间互换，但通常该细胞类型中最丰富的分泌蛋白质的信号序列用于蛋白质表达。例如，人白蛋白(血浆中最丰富的蛋白质)的信号肽被发现可以显著提高cho细胞的蛋白质产量。然而，某些信号肽在从表达的蛋白质中被切割后可能保留功能并发挥活性作为“靶向后功能”。因此，在具体的实施方案中，信号肽选自用于表达的细胞分泌的最丰富蛋白质的信号肽以避免靶向后功能。在某些实施方案中，信号序列与重链和轻链序列都融合。示例性序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)，该序列可以由seq id no：63的核苷酸序列编码(参见表2、图2a和图2b)。另选地，适于表达并且可引起huptm抗tnfα fc融合蛋白在眼睛(眼组织)中选择性表达或定向表达的信号序列在下表2中提供。还提供了在肝脏(表3)和肌肉(表4)细胞中有活性的信号序列。
[0187]
表2.用于在眼睛中表达的信号肽
[0188][0189]
表3.用于在肝细胞中表达的信号肽。
[0190]
[0191][0192]
表4.用于在肌细胞中表达的信号肽。
[0193][0194]
5.2.5非翻译区
[0195]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含一个或多个非翻译区(utr)，例如3
′
和/或5
′
utr。在某些实施方案中，针对所需蛋白质表达水平优化utr。在某些实施方案中，针对转基因的mrna半衰期优化utr。在某些实施方案中，针对转基因的mrna的稳定性优化utr。在某些实施方案中，针对转基因的mrna的二级结构优化utr。
[0196]
5.2.6反向末端重复序列
[0197]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体包含一个或多个反向末端重复(itr)序列。itr序列可用于将重组基因表达盒包装到病毒载体的病毒粒子中。在某些实施方案中，itr来自aav，例如aav8或aav2(参见例如yan等人，2005，j.virol.，79(1)：364-379；美国专利号7,282,199 b2、美国专利号7,790,449 b2、美国专利号8,318,480 b2、美国专利号8,962,332 b2和国际专利申请好pct/ep2014/076466，这些文献各自以引用的方式整体并入本文)。在优选的实施方案中，编码itr的核苷酸序列可例如包含seq id no：58(5
′‑
itr)或60(3
′‑
itr)的核苷酸序列。在某些实施方案中，可使用用于产生自身互补载体(例如，
scaav)的经修饰的itr(参见例如wu，2007，human gene therapy，18(2)：171-82；mccarty等人，2001，gene therapy，第8卷，第16期，第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535、7,125,717和7,456,683，这些文献各自以引用的方式整体并入本文)。在优选的实施方案中，编码经修饰的itr的核苷酸序列可例如包含seq id no：58(5
’‑
itr)或60(3
′‑
itr)的核苷酸序列或者针对于scaav修饰的核苷酸序列seq id no：59(m 5
′
itr)或seq id no：61(m 3
′
itr)。
[0198]
5.2.7转基因
[0199]
转基因编码huptm抗tnfα fc融合蛋白，例如基于本文公开的治疗性抗tnfα fc融合蛋白的tnfr1：fc融合蛋白或tnfr2：fc融合蛋白。在具体的实施方案中，huptm抗tnfα fc融合蛋白被工程化以含有在tnfr和/或fc结构域上的另外的糖基化位点。另外，抗tnfα fc融合蛋白的fc结构域可被工程化以改变n297处的糖基化位点，从而防止该位点的糖基化(例如，在n297处取代另一个氨基酸和/或在t297处取代不是t或s的残基以敲除糖基化位点)。此类fc结构域是“无糖基化的”。
[0200]
5.2.7.1用于表达huptm tnfr：fc融合蛋白的构建体
[0201]
在某些实施方案中，转基因编码抗tnfa融合蛋白，其中抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与含有免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接。
[0202]
在某些实施方案中，转基因编码tnfr2(seq id no：2)的细胞外结构域的全部或tnfα结合部分，该部分与免疫球蛋白重链(seq id no：3或4)的fc结构域(包括例如铰链、ch2和ch3结构域)的全部或部分融合。在优选的实施方案中，转基因编码抗tnfα fc融合蛋白，其中抗tnfα fc融合蛋白包含tnfr2的人可溶性细胞外结构域，该人可溶性细胞外结构域诸如通过肽键与人igg1的fc结构域(包括重链ch2和重链ch3以及铰链区)共价连接，该fc结构域在表达后缔合形成二聚体tnfr2：fc融合蛋白。具体地，抗tnfα fc融合蛋白是依那西普(具有带前导序列的seq id no：10或11的氨基酸序列)或依那西普的任何生物类似物形式，包括依那西普-szzs和依那西普-ykro
[0203]
在其他实施方案中，转基因编码tnfr1(seq id no：1)的可溶性细胞外结构域的全部或部分，该部分与免疫球蛋白重链fc结构域(seq id no：6或7)的全部或部分融合。在优选的实施方案中，转基因编码抗tnfα fc融合蛋白，其中抗tnfα fc融合蛋白包含tnfr1的人可溶性细胞外结构域，该人可溶性细胞外结构域诸如通过肽键与人igg1的fc部分(包括重链ch2和重链ch3以及铰链区)共价连接，该fc部分在表达后缔合形成二聚体tnfr1：fc融合蛋白(seq id no：12)。在一些实施方案中，tnfr1经由凝血酶切割位点lvprgs(seq id no：8)与fc结构域融合。在某些实施方案中，抗tnfα fc融合蛋白是eys060(具有seq id no：12的氨基酸序列)。
[0204]
重组aav构建体在细胞、细胞培养物中或在受试者体内表达huptm抗tnfα fc融合蛋白。编码tnfr的可溶性细胞外结构域以及fc结构域的核苷酸序列可针对人细胞中表达被密码子优化，并且在序列中具有降低的cpg二聚体发生率以促进在人细胞中表达。在优选的实施方案中，转基因编码本文公开的任何治疗性抗tnfα fc融合蛋白，例如本文在图1或图2(图2a和图2b中提供的序列)中描绘的tnfr：fc融合物。
[0205]
在某些实施方案中，fc结构域是igg fc结构域，但在其他实施方案中，fc区可以是
iga、igd、ige或igm。从转基因表达的fc融合蛋白可具有igg1、igg2、igg3或igg4 fc结构域，但优选地源自人igg1。fc结构域可以包括本文所述的重链ch1、铰链、ch2和ch3结构域的一些或全部(参见图4和表5)或者它们的片段或变体。
[0206]
fc融合蛋白的fc结构域具有随抗体同种型而变化的一种或多种效应功能。效应功能可以与野生型或治疗性fc融合蛋白的功能相同，或者可以使用下文在第5.2.8节中公开的fc修饰对其进行修饰以增加、增强、改进或抑制一种或多种效应功能。在某些实施方案中，huptm非单克隆抗体转基因编码包含fc多肽的融合蛋白，所述fc多肽包含与如表6中针对依那西普所示的本文所述的治疗性融合蛋白的fc结构域多肽或者表5中所示的igg1、igg2或igg4同种型的示例性fc结构域中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，huptm融合蛋白包含fc多肽或作为表5中的fc多肽序列的变体的序列，因为该序列已用下文在第5.2.8节中描述的一种或多种技术修饰以改变fc多肽的效应功能。
[0207]
重组aav构建体在细胞、细胞培养物中或在受试者体内表达huptm抗tnfα fc融合蛋白。编码抗tnfα fc融合蛋白的核酸序列可针对在人细胞中表达被密码子优化，并且在序列中具有降低的cpg二聚体发生率以促进在人细胞中表达。在优选的实施方案中，转基因编码本文公开的任何治疗性抗tnfα fc融合蛋白，例如本文在图2a和图2b中描绘的治疗性抗tnfα fc融合蛋白依那西普或eys606，并且在某些实施方案中包括表6或另选地表5中提供的相关fc结构域。fc结构域在第5.2.8节中进一步讨论。示例性fc结构域序列在表6以及图3和表5中提供。图2a提供了tnfr2：fc融合物依那西普的氨基酸序列，并且图2b提供了tnfr1：fc融合物eys606的氨基酸序列(还可参见表6)。
[0208]
在一些实施方案中，用于表达抗tnfα fc融合蛋白的转基因可包含编码人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分的核酸序列，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与含有免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，如本文进一步描述。在一些实施方案中，tnfr1经由凝血酶切割位点(seq id no：8)与fc结构域融合。
[0209]
编码如本文公开的治疗性抗tnfα fc融合蛋白的tnfr1或tnfr2的可溶性细胞外结构域、任选地凝血酶切割位点、铰链区和igg1 fc链(ch2+ch3)的核苷酸序列在表7中提供。在某些实施方案中，这些核苷酸序列被密码子优化以在人细胞中表达。参见例如表7的依那西普的密码子优化序列(seq id no 15-18)。
[0210]
转基因可包括形成链间二硫键的铰链区的部分(例如，含有序列cppcpa(seq id no：153)的部分)。不含有包含序列ccpcpa(seq id no：153)的铰链区的部分的fc结构域序列不会形成链内二硫键，而在c端具有含有序列cppcpa(seq id no：153)的铰链区的部分的那些fc融合结构域序列将形成链内二硫键，因此将形成二聚体融合蛋白片段。在一些实施方案中，铰链含有氨基酸序列epkscdkthtcppcpapellgg(seq id no：145)的全部或部分，并且具体地为epkscdkthl(seq id no：146)、epkscdktht(seq id no：147)、epkscdkthtcppcpa(seq id no：148)、epkscdkthlcppcpa(seq id no：149)、dkthtcppcpapellgg(seq id no：21)、dkthtcppcpapellggpsvfl(seq id no：152)、epkscdkthtcppcpapellggpsvfl(seq id no：150)或epkscdkthlcppcpapellggpsvfl(seq id no：151)。
[0211]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体按以下顺序包含以下元件：a)组成型或
诱导型(例如，缺氧诱导型或利福霉素诱导型)启动子序列或组织特异性启动子/调节区，例如表1或表1a中提供的调节区中的一种，特别是促进眼组织特异性表达的启动子，以及b)编码转基因(例如，抗tnfα fc融合蛋白)的序列。在某些实施方案中，包含转基因的序列编码抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与含有免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接。在某些实施方案中，包含转基因的序列编码在抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述人眼组织细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。在其他实施方案中，该序列编码具有seq id no：10、11或12的氨基酸序列的转基因产物。在优选的实施方案中，抗tnfα融合蛋白是依那西普或eys606。
[0212]
在某些实施方案中，本文提供的病毒载体按以下顺序包含以下元件：a)组成型或诱导型启动子序列或组织特异性启动子，诸如表1和表1a中的启动子或调节区中的一种，以及b)编码转基因(例如，抗tnfα fc融合蛋白)的序列，其中转基因包含信号肽、人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接以形成抗tnfα fc融合蛋白。在其他实施方案中，本文提供的病毒载体按以下顺序具有以下元件：a)表1和表1a中所列的眼组织特异性启动子，以及b)编码包含信号肽的转基因的序列，其中转基因包含信号肽、人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与含有免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接以形成抗tnfα fc融合蛋白。在具体的实施方案中，本文提供的病毒载体还包含与具有lsprgs(seq id no：158)的氨基酸序列的tnfr结构域的c端连接的凝血酶切割位点。
[0213]
在具体的实施方案中，提供了aav载体，所述aav载体包含：病毒衣壳，所述病毒衣壳与aav2.7m8衣壳、aav8衣壳、aav3b衣壳或aavrh73衣壳的氨基酸序列具有至少95％同一性(参见图3)；以及包含侧接aav反向末端重复序列(itr)的表达盒的人工基因组，其中所述表达盒包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在一种或多种眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列。
[0214]
可施用编码和表达治疗性融合蛋白的raav载体以治疗或预防或改善适合用治疗性融合蛋白治疗、预防或改善症状的疾病或疾患的症状。还提供了使用raav载体和编码它们的构建体在人细胞中表达huptm抗tnfα fc融合蛋白的方法。
[0215]
5.2.8fc区修饰
[0216]
在某些实施方案中，转基因编码缔合形成二聚体fc融合蛋白的抗tnfα fc融合蛋白。因此，转基因包含编码例如人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分的核苷酸序列，该可溶性细胞外部分诸如通过肽键与含有免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接(图2a和图2b)，包括重链的铰链区的全部或一部分和fc结构域肽的n端。表6提供了本文所述的某些治疗性抗tnfα fc融合蛋白的fc多肽的氨基酸序列。另选地，可使用igg2或igg4 fc结构域，它们的序列在图4和表5中提供。如详述的，转基因可包含编码用于治疗性抗tnfα fc融合蛋白的fc结构域多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列在如本文提供的铰链区的n端与编码人tnfr的可溶性细胞外部分的核苷酸序列连接(其中氨基酸序列在图2a和图2b以及表6中提供)。
[0217]
术语“fc区”是指两个“fc多肽”(或“fc结构域”)的二聚体，每个“fc多肽”包含抗体
的重链恒定区，不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，“fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个fc多肽。“fc多肽”是指iga、igd和igg的至少最后两个恒定区免疫球蛋白结构域或者ige和igm的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包括柔性铰链n端至这些结构域的部分或全部。对于igg，例如，“fc多肽”包含免疫球蛋白结构域cgamma2(cγ2，通常称为ch2结构域)和cgamma3(cγ3，也称为ch3结构域)，并且可包括cgammal(cγ1，也称为ch1结构域)与ch2结构域之间的铰链结构域的下部。尽管fc多肽的边界可变化，但人igg重链fc多肽通常被定义为包含从t223或c226或p230开始到其羧基端的残基，其中编号是根据如kabat等人(1991，nih publication 91-3242，national technical information services，springfield，va.)的eu索引。对于iga，例如，fc多肽包含免疫球蛋白结构域calpha2(cα2)和calpha3(cα3)，并且可包括calpha1(cα1)与cα2之间的铰链的下部。
[0218]
在某些实施方案中，fc多肽是依那西普或eys606的fc多肽(参见表6)。在其他实施方案中，fc多肽是igg fc多肽。fc多肽可来自igg1、igg2或igg4同种型(参见图4关于igg1、igg2和igg4 fc结构域序列的比对，根据eu编号进行编号)，或者可以是igg3 fc结构域，这取决于例如治疗性抗体的所需效应活性。在一些实施方案中，包括fc结构域的工程化重链恒定区(ch)是嵌合的。因此，嵌合ch区组合了源自一种以上免疫球蛋白同种型和/或亚型的ch结构域。例如，嵌合(或杂合)ch区包含来自igg、iga和/或igm的fc区的部分或全部。在其他示例中，嵌合ch区包含源自人igg1、人igg2或人igg4分子的部分或全部ch2结构域，这些结构域与源自人igg1、人igg2或人igg4分子的ch3结构域的部分或全部组合。在其他实施方案中，嵌合ch区含有嵌合铰链区。
[0219]
表5.fc结构域氨基酸序列表
[0220]
[0221][0222]
在一些实施方案中，重组载体编码包含工程化(突变)fc区(例如，igg恒定区的工程化fc区)的治疗性fc融合物。与具有野生型igg恒定区或者没有对igg抗体的抗体恒定区、fc区或fc片段的修饰的igg重链恒定区的相应抗体相比，所述修饰可改变一种或多种效应功能，诸如fc受体结合或新生儿fc受体(fcrn)结合，从而改变半衰期、cdc活性、adcc活性和/或adpc活性。因此，在一些实施方案中，抗体可被工程化以提供表现出改变的与一种或多种fc受体(例如，fcγri、fcγriia、fcγriib、fcγriiia、fcγriiib、fcγriv或fcrn受体)的结合(与没有所述修饰的参考或野生型恒定区相比)的igg抗体的抗体恒定区、fc区或fc片段。在一些实施方案中，抗体是与具有野生型igg恒定区或没有所述修饰的igg恒定区的相应抗体相比表现出一种或多种改变的效应功能(诸如cdc、adcc或adcp活性)的igg抗体的抗体恒定区、fc区或fc片段。
[0223]“效应功能”是指由抗体fc区与fc受体或配体的相互作用引起的生化事件。效应功能包括fcγr介导的效应功能(诸如adcc和adcp)和补体介导的效应功能(诸如cdc)。
[0224]“效应细胞”是指表达一种或多种fc受体并介导一种或多种效应功能的免疫系统细胞。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、b细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(nk)细胞和t细胞，并且可来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
[0225]“adcc”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性效应(免疫)细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解。
[0226]“adcp”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”是指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性效应(免疫)细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的吞噬作用。
[0227]“cdc”或“补体依赖性细胞毒性”是指其中一种或多种补体蛋白组分识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解的反应。
[0228]
在一些实施方案中，参考igg恒定区的eu编号(参见图4)，fc结构域的修饰包括但不限于以下修饰和它们的组合：233、234、235、236、237、238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、
immunol 29：2819)。
[0235]
在一些实施方案中，fc结构域可被工程化以激活所有、一些正常的fc效应功能或者不激活任何正常的fc效应功能，而不影响fc多肽(例如，抗体)所需的药代动力学特性。具有改变的效应功能的fc多肽可能是期望的，因为它们可减少治疗性蛋白质的不希望的副作用，诸如效应细胞的活化。
[0236]
改变或甚至消除效应功能的方法可包括对抗体的铰链区氨基酸残基进行突变或修饰。例如，根据eu编号系统，包含234a、237a和238s取代的igg fc结构域突变体表现出减少的补体依赖性裂解和/或细胞介导的破坏。下铰链中的缺失和/或取代(例如，其中铰链结构域内的位置233-236(eu编号)被缺失或修饰为甘氨酸)在本领域中已被证明可以显著降低adcc和cdc活性。
[0237]
在具体的实施方案中，fc结构域是无糖基化fc结构域，所述结构域在残基297或299处具有取代以改变297处的糖基化位点，使得fc结构域不被糖基化。此类无糖基化fc结构域可具有降低的adcc或其他效应活性。
[0238]
本领域在以下文献中描述了包含具有改变的效应功能的突变和/或嵌合ch区的蛋白质的非限制性示例以及工程化和测试突变抗体的方法：例如k.l.amour等人，eur.j.immunol.1999，29：2613-2624；lazar等人，proc.natl.acad.sci.usa 2006，103：4005；2007年6月14日公布的美国专利申请公布号20070135620a1；2008年6月26日公布的美国专利申请公布号20080154025 a1；2010年9月16日公布的美国专利申请公布号20100234572 a1；2012年9月6日公布的美国专利申请公布号20120225058 a1；2015年11月26日公布的美国专利申请公布号20150337053 a1；2016年10月6日公布的国际公布号wo20/16161010a2；2016年6月7日公布的u.s.9,359,437；以及2018年8月21日发布的美国专利号10,053,517，所有这些文献以引用的方式并入本文。
[0239]
在所有人igg亚类的重链基因中保守的c端赖氨酸(-k)通常不存在于在血清中循环的抗体中-所述c端赖氨酸在循环中被切除，从而产生循环igg的异质群体(van den bremer等人，2015，mabs 7：672-680)。在全长mab的载体化构建体中，编码fc末端的c端赖氨酸(-k)或甘氨酸-赖氨酸(-gk)的dna可以被缺失以原位产生更均一的抗体产物。(参见hu等人，2017biotechnol.prog.33：786-794，其以引用的方式整体并入本文)。
[0240]
5.2.9载体的制造和测试
[0241]
本文提供的病毒载体可使用宿主细胞来制造。本文提供的病毒载体可使用哺乳动物宿主细胞(例如，a549、wehi、10t1/2、bhk、mdck、cos1、cos7、bsc 1、bsc 40、bmt 10、vero、w138、hela、293、saos、c2c12、l、ht1080、hepg2、原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞)来制造。本文提供的病毒载体可使用来自人、猴、小鼠、大鼠、兔或仓鼠的宿主细胞来制造。
[0242]
将宿主细胞用编码转基因和相关元件(例如，载体基因组)的序列以及在宿主细胞中产生病毒的手段(例如，复制和衣壳基因(例如，aav的rep和cap基因))稳定地转化。对于产生具有aav8衣壳的重组aav载体的方法，参见美国专利号7,282,199 b2的具体实施方式的第iv部分，该专利以引用的方式整体并入本文。所述载体的基因组拷贝滴度可例如通过分析来确定。可例如通过cscl2沉降来回收病毒粒子。
[0243]
另选地，昆虫细胞中的杆状病毒表达系统可用于产生aav载体。关于综述，参见aponte-ubillus等人，2018，appl.microbiol.biotechnol.102：1045-1054，关于制造技术
所述文献以引用的方式整体并入本文。
[0244]
体外测定(例如，细胞培养测定)可以用于测量来自本文所述的载体的转基因表达，从而指示例如载体的效力。例如，细胞系(lonza)，一种源自人胚胎视网膜细胞或视网膜色素上皮细胞的细胞系，例如，视网膜色素上皮细胞系htert rpe-1(可从获得)可用于评估转基因表达。一旦表达，就可以确定表达产物的特性，包括确定与人糖基化抗tnfα fc融合蛋白相关的糖基化和酪氨酸硫酸化模式。糖基化模式及其确定方法在第5.4节中讨论。另外，可以使用本领域已知的测定(例如，第5.4节中描述的方法)来确定由于细胞表达的人糖基化抗tnfα fc融合蛋白的糖基化/硫酸化产生的益处。
[0245]
可以使用数字pcr(dpcr)或ddpcr
tm
(biorad technologies，hercules，ca，usa)来评价载体基因组浓度(gc)或载体基因组拷贝。在一个示例中，在几个时间点获得眼组织样品，诸如水状液和/或玻璃状液样品。在另一个示例中，在注射后的不同时间点处死几只小鼠。对眼组织样品进行总dna提取和dpcr测定以获得载体拷贝数。每克组织的载体基因组(转基因)的拷贝可在单个活组织检查样品中测量，或在连续的时间点在不同的组织切片中测量，这将揭示aav在整个眼睛中的传播。利用dneasy blood&tissue kit从收集的眼部流体或组织中提取总dna，并使用nanodrop分光光度计测量dna浓度。为了确定每个组织样品中的载体拷贝数，利用naica crystal digital pcr系统(stilla technologies)进行数字pcr。应用双色多路复用系统同时测量转基因aav和内源对照基因。简而言之，转基因探针可以用fam(6-羧基荧光素)染料标记，而内源对照探针可以用vic荧光染料标记。在特定组织切片中每二个倍体细胞中的递送载体的拷贝数计算为：(载体拷贝数)/(内源对照)
×
2。特定细胞类型或组织(诸如角膜、虹膜、睫状体、施莱姆氏管细胞、小梁网、视网膜细胞、rpe细胞、rpe-脉络膜组织或视神经细胞)中随着时间推移的载体拷贝可指示组织持续表达转基因。
[0246]
5.2.9组合物
[0247]
适合施用于人受试者的药物组合物包含重组载体在配制缓冲液中的悬浮液，所述配制缓冲液包含生理学上相容的水性缓冲液、表面活性剂和任选的赋形剂。这种配制缓冲液可以包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一种或多种。在一些实施方案中，药物组合物包含与药学上可接受的载剂组合的raav以施用于受试者。在一个实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更特别地在人体内使用。术语“载剂”是指与剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏完全和不完全佐剂)、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，包括例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物静时，水是常用的载剂。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载剂，特别是对于可注射溶液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。药学上可接受的载剂、赋形剂和稳定剂的另外示例包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白和明胶；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗
衡离子如钠；以及/或者非离子表面活性剂，诸如本领域已知的tween
tm
、聚乙二醇(peg)和pluronics
tm
。本发明的药物组合物除了上述成分之外还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂。这些组合物可呈溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。
[0248]
5.3治疗非感染性葡萄膜炎的方法
[0249]
在另一个方面，提供了用于治疗有需要的受试者的非感染性葡萄膜炎或可以用抗tnfα fc融合蛋白治疗的其他适应症的方法，所述方法包括施用包含编码抗tnfα fc融合蛋白及其变体的表达盒的重组aav颗粒。有需要的受试者包括患有非感染性葡萄膜炎的受试者或易患非感染性葡萄膜炎的受试者，例如处于发展非感染性葡萄膜炎或可用抗tnfα fc融合蛋白治疗的其他适应症的风险或者具有非感染性葡萄膜炎或所述适应症复发的风险中的受试者。施用这种基因疗法的受试者可以是对抗tnfα(例如，依那西普、阿达木单抗、英夫利昔单抗或戈利木单抗)有反应的那些受试者。在具体的实施方案中，所述方法包括治疗已被诊断患有非感染性葡萄膜炎并且在某些实施方案中，被鉴定为对用抗tnfα fc融合蛋白治疗有反应或被认为是用抗tnfα fc融合蛋白的疗法的良好候选者的患者。在具体的实施方案中，患者先前已用抗tnfα fc融合蛋白治疗。为了确定反应性，可将抗tnfα fc融合蛋白(例如，在人培养物、生物反应器等中产生)直接施用于受试者。
[0250]
在具体的实施方案中，提供了治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎或适合用抗tnfα fc融合蛋白治疗的其他适应症的方法，所述方法包括：向所述受试者的眼睛(或肝脏和/或肌肉)施用治疗有效量的重组核酸表达载体，所述重组核酸表达载体包含编码抗tnfα fc融合蛋白fc区的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列，从而形成释放huptm形式的mab或其抗原结合片段的贮库。视网膜下、玻璃体内、前房内或脉络膜上腔施用应使得可溶性转基因产物在以下视网膜细胞类型中的一种或多种中表达：人光感受器细胞(视锥细胞、视杆细胞)；水平细胞；双极细胞；无长突细胞；视网膜神经节细胞(侏儒细胞、伞状细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、光敏神经节细胞和米勒神经胶质细胞)；以及视网膜色素上皮细胞或其他眼组织细胞：角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
[0251]
用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的重组载体和药物组合物在第5.2节中描述。此类载体应对人眼组织或肝脏和/或肌肉细胞具有嗜性，并且可以包括非复制型raav，特别是带有aav2.7m8、aav3b、aav8、aaav9、aav10、aavrh10或aavrh73衣壳的那些。重组载体可以以使得重组载体进入眼组织细胞的任何方式(例如，通过将重组载体引入眼睛中)施用。此类载体还应包含控制转基因在人眼组织细胞和/或人肝脏和肌肉细胞中表达的一种或多种调控序列，包括但不限于人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红色视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)或bestl/grk启动子(seq id no：161)(还可参见表1和表1a)。
[0252]
5.4n-糖基化、酪氨酸硫酸化和o-糖基化
[0253]
本文公开的huptm抗tnfα fc融合蛋白的氨基酸序列(一级序列)各自包含至少一个发生n-糖基化或o-糖基化的位点(关于fc融合蛋白的氨基酸序列内的糖基化位置参见图2a和图2b)。翻译后修饰也发生在全长抗体的fc结构域中，特别是在残基n297处(通过eu编
号，参见图4)。
[0254]
另选地，可将突变引入fc结构域以改变残基n297处的糖基化位点(eu编号，参见图4)，特别是用另一个氨基酸取代297处的天冬酰胺或299处的苏氨酸以去除糖基化位点，从而产生无糖基化fc结构域。
[0255]
5.4.1n-糖基化
[0256]
反向糖基化位点
[0257]
本领域已知规范n-糖基化序列是asn-x-ser(或thr)，其中x可以是除pro以外的任何氨基酸。然而，最近已经证明人抗体的天冬酰胺(asn)残基可以在反向共有基序ser(或thr)-x-asn(其中x可以是除pro以外的任何氨基酸)的情形下被糖基化。参见valliere-douglass等人，2009，j.biol.chem.284：32493-32506；以及valliere-douglass等人，2010，j.biol.chem.285：16012-16022。如本文所公开，本文公开的某些抗tnfα fc融合蛋白包含规范和/或反向共有序列。
[0258]
非共有糖基化位点
[0259]
除了反向n-糖基化位点之外，最近已经证明人抗体的谷氨酰胺(gln)残基可以在非共有基序gln-gly-thr的背景下被糖基化。参见valliere-douglass等人，2010，j.biol.chem.285：16012-16022。令人惊讶的是，本文公开的某些huglyfab片段包含此类非共有序列。另外，o-糖基化包括通过酶将n-乙酰基-半乳糖胺添加到丝氨酸或苏氨酸残基。已经证明存在于抗体的铰链区中的氨基酸残基可以被o-糖基化。与例如大肠杆菌(e.coli)中产生的抗原结合片段相比，o-糖基化的可能性赋予本文提供的治疗性抗tnfα fc融合蛋白另一个优势，同样是因为大肠杆菌天然不含有与人o-糖基化中使用的机制等同的机制。(相反，大肠杆菌中的o-糖基化只有当细菌被修饰以含有特定的o-糖基化机制时才能被证明。参见例如farid-moayer等人，2007，j.bacteriol.189：8088-8098。)
[0260]
工程化n-糖基化位点
[0261]
在某些实施方案中，编码抗tnfα fc融合蛋白的核酸被修饰以包括比通常与huptm抗tnfα fc融合蛋白缔合的多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个n-糖基化位点(包括规范n-糖基化共有序列、反向n-糖基化位点和非共有n-糖基化位点)(例如，相对于与其未修饰状态的huptm抗tnfα fc融合蛋白缔合的n-糖基化位点的数量)。在具体的实施方案中，糖基化位点的引入是通过在抗原结合片段的一级结构的任何地方插入n-糖基化位点(包括规范n-糖基化共有序列、反向n-糖基化位点和非共有n-糖基化位点)来实现的，只要所述引入不影响抗体或抗原结合片段与其抗原的结合即可。糖基化位点的引入可以通过例如将新的氨基酸添加到可溶性细胞外tnfr结构域或fc结构域的一级结构中(例如，完全或部分添加糖基化位点)或者通过突变可溶性细胞外tnfr结构域或fc结构域中的现有氨基酸以便生成n-糖基化位点(例如，不添加氨基酸，但是突变抗tnfα fc融合蛋白的选定氨基酸以形成n-糖基化位点)来实现。本领域技术人员将认识到可以使用本领域已知的方法容易地修饰蛋白质的氨基酸序列，例如包括对编码蛋白质的核酸序列进行修饰的重组方法。
[0262]
在一个具体的实施方案中，抗tnfα fc融合蛋白被修饰，使得当在哺乳动物细胞(诸如视网膜、cns、肝脏或肌肉细胞)中表达时，它可以被高糖基化。
[0263]
huptm抗tnfα fc融合蛋白的n-糖基化
[0264]
与小分子药物不同，生物制剂通常包含具有不同修饰或形式的许多变体的混合
物，这些变体可以具有不同的效力、药代动力学和/或安全性特征。在基因疗法或蛋白疗法方法中产生的每个分子都是完全糖基化和硫酸化的并不是必需的。而是，产生的糖蛋白群体应具有足够的糖基化(包括2，6-唾液酸化)和硫酸化以证明功效。本文提供的基因疗法治疗的目的可以是例如减缓或阻止疾病或异常状况的进展或者降低与疾病或异常状况相关的一种或多种症状的严重性。
[0265]
当huptm抗tnfα fc融合蛋白在人细胞中表达时，fc融合蛋白的n-糖基化位点可以用各种不同的聚糖糖基化。fc结构域的糖基化已被表征，是天冬酰胺297处的单个n-连接聚糖(eu编号；参见图4)。聚糖发挥完整的结构和功能作用，影响抗体效应功能，诸如与fc受体结合(关于对fc糖基化在抗体功能中的作用的讨论，参见例如jennewein和alter，2017，trends in immunology 38：358了)。去除fc区聚糖几乎完全消除了效应功能(jennewien和alter，在362处)。fc聚糖的组成已被证明可影响效应功能，例如，高半乳糖基化和岩藻糖基化的减少已被证明可增加adcc活性，而唾液酸化与抗炎作用相关(同上，在364处)。疾病状态、遗传学和甚至饮食都会影响体内fc聚糖的组成。对于重组表达的抗体和fc融合蛋白，聚糖组成可能因用于重组表达的宿主细胞类型而显著不同，并且可以使用策略来控制和修改在细胞培养物(诸如cho)中重组表达的治疗性抗体中聚糖的组成以改变效应功能(参见例如hansen等人的us 2014/0193404)。因此，本文提供的huptm抗tnfα fc融合蛋白可有利地具有在n297处的聚糖，该聚糖比在非人宿主细胞中表达的抗体更像天然人聚糖组合物。
[0266]
重要的是，当huptm抗tnfα fc融合蛋白在人细胞中表达时，规避了在原核宿主细胞(例如，大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如，cho细胞或ns0细胞)中进行体外生产的需要。相反，作为本文所述的方法的结果，huptm抗tnfα fc融合蛋白的n-糖基化位点被有利地装饰有与人治疗相关和有益于人治疗的聚糖。这种优势在cho细胞、ns0细胞或大肠杆菌用于抗体/抗原结合片段生产时是无法实现的，因为例如cho细胞(1)不表达2，6唾液酸转移酶，因此在n-糖基化期间不能添加2，6唾液酸；(2)可以添加neu5gc作为唾液酸而不是neu5ac；并且(3)还可以产生免疫原性聚糖，即α-gal抗原，其与存在于大多数个体中的抗α-gal抗体反应，在高浓度下可以触发过敏反应；并且因为(4)大肠杆菌天然不含有n-糖基化所需的组分。
[0267]
用于确定抗tnfα fc融合蛋白的糖基化模式的测定是本领域已知的。例如，肼解可以用于分析聚糖。首先，通过与肼孵育从多糖的相关蛋白中释放多糖(可以使用ludger liberate肼解聚糖释放试剂盒(oxfordshire，uk))。亲核试剂肼攻击多糖与载体蛋白之间的糖苷键，并允许释放附接的聚糖。n-乙酰基基团在该处理期间丢失，必须通过重新n-乙酰化重构。还可以使用酶(诸如糖苷酶或内切糖苷酶，诸如pngase f和endo h，这些酶与肼相比可以干净地切割并且具有更少的副反应)来释放聚糖。可以在碳柱上纯化游离聚糖，随后在还原端用荧光团2-氨基苯甲酰胺标记。可以根据royle等人，anal biochem 2002，304(1)：70-90的hplc方案在glycosep-n柱(gl sciences)上分离标记的多糖。所得的荧光色谱图指示多糖长度和重复单元的数量。可以通过收集单个峰并随后进行ms/ms分析来聚集结构信息。由此可以确认单糖组成和重复单元的序列，另外可以鉴定多糖组成的同质性。可以通过maldi-ms/ms来分析低或高分子量的特定峰，并且结果用于确认聚糖序列。色谱图中的每个峰对应于由一定数目的重复单元和其片段(例如，糖残基)组成的聚合物(例如，聚糖)。因此，色谱图允许测量聚合物(例如，聚糖)的长度分布。洗脱时间是聚合物长度的指示，而
1156。本文所述的huptm抗tnfα fc融合蛋白的人糖基化模式应降低转基因产物的免疫原性并提高功效。
[0272]
虽然非规范糖基化位点通常会导致抗tnfα fc融合蛋白群体的糖基化水平较低(例如，1-5％)，但功能益处可能很显著(参见例如van de bovenkamp等人，2016，j.immunol.196：1435-1441)。例如，糖基化可影响抗体的稳定性、半衰期和结合特性。为了确定抗tnfα fc融合蛋白糖基化对融合蛋白对其靶标的亲和力的影响，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如酶联免疫吸附测定(elisa)或表面等离振子共振(spr)。为了确定糖基化对抗tnfα fc融合蛋白的半衰期的影响，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如通过测量已经施用放射性标记抗体的受试者的血液或器官中的放射性水平。为了确定糖基化对抗tnfα fc融合蛋白的稳定性(例如，聚集或蛋白质解折叠的水平)的影响，可使用本领域技术人员已知的任何技术，例如差示扫描量热法(dsc)、高效液相色谱法(hplc)(例如，尺寸排阻高效液相色谱法(sec-hplc))、毛细管电泳、质谱或浊度测量。
[0273]
在用于本文所述的方法中的huptm抗tnfα fc融合蛋白上存在唾液酸可能影响huptm抗tnfα fc融合蛋白的清除率。因此，huptm抗tnfα fc融合蛋白的唾液酸模式可以用于生成具有优化清除率的治疗剂。评估抗tnfα fc融合蛋白清除率的方法是本领域已知的。
[0274]
在另一个具体的实施方案中，n-糖基化赋予的益处是减少聚集。被占据的n-糖基化位点可以掩盖容易聚集的氨基酸残基，从而使得聚集减少。此类n-糖基化位点可以是本文使用的抗tnfα fc融合蛋白的天然位点或被工程化到本文使用的抗原结合片段中，从而产生当表达时(例如，在人细胞中表达时)更不易聚集的huptm抗tnfα fc融合蛋白。评估抗体聚集的方法是本领域已知的。参见例如courtois等人，2016，mabs 8：99-112，其以引用的方式整体并入本文。
[0275]
在另一个具体的实施方案中，n-糖基化赋予的益处是降低免疫原性。此类n-糖基化位点可以是本文使用的抗原结合片段的天然位点或被工程化到本文使用的抗原结合片段中，从而产生当表达时(例如，在人眼组织细胞中表达时)更不易具有免疫原性的huptm抗tnfα fc融合蛋白。
[0276]
在另一个具体的实施方案中，n-糖基化赋予的益处是蛋白质稳定性。众所周知，蛋白质的n-糖基化赋予它们稳定性，并且评估由于n-糖基化产生的蛋白质稳定性的方法是本领域已知的。参见例如sola和griebenow，2009，j pharm sci.，98(4)：1223-1245。
[0277]
在另一个具体的实施方案中，n-糖基化赋予的益处是改变结合亲和力。用于测量结合亲和力的测定是本领域已知的。
[0278]
5.4.2o-糖基化
[0279]
o-糖基化包括通过酶将n-乙酰基-半乳糖胺添加到丝氨酸或苏氨酸残基。已经证明存在于抗tnfα fc融合蛋白的铰链区中的氨基酸残基可以被o-糖基化。在某些实施方案中，抗tnfα fc融合蛋白包含其铰链区的全部或部分，因此当在人细胞中表达时能够被o-糖基化。与例如大肠杆菌中产生的抗tnfα fc融合蛋白相比，o-糖基化的可能性赋予本文提供的抗tnfα fc融合蛋白另一个优势，同样是因为大肠杆菌天然不含有与人o-糖基化中使用的机制等同的机制。(相反，大肠杆菌中的o-糖基化只有当细菌被修饰以含有特定的o-糖基化机制时才能被证明。参见例如farid-moayer等人，2007，j.bacteriol.189：8088-8098。)o-糖基化抗tnfα fc融合蛋白由于具有聚糖而与n-糖基化抗tnfα fc融合蛋白(如上所述)
共享有利特性。
[0280]
5.5用于非感染性葡萄膜炎的载体化huptm抗tnfα fc融合蛋白构建体和制剂
[0281]
描述了用于递送huptm抗tnfα fc融合蛋白诸如与肿瘤坏死因子-α(tnfα)结合的tnfr1：fc融合蛋白或tnfr2：fc融合蛋白，诸如依那西普或eys606(图2a和图2b)并且指示用于治疗非感染性葡萄膜炎的组合物和方法。在某些实施方案中，huptm抗tnfα fc融合蛋白具有依那西普或eys606或者它们的生物类似物或生物改良物的氨基酸序列。融合蛋白的人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分以及fc结构域的氨基酸序列在图2a和图2b以及表6中提供。递送可经由基因疗法来完成，例如通过将编码治疗性抗tnfα fc融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体(和/或其高糖基化衍生物或其他衍生物)施用于被诊断具有非感染性葡萄膜炎的一种或多种症状的患者(人受试者)，以产生将huptm(例如，人糖基化转基因产物)持续供应至眼组织的永久贮库。
[0282]
转基因
[0283]
提供了含有编码与tnfα结合的huptm抗tnfα fc融合蛋白的转基因的重组载体，所述重组载体可以被施用以在患者体内递送huptm抗tnfα fc融合蛋白。转基因是包含编码抗tnfα fc融合蛋白(诸如依那西普或eys606，或如本文详述的它们的变体)的核苷酸序列的核酸，该融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分以及fc结构域。转基因还可编码含有另外的糖基化位点的抗tnfα fc融合蛋白(例如参见courtois等人)。
[0284]
在某些实施方案中，抗tnfα转基因包含编码tnfr2：fc融合蛋白依那西普(具有seq id no：10或11的氨基酸序列，参见表6和图2a)的核苷酸序列。核苷酸序列可被密码子优化以在人细胞中表达。核苷酸序列可例如包含seq id no：13-18的核苷酸序列(编码如表7中所示的依那西普转基因序列)。tnfr2：fc融合序列具有在n端的适于在人细胞、特别是一种或多种眼组织细胞中表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有氨基酸序列myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)。另选地，该信号序列可具有选自表2中所示的信号序列中任一种的对应于由一种或多种眼组织细胞分泌的蛋白质的氨基酸序列。另选地，该信号序列可适于在肌肉或肝脏细胞中表达，诸如下文在表3和表4中所列的那些。
[0285]
除了tnfr 2型结构域的可溶性细胞外蛋白以及包括ch2和ch3结构域序列的fc恒定区之外，转基因还可包含在重链ch2结构域序列的n端的铰链区的全部或部分。在具体的实施方案中，fc结构域具有seq id no：4的氨基酸序列，该氨基酸序列具有在n端的另外的铰链区序列(例如，具有铰链的seq id no：3)或含有氨基酸序列epkscdkthtcppcpapellgg(seq id no：145)的全部或部分，并且具体地为epkscdkthl(seq id no：146)、epkscdktht(seq id no：147)、epkscdkthtcppcpa(seq id no：148)、epkscdkthlcppcpa(seq id no：149)、epkscdkthtcppcpapellggpsvfl(seq id no：150)或epkscdkthlcppcpapellggpsvfl(seq id no：151)。抗tnfα fc融合蛋白的fc结构域可具有seq id no：3或4的氨基酸序列(表6)或者igg1 fc结构域(诸如图4所示)或者其突变体或变体。fc结构域可被工程化以改变与一种或多种fc受体的结合和/或效应功能，如下文在第5.2.8节中公开。
[0286]
依那西普的表达可由组成型或组织特异性启动子指导。在某些实施方案中，转基因含有cag启动子(seq id no：51)、cb启动子(seq id no：159)、cb长启动子(seq id no：161)、grk1(seq id no：54)启动子或best1/grk启动子(seq id no：161)。另选地，启动子可
以是组织特异性启动子(或包括启动子和增强子元件的调控序列)，诸如grk1启动子(seq id no：54或117)、(小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)或best1/grk启动子(seq id no：161)。关于示出基因组配置的示意图参见图1。转基因可含有表1中提供的元件。编码依那西普的示例性转基因在表7中提供并且包括cag.依那西普(seq id no：16)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：18)。itr序列被添加到构建体的5
′
和3
′
端以生成产生cag.依那西普(seq id no：15)和u1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17)的基因组。在某些实施方案中，构建体是自身互补的构建体。转基因可被包装到aav中，特别是aav2.7m8、aav8、aav3b或aavrh73中。
[0287]
在某些实施方案中，转基因编码包含tnfr 2型结构域的可溶性细胞外部分的抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：2中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，转基因编码包含fc结构域的抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：3中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，转基因编码抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：10或11中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，tnfr2：fc融合蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列seq id no：10或11，并且进行所述取代、插入或缺失。
[0288]
在某些实施方案中，抗tnfα转基因包含编码tnfr1：fc融合蛋白eys606(具有seq id no：12的氨基酸序列，参见表6和图2b)的核苷酸序列。核苷酸序列可被密码子优化以在人细胞中表达。tnfr1：fc融合蛋白具有在n端的适于在人细胞、特别是一种或多种形成视网膜的细胞中表达和分泌的信号或前导序列。信号序列可具有氨基酸序列myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)。另选地，该信号序列可具有选自表2中所示的信号序列中任一种的对应于由一种或多种眼组织细胞分泌的蛋白质的氨基酸序列。另选地，该信号序列可适于在肌肉或肝脏细胞中表达，诸如下文在表3和表4中所列的那些。
[0289]
除了tnfr 1型结构域的可溶性细胞外蛋白以及包括ch2和ch3结构域序列的fc恒定区之外，转基因还可包含在重链ch2结构域序列的n端的凝血酶切割位点lvprgs(seq id no：8)和铰链区的全部或部分。在具体的实施方案中，fc结构域具有seq id no：3的氨基酸序列或具有在n端的铰链区序列，该铰链区序列含有氨基酸序列dkthtcppcpapellgg(seq id no：21)的全部或部分，并且具体地为dkthtcppcpa(seq id no：154)、dkthlcppcpa(seq id no：155)、dkthtcppcpapellggpsvfl(seq id no：152)或dkthlcppcpapellggpsvfl(seq id no：156)。抗tnfα fc融合蛋白的fc结构域可具有seq id no：10的氨基酸序列(表6)。fc结构域可被工程化以改变与一种或多种fc受体的结合和/或效应功能，如下文在第5.2.8节中公开。
[0290]
eys606的表达可由组成型或组织特异性启动子指导。在某些实施方案中，转基因含有cag启动子(seq id no：51)或grk1(seq id no：54)启动子。另选地，启动子可以是组织特异性启动子(或包括启动子和增强子元件的调控序列)，诸如grk1启动子(seq id no：54或117)、(小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红视蛋白(redo)启动子
(seq id no112)或best1/grk启动子(seq id no：161)。转基因可含有表1中提供的元件。编码eys606的示例性转基因可使用本领域已知的方法来生成。itr序列被添加到构建体的5
′
和3
′
端以生成基因组。转基因可被包装到aav中，特别是aav8、aav3b或aavrh73中。
[0291]
在某些实施方案中，转基因编码包含tnfr 1型结构域的可溶性细胞外部分的抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：1中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，转基因编码包含fc结构域的抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：6中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，转基因编码抗tnfα fc融合蛋白，该融合蛋白包含与seq id no：12中所示的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在具体的实施方案中，tnfr1：fc融合蛋白包含tnfr 1型结构域的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列seq id no：1，并且进行所述取代、插入或缺失。在具体的实施方案中，tnfr1：fc融合蛋白包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的氨基酸序列seq id no：12，并且例如在构架区中进行所述取代、插入或缺失。
[0292]
基因疗法方法
[0293]
提供了通过施用含有编码抗tnfα融合蛋白的转基因的病毒载体来治疗人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法。融合蛋白可以是依那西普或eys606或者它们的生物改良物或生物类似物。在实施方案中，患者已被诊断患有非感染性葡萄膜炎和/或具有与非感染性葡萄膜炎相关的症状。用于递送转基因的重组载体在第5.2节中描述。此类载体应对人眼组织细胞具有嗜性，并且可以包括非复制型raav，特别是带有aav8衣壳、aav3b衣壳或aavr73衣壳的那些。另选地，带有aav2.7m8或aav9衣壳的载体可以用于眼部适应症。重组载体(诸如图1中所示的重组载体)可以以使得重组载体进入一种或多种眼组织细胞类型的任何方式(例如，通过将重组载体引入眼睛中)施用。关于有关治疗方法的详细信息参见第5.3节。
[0294]
提供了通过施用含有编码抗tnfα融合蛋白的转基因的病毒载体来治疗人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法。融合蛋白可以是依那西普或eys606。在实施方案中，患者已被诊断患有非感染性葡萄膜炎和/或具有与非感染性葡萄膜炎相关的症状。用于递送转基因的重组载体在第5.2节中描述，并且示例性转基因在上文中提供。此类载体应对人眼组织细胞具有嗜性，并且可以包括非复制型raav，特别是带有aav3b、aav8或aavrh73衣壳的那些。重组载体(诸如图2a和图2b中所示)可以以使得重组载体进入眼组织的任何方式施用。在具体的实施方案中，转基因是aav8载体中的seq id no：13-18(参见表7)。
[0295]
施用这种基因疗法的受试者可以是那些对抗tnfα疗法有反应的那些。在某些实施方案中，所述方法包括治疗已被诊断患有非感染性葡萄膜炎或者具有与其相关的一种或多种症状并且被鉴定为对用抗tnfα抗体、抗tnfα fc融合蛋白治疗有反应或者被认为是用抗tnfα抗体或抗tnfα fc融合蛋白的疗法的良好候选者的患者。在具体的实施方案中，患者先前已用依那西普、阿达木单抗、英夫利昔单抗或戈利木单抗治疗，并且已被发现对依那西普、阿达木单抗、英夫利昔单抗或戈利木单抗有反应。在其他实施方案中，患者先前已用抗
tnf-α抗体或融合蛋白诸如依那西普、赛妥珠单抗或其他抗tnf-α剂治疗。为了确定反应性，可将抗tnfα转基因产物(例如，在细胞培养物、生物反应器等中产生)直接施用于受试者。
[0296]
人翻译后修饰的抗tnfα融合蛋白
[0297]
产生huptm抗tnfα融合蛋白应产生用于经由基因疗法来完成的治疗非感染性葡萄膜炎的“生物改良物”分子，例如通过将编码抗tnfα huptm抗tnfα融合蛋白的病毒载体或其他dna表达构建体视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用于被诊断患有非感染性葡萄膜炎或者具有非感染性葡萄膜炎的一种或多种症状的人受试者(患者)，以在一种或多种眼组织(或细胞类型)中产生持续供应由转导的眼组织细胞产生的完全人翻译后修饰(例如，人糖基化)的硫酸化转基因产物的永久贮库。
[0298]
在具体的实施方案中，huptm抗tnfα融合蛋白具有tnfr2结构域的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分与具有如图2a(天冬酰胺(n)糖基化位点、非共有天冬酰胺(n)糖基化位点；如文字说明所示)中所示的依那西普的氨基酸序列的fc结构域融合；在图2a中所示的一个或多个氨基酸位置处具有糖基化、特别是2，6-唾液酸化，包括tnfr2结构域(seq id no：2)的n149或n171和/或fc结构域(seq id no：3)的n317；并且/或者在氨基酸位置t8、t184、s199和/或tnfr2结构域(seq id no：2)的t200和/或铰链区(seq id no：11)的t245中的一个或多个处具有o-连接的糖基化位点。在其他实施方案中，huptm抗tnfα融合蛋白不含有任何可检测的neugc部分和/或不含有任何可检测的α-gal部分。
[0299]
在具体的实施方案中，huptm抗tnfα融合蛋白具有tnfr1结构域的可溶性细胞外部分，该可溶性细胞外部分与具有如图2b(天冬酰胺(n)糖基化位点、非共有天冬酰胺(n)糖基化位点；如文字说明所示)中所示的esy606的氨基酸序列的fc结构域融合；在如图2b中所示的一个或多个氨基酸位置处具有糖基化、特别是2，6-唾液酸化，包括tnfr1结构域(seq id no：1)的n54、n94或n145和/或fc结构域(seq id no：12)的n294或n358；并且/或者在氨基酸位置t8、t184、s199和/或tnfr2结构域(seq id no：1)的t200和/或铰链区(seq id no：12)的t245中的一个或多个处具有o-连接的糖基化位点。在其他实施方案中，huptm抗tnfα融合蛋白不含有任何可检测的neugc部分和/或不含有任何可检测的α-gal部分。
[0300]
在某些实施方案中，huptm抗tnfα fc融合蛋白在治疗上有效，并且是至少0.5％、1％或2％糖基化和/或硫酸化的，并且可以是至少5％、10％或甚至50％或100％糖基化和/或硫酸化的。本文提供的基因疗法治疗的目标是减缓或阻止非感染性葡萄膜炎的进展或者缓解非感染性葡萄膜炎的一种或多种症状，诸如减轻患者的疼痛程度、眼睛发红、对光的敏感性和/或其他不适。可通过测量疼痛、眼睛发红和/或畏光的减轻和/或视力的改善来监测功效。
[0301]
本文提供的方法包括将huptm抗tnfα fc融合蛋白递送至眼睛并伴随递送其他可用治疗的组合。附加治疗可在基因疗法治疗之前、与其同时或之后施用。用于患有非感染性葡萄膜炎的受试者的可以与本文提供的基因疗法组合的可用治疗包括但不限于硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、环孢菌素、环磷酰胺、皮质类固醇(局部和/或全身)和其他以及与抗tnfα药剂(包括但不限于依那西普、eys606、阿达木单抗、英夫利昔单抗或戈利木单抗)一起施用。
[0302]
表6.抗tnfα fc融合物氨基酸序列
[0303]
[0304]
[0305][0306]
表7.抗tnfα fc融合物核苷酸序列
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314][0315]
5.6抗tnfαfc融合蛋白的剂量施用
[0316]
任何这种重组载体的治疗有效剂量应以使得重组载体进入眼组织细胞(例如，视网膜细胞)的任何方式(例如，通过将重组载体引入血流中)施用。另选的，可将载体直接施用于眼睛，例如经由视网膜下、玻璃体内、前房内、脉络膜上腔注射。在具体的实施方案中，视网膜下、玻璃体内、前房内、脉络膜上腔、皮下、肌内或静脉内施用载体。视网膜下、玻璃体内、前房内或脉络膜上腔施用应使得可溶性转基因产物在以下视网膜细胞类型中的一种或多种中表达：人光感受器细胞(视锥细胞、视杆细胞)；水平细胞；双极细胞；无长突细胞；视网膜神经节细胞(侏儒细胞、伞状细胞、双层细胞、巨视网膜神经节细胞、光敏神经节细胞和米勒神经胶质细胞)；以及视网膜色素上皮细胞或其他眼组织细胞：角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。
[0317]
转基因产物的表达使得转基因产物在一种或多种眼组织或者眼组织细胞类型(例如，视网膜细胞)中递送和维持。适用于施用的药物组合物包含重组载体在包含生理学上相容的水性缓冲液的配制缓冲液中的悬浮液，该重组载体包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因。配制缓冲液可以包含多糖、表面活性剂、聚合物或油中的一种或多种。
[0318]
另选地，将编码抗tnfα fc融合物的重组载体递送至肝脏，并且抗tnfα fc融合物被表达并分泌到循环中。在具体的实施方案中，包含编码依那西普fc融合蛋白的转基因的载体的施用剂量和途径应使得依那西普fc融合蛋白表达，这实现和维持依那西普融合蛋白的玻璃体内浓度与通过每月以40mg的剂量注射依那西普(amgen)所实现的玻璃体内浓度的水平等效。
[0319]
5.7功效监测
[0320]
可使用用于评估治疗、预防或改善niu的功效的任何方法来评估本文所述的组合物和方法的功效。评估可在动物模型或人受试者中确定。可通过最佳矫正视力(bcva)来测
量对视力缺陷的功效，例如，评估字母或行的数量的增加，并且其中功效可被评估为增加大于或等于2个etdrs行或者增加logmar、根据sun分类降低前房和后房的炎性活性以及/或者降低玻璃体混浊的等级。可使用本领域已知的方法通过光学相干断层扫描来测量眼睛的物理变化。
[0321]
可使用用于评估治疗、预防或改善niu的功效的任何方法来评估本文所述的组合物和方法的功效。评估可在动物模型或人受试者中确定。可通过最佳矫正视力(bcva)来测量对视力缺陷的功效，例如，评估字母或行的数量的增加，并且其中功效可被评估为增加大于或等于2个etdrs行或者增加logmar、根据sun分类降低前房和后房的炎性活性以及/或者降低玻璃体混浊的等级。可使用本领域已知的方法通过光学相干断层扫描来测量眼睛的物理变化。可通过确定突发和/或复发率、前房细胞、玻璃体细胞和玻璃体混浊等级(例如，等级≤0.5+)和/或活动性视网膜或脉络膜(炎性)病变的数量来进一步监测功效(例如参见j.s.等人，int ophthalmol clin.2015summer；55(3)：79-110或rosenbaum j.t.等人，第49卷，第3期，2019年12月，第438-445页；这些文献以引用的方式整体并入本文)。
[0322]
终点可包括但不限于研究眼睛中的玻璃体混浊等级从基线到12、16、20、24或28周或抢救时(如果更早)的平均变化；在12、16、20、24或28周时研究眼睛中没有复发活动性中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎或全葡萄膜炎的反应者的比例；最佳矫正视力从基线到12、16、20、24或28周的平均变化；生活质量/患者报告的结果评估相对于基线的变化；玻璃体混浊等级和前房细胞等级从基线到12、16、20、24或28周的平均变化；或者免疫抑制药物评分从基线到12、16、20、24或28周的变化。
[0323]
6.实施例
[0324]
6.1实施例1：基于依那西普edna的载体
[0325]
构建了基于依那西普cdna的载体，其包含含有编码tnfr：fc融合物依那西普(氨基酸序列为seq id no：10或11)的核苷酸序列的转基因。核苷酸序列是seq id no：13或14的核苷酸序列。转基因还包括编码信号肽(例如，myrmqllllialslalvtns(seq id no：62))的核苷酸序列。关于转基因产物的氨基酸序列参见图2a。该载体另外包括组成型启动子，诸如cag和mu1a，并且可以包括另选启动子，诸如ef1a或cb7或cb(seq id no：159)或cb长(seq id no：160)启动子或者组织特异性启动子(诸如眼组织特异性启动子，特别是grk1启动子(seq id no：54)或best1/grk启动子(seq id no：161))或诱导型启动子(诸如缺氧诱导型启动子)。
[0326]
6.2实施例2：基于eys060 edna的载体
[0327]
构建了基于eys060 cdna的载体，其包含含有编码tnfr：fc融合物eys060(氨基酸序列为seq id no：12)的核苷酸序列的转基因。转基因还包含编码信号肽(例如，myrmqllllialslalvtns(seq id no：62))的核苷酸序列。关于转基因产物的氨基酸序列参见图2b。该载体另外包括组成型启动子，诸如cag、mu1a，并且可以包括另选启动子，诸如ef1a或cb7或cb(seq id no：159)或cb长(seq id no：160)启动子或者组织特异性启动子(诸如眼组织特异性启动子，特别是grk1启动子(seq id no：54)或best1/grk启动子(seq id no：161))或诱导型启动子(诸如缺氧诱导型启动子)。
[0328]
6.3实施例3：tnfα与载体化阿达木单抗igg和fab以及载体化依那西普的跨模型物种结合
[0329]
a.测试了从包括人、小鼠和大鼠在内的模型物种中分离的载体化阿达木单抗候选物对tnfα的结合能力。在顺式质粒转染到293t细胞后，载体化抗体被表达并分泌到细胞上清液中。在elisa中测试细胞上清液，其中用来源于上述物种的重组tnfα包被板(图5a)。阿达木单抗igg有效结合人和小鼠来源的tnfα。fab展示出与人tnfα的结合特征与igg相似。然而，与阿达木单抗igg相比，fab显示出与小鼠tnfα的结合较差。igg和fab都显示出与大鼠tnfα的结合大大降低。
[0330]
b.以相同方式测定载体化依那西普与人、小鼠和大鼠tnfα的结合。依那西普结合人、小鼠和大鼠来源的tnfα中的全部，并且比阿达木单抗更好地结合大鼠tnfα。参见图5b。
[0331]
6.4实施例4：aav介导的非感染性后葡萄膜炎的眼部基因疗法
[0332]
非感染性后葡萄膜炎是一种形式的眼部炎症，会影响眼睛的视网膜和脉络膜并导致失明。它每年折磨着大约38,000名美国人。患者通常用全身性类固醇或皮质类固醇疗法进行治疗，这导致全身并发症的风险很高。2016年，修美乐(阿达木单抗)(一种靶向肿瘤坏死因子α(tnfα)的人单克隆抗体)获得fda批准，成为用于治疗非感染性葡萄膜炎(niu)的唯一全身性非皮质类固醇剂，并且从那时起被广泛使用。在本研究中，将经由局部施用评价载体化抗tnfα fc融合蛋白包括cag.依那西普或mu1a.vh4i.依那西普.scaav或载体化eys606，以及aav8.cag.gfp在小鼠眼组织中的体内aav介导的抗tnfα fc融合蛋白表达。aav8.nul将用作对照载体。还将在啮齿动物eau模型中进行功效研究，以探究aav介导的抗tnfα治疗对niu的治疗潜力。
[0333]
将在体外构建和测试载体化依那西普和eys606序列。将进一步评价野生型小鼠的转导效率和细胞类型特异性。年轻的成年c57bl/6和b10.riii小鼠(8-10周龄)将用于本研究。将在1μl配制缓冲液中以不同剂量(1x107、1x108和1x109vg/眼睛)经由视网膜下(sr)注射将载体(包括cag.依那西普(seq id no：15或16(有和没有侧接itr))或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17或18(有或没有侧接itr序列))或载体化eys606，以及aav8.cag.gfp和aav8.nul)递送至小鼠眼睛。将在sr注射后1、2和4周进行眼底和oct成像。将在施用后5周收集眼部样本。将通过elisa量化眼组织中的抗体或融合蛋白表达水平。将通过用各种视网膜细胞标记物进行免疫荧光染色来确定细胞类型特异性。将选择测试载体用于功效研究。还将探索不同的施用途径(roa)，包括脉络膜上腔、前房内和玻璃体内注射。将使用优选的roa用于功效研究。
[0334]
将通过用人irbp肽免疫在b10.riii小鼠中诱导实验性自身免疫葡萄膜炎(eau)来进行功效研究。t细胞介导的眼部自身免疫反应将在该模型中发生，在诱导后大约11至18天达到峰值。将在诱导eau前2周或后1周经由优选的roa在小鼠眼中施用测试载体。对侧的眼睛将用aav.nul载体递送并用作对照。将在诱导eau后第10、17和30天测试眼底和oct成像、视网膜电图(erg)和视动性眼球震颤(okn)，以监测疾病的进展。将在eau诱导后5周收集眼组织或整个眼球。将通过elisa检测和量化眼组织中的融合蛋白表达水平。将通过组织学和免疫荧光染色评价视网膜结构变化和神经元存活。
[0335]
6.5实施例5：体内研究
[0336]
在本研究中，将经由局部施用(视网膜下(sr)，表8)评价腺相关病毒(aav)载体中的全长和fab阿达木单抗抗体(aav8.cag.阿达木单抗.igg(niu001)和aav8.cag.阿达木单抗.fab(niu002))以及依那西普fc融合蛋白(aav8.cag.依那西普)在小鼠眼组织中体内aav
介导的抗体表达。
[0337]
表8.研究布局
[0338][0339]
已在体外构建和测试了载体化阿达木单抗和依那西普序列。年轻的成年b10.riii小鼠(6-8周龄)用于本研究。将在1μl配制缓冲液中以两种不同剂量(1x108和1x109vg/眼睛)经由视网膜下(sr)注射将载体(包括aav8.cag.阿达木单抗.igg、aav8.cag.阿达木单抗.fab、aav8.cag.依那西普)和媒介物递送至小鼠眼睛(表8)。
[0340]
在sr注射后2和4周进行眼底和oct成像。在施用后4周收集眼部样本。通过elisa量化眼组织中的抗体或融合蛋白表达水平。通过用各种视网膜细胞标记物进行免疫荧光染色来确定细胞类型特异性。在施用后2周和4周通过组织学和免疫荧光染色评价视网膜结构变化和神经元存活。
[0341]
6.6实施例6：载体表达的依那西普结合动力学的评价
[0342]
将评估载体化依那西普从由顺式质粒产生的aav的表达和纯化。将在各种配体结合测定中将纯化的载体化依那西普与各种tnfα蛋白结合的动力学与商业生产的依那西普进行比较。
[0343]
使用biacore
tm
(表面等离子共振(spr))测定的结合亲和力：进行一项研究以使用biacoret200测量不同tnf-α(tnfα)分子与纯化的tnfr融合蛋白的结合亲和力。首先，将tnfα与paav.cag.依那西普产生的融合蛋白的结合亲和力和tnfα与商业依那西普的结合进行比较。其次，测试来自不同物种的tnfα的结合亲和力，以便确定各种物种tnfα蛋白对稍后的动物模型研究的适用性。在25℃下使用hbs-ep+作为运行缓冲液进行biacore测定。通过fc捕获方法(捕获时间为15-20分钟)将稀释的融合蛋白捕获在传感器芯片上。可以单独测试不同物种的tnfα蛋白(人、猕猴、猪、小鼠、犬、兔和大鼠)作为分析物，然后在解离阶段注射运行缓冲液。计算解离率[koff＝kd＝蛋白质解离率；kon＝ka＝蛋白质缔合率；kd＝koff/kon]，并且kd值越小(越低)表明tnfr融合蛋白对其靶标的亲和力越大。
[0344]
表9.测定设置
[0345]
配体分析物依那西普人tnfαpaav.cag.依那西普人tnfα依那西普猕猴tnfαpaav.cag.依那西普猕猴tnfα
依那西普猪tnfαpaav.cag.依那西普猪tnfα依那西普小鼠tnfαpaav.cag.依那西普小鼠tnfα依那西普犬tnfαpaav.cag.依那西普犬tnfα依那西普兔tnfαpaav.cag.依那西普兔tnfα依那西普大鼠tnfαpaav.cag.依那西普大鼠tnfα
[0346]
不同物种tnfα与载体化依那西普与商业依那西普的结合亲和力(kd)将根据它们的kd值进行排序。
[0347]
6.7实施例7：tnf融合蛋白效应功能的测量
[0348]
将通过体外测定来评价载体产生的依那西普的效应功能、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)，并将它们与商业生产的依那西普(enbrel)进行比较。效应功能是通过抗体的fc结构域和因此包含fc结构域的融合蛋白(诸如依那西普)引发的。
[0349]
材料和方法
[0350]
将靶细胞(cho/dg44-tm tnfα；genscript目录号rd00746)在37℃和5％co2下用相应的完全培养基维持。将效应细胞(外周血单核细胞，pbmc；saily bio目录号xfb-hp100b)在37℃下解冻，并在37℃和5％co2下用1640完全培养基维持。
[0351]
对于adcc剂量反应测定，cho/dg44-tm tnfα和pbmc可以分别用作靶细胞和效应细胞。在将e/t(效应细胞与靶细胞)比率设置为25∶1时，依那西普(商业)和抗cho/dg44-tm tnfα的人igg1分别用作阳性和阴性对照。简而言之，方法步骤是：
[0352]
cho/dg44-tm tnfα(靶细胞)
[0353]
+
[0354]
样品
[0355]
+
[0356]
pbmc(效应细胞)
[0357]
↓
[0358]
靶细胞裂解％
[0359]
将效应细胞(pbmc)解冻并用测定缓冲液(检测试剂盒(promega，目录号g7573)重新悬浮。还将靶细胞解冻并用adcc测定缓冲液重新悬浮，然后按照板图在悬浮液中转移到测定板。也将溶液中的对照和测试样品转移到测定板，并将测定板在室温下孵育30分钟。根据e/t比率调节效应细胞密度，然后将效应细胞悬液转移至测定板。然后将测定板在细胞培养箱(37℃/5％co2)中孵育6小时，取出，然后将测定板的相应孔的上清液转移至另一个96孔测定板。将ldh混合物(ldh细胞毒性检测试剂盒，roche目录号11644793001)转移至第二个96孔测定板的相应孔中，并用(bmg labtech)酶标仪读取发光/吸光度。
[0360]
对于cdc剂量反应研究，cho/dg44-tm tnfα可以用作靶细胞。使用5％nhsc(正常人血清补体)，依那西普和抗cho/dg44-tm tnfα的人igg1可以分别用作阳性和阴性对照。简而言之，cdc测定方法步骤是：
[0361]
cho/dg44-tm tnfα(靶细胞)
[0362]
+
[0363]
样品
[0364]
+
[0365]
nhsc
[0366]
↓
[0367]
靶细胞裂解％
[0368]
通过离心收获靶细胞并用测定缓冲液(celltiter-检测试剂盒(promega，目录号g7573)重新悬浮。在含有cdc测定缓冲液的溶液中制备样品和对照。调节靶细胞密度，然后将细胞悬液转移至测定板。还将工作溶液中的对照和测试样品转移至测定板，然后将测定板在室温下孵育30分钟，然后将正常人血清补体(nhsc)工作溶液(quidel目录号a113)添加到测定板中。将测定板在细胞培养箱(37℃/5％co2)中孵育4小时，取出，并将cell titer-工作溶液添加到相应孔中，并将板在室温下孵育约10-30分钟。在fsx(bmg labtech)酶标仪上读取发光数据以确定活细胞的数量。从fsx系统导出adcc和cdc研究的原始数据，并使用microsoft office excel 2016和graphpad prism 6软件进行分析。adcc％靶细胞裂解的公式＝100*(od样品-od肿瘤细胞加效应细胞)/(od最大释放-od最小释放)。cdc％靶细胞裂解的公式＝100*(1-(rlu样品-rlunhsc)/(rlu细胞+nhsc-rlunhsc))。如下使用四参数函数获得相对ec50值，该函数表征其中％靶细胞裂解与测试样品浓度的关系的s形曲线：y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((logec50-x)*hill斜率))＝靶细胞裂解的百分比；并且x＝浓度。
[0369]
在e/t比率为25∶1时，cho/dg44-tm tnfα细胞可以用作adcc剂量反应研究中的靶细胞。计算阳性对照(商业依那西普)、样品和阴性对照(人igg1)的剂量反应和最佳拟合值(例如，ec50)。
[0370]
在利用5％nhsc时，cho/dg44-tm tnfα细胞用作cdc剂量反应研究中的靶细胞。计算阳性对照(依那西普)、样品和阴性对照(人igg1)的剂量反应和最佳拟合值(例如，ec50)。
[0371]
将aav-依那西普adcc和cdc活性与商业依那西普进行比较。不受任何一种理论的束缚，由于翻译后修饰(诸如糖基化)，可能会观察到差异，预计这会因商业依那西普的制造细胞培养物而不同。
[0372]
等效案
[0373]
尽管参考具体实施方案详细描述了本发明，但是应当理解，功能上等效的变型在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述和附图，除了本文示出和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效案。此类等效案意图由以下权利要求书涵盖。
[0374]
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本说明书，所
述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式整体并入本文一般。

技术特征：
1.一种用于治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含腺相关病毒(aav)载体，所述aav载体具有：(a)对眼组织细胞具有嗜性的病毒衣壳；以及(b)包含侧接aav内部串联重复序列(itr)的表达盒的人工基因组，其中所述表达盒包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在人眼细胞中表达的一个或多个调控序列；其中所述aav载体被配制用于视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用于所述人受试者。2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接。3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述病毒衣壳与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。4.如权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述aav衣壳是aav8、aav3b、aav2.7m8或aavrh73。5.如权利要求1至4所述的药物组合物，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。6.如权利要求1至5所述的药物组合物，其中所述调控序列包括来自表1或表1a的调控序列。7.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述调控序列是人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)、人红视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)、cb启动子(seq id no：159)、cb长启动子(seq id no：160)或best1/grk启动子(seq id no：161)。8.如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因编码在所述抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述人眼细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)或者来自表2的信号序列。10.如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因从n端至c端具有以下结构：信号序列-可溶性tnfr细胞外结构域-铰链区-fc结构域-polya。11.如权利要求10所述的组合物，其中所述转基因还包含在所述可溶性tnfr细胞外结构域的c端的seq id no：8的凝血酶切割位点。12.如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白被表达为二聚体融合蛋白。13.如权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是依
那西普或eys606。14.如权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述转基因包含seq id no：13-18的核苷酸序列。15.如权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白具有seq id no：10、11或12的氨基酸序列。16.如权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是高糖基化突变体，或者其中所述抗tnfα fc融合蛋白的所述fc多肽是糖基化的或无糖基化的。17.如权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述fc结构域是igg1-fc结构域。18.如权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述人工基因组是自身互补的。19.如权利要求1至18中任一项所述的药物组合物，其中所述人工基因组是构建体cag.依那西普(seq id no：15)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17)。20.一种包含腺相关病毒(aav)载体的组合物，所述aav载体具有：a.病毒aav衣壳，所述病毒aav衣壳任选地与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。b.包含侧接aav反向末端重复序列(itr)的表达盒的人工基因组，其中所述表达盒包含编码抗tnf-α fc融合蛋白的转基因，所述tnf-α fc融合蛋白包含人可溶性tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)细胞外结构域，所述细胞外结构域通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；其中所述转基因编码在所述抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述抗tnfα fc融合物在眼组织细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。21.如权利要求20所述的组合物，其中所述转基因还包含在所述可溶性人tnfr细胞外结构域的c端的seq id no：8的凝血酶切割位点。22.如权利要求20或21中任一项所述的组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白具有seq id no：10、11或12的氨基酸序列。23.如权利要求20至22所述的组合物，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是依那西普或eys606。24.如权利要求20至23所述的组合物，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。25.如权利要求20至24所述的组合物，其中所述转基因包含seq id no：13或14的核苷酸序列。26.如权利要求20至25所述的组合物，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns
(seq id no：62)或者来自表2或表3的信号序列。27.如权利要求20至26中任一项所述的组合物，其中所述人工基因组是自身互补的。28.如权利要求20至27中任一项所述的组合物，其中所述人工基因组是构建体cag.依那西普(seq id no：15或16)或mu1a.vh4i.依那西普.scaav(seq id no：17或18)。29.一种治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用治疗有效量的包含重组aav的组合物，所述重组aav包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列。30.一种治疗有需要的人受试者的非感染性葡萄膜炎的方法，所述方法包括：向所述受试者视网膜下、玻璃体内、鼻内、前房内、脉络膜上腔或全身施用治疗有效量的重组核苷酸表达载体，所述重组核苷酸表达载体包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，所述转基因可操作地连接至控制所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列，使得形成释放人翻译后修饰(huptm)形式的抗tnfα fc融合蛋白的贮库。31.如权利要求29和30所述的方法，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。32.如权利要求29至31所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含与igg fc结构域共价连接的人可溶性tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)细胞外结构域。33.如权利要求29至32所述的方法，其中所述转基因是依那西普或eys606。34.如权利要求29至33所述的方法，其中所述转基因具有seq id no：13-18的核苷酸序列。35.如权利要求29至34所述的方法，其中所述病毒衣壳与aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型aav2.7m8、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)的氨基酸序列具有至少95％同一性。36.如权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述aav衣壳是aav8、aav2.7m8、aav3b或aavrh73。37.如权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述调控序列包括来自表1或表1a的调控序列。38.如权利要求37所述的方法，其中所述调控序列是人视紫红质激酶(grk1)启动子(seq id no：54或117)、小鼠视锥阻遏蛋白(car)启动子(seq id no：114-116)或人红视蛋白(redo)启动子(seq id no：112)。39.如权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述转基因编码在所述抗tnfα fc融合蛋白的n端的指导所述人眼组织细胞中的分泌和翻译后修饰的信号序列。40.如权利要求39所述的方法，其中所述信号序列是myrmqllllialslalvtns(seq id no：62)或者来自表2或表3的信号序列。41.如权利要求25至40中任一项所述的方法，其中所述转基因具有以下结构：信号序
列-9人可溶性tnfr细胞外结构域(1型或2型)-铰链区-fc结构域-polya。42.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因还包含在所述人可溶性tnfr细胞外结构域的c端的具有seq id no：8的凝血酶切割位点。43.如权利要求29至42中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是高糖基化突变体，或者其中所述抗tnfα fc融合蛋白的所述fc结构域是糖基化的或无糖基化的。44.如权利要求29至43中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白含有α2，6-唾液酸化聚糖。45.如权利要求29至44中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白是糖基化的，但不含有可检测的neugc和/或α-gal。46.如权利要求29至45中任一项所述的方法，其中所述抗tnfα fc融合蛋白含有酪氨酸硫酸化。47.如权利要求29至46中任一项所述的方法，其中所述huptm形式的所述抗tnfα fc融合蛋白的产生通过用所述重组核苷酸表达载体转导培养的人眼细胞并表达所述抗tnfα fc融合蛋白来证实。48.如权利要求29或47所述的方法，其中所述治疗有效量被确定为足以使最佳矫正视力(bcva)提高＞＝2个etdrs行或增加logmar、根据sun分类降低前房和后房的炎性活性以及/或者降低玻璃体混浊的等级。49.如权利要求29至48中任一项所述的方法，其中所述raav是自身互补的。50.如权利要求29至49中任一项所述的方法，其中所述转基因在构建体cag.依那西普或mu1a.vh4i.依那西普.scaav内。51.一种产生重组aav的方法，所述方法包括：(c)培养宿主细胞，所述宿主细胞含有：(i)人工基因组，所述人工基因组包含侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码抗tnfα fc融合蛋白的转基因，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；(ii)缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和aav衣壳蛋白，所述aav rep和aav衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和aav衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述aav rep和aav衣壳蛋白的表达控制元件，其中所述衣壳具有眼组织嗜性；(iii)足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组；以及(d)从所述细胞培养物中回收包裹所述人工基因组的重组aav。52.如权利要求51所述的方法，其中所述眼组织细胞是角膜细胞、虹膜细胞、睫状体细胞、施莱姆氏管细胞、小梁网细胞、视网膜细胞、rpe-脉络膜组织细胞或视神经细胞。53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述转基因编码依那西普或eys606，其中所述aav衣壳蛋白是根据实施方案1所述的raav衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白来自aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型2.7m8、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、
血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型rh8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)中的至少一种aav血清型。54.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有：d.人工基因组，所述人工基因组包含侧接aav itr的顺式表达盒，其中所述顺式表达盒包含编码抗tnfα融合蛋白的转基因，其中所述抗tnfα fc融合蛋白包含人tnfα受体i型(tnfr1)或ii型(tnfr2)的可溶性细胞外部分，所述可溶性细胞外部分通过肽键与包含免疫球蛋白重链的fc结构域的多肽共价连接，所述转基因可操作地连接至促进所述转基因在人眼组织细胞中表达的一个或多个调控序列；e.缺少aav itr的反式表达盒，其中所述反式表达盒编码aav rep和aav衣壳蛋白，所述aav rep和aav衣壳蛋白可操作地连接至驱动所述aav rep和aav衣壳蛋白在培养的所述宿主细胞中表达并反式提供所述aav rep和aav衣壳蛋白的表达控制元件，其中所述衣壳具有眼组织嗜性；f.足够的腺病毒辅助功能，以允许所述aav衣壳蛋白复制和包装所述人工基因组。55.如权利要求54所述的宿主细胞，其中所述转基因编码依那西普或eys606。56.如权利要求53或54所述的宿主细胞，其中所述aav衣壳蛋白是aav血清型1(aav1)、血清型2(aav2)、血清型2.7m8(aav2.7m8)、血清型3(aav3)、血清型3b(aav3b)、血清型4(aav4)、血清型5(aav5)、血清型6(aav6)、血清型7(aav7)、血清型8(aav8)、血清型th8(aavrh8)、血清型9(aav9)、血清型9e(aav9e)、血清型rh10(aavrh10)、血清型rh20(aavrh20)、血清型rh39(aavrh39)、血清型hu.37(aavhu.37)、血清型rh73(aavrh73)或血清型rh74(aavrh74)、血清型hu51(aav.hu51)、血清型hu21(aav.hu21)、血清型hu12(aav.hu12)或血清型hu26(aav.hu26)。

技术总结
提供了用于递送完全人翻译后修饰的治疗性TNF受体Fc融合物的方法和组合物。所述完全人翻译后修饰的治疗性TNF受体Fc融合物能够通过基因疗法方法例如作为重组腺相关病毒(rAAV)载体被递送至适当的组织。还提供了用所述完全人翻译后修饰的治疗性TNF受体Fc融合物治疗眼部适应症诸如非感染性葡萄膜炎的方法。治疗眼部适应症诸如非感染性葡萄膜炎的方法。


技术研发人员：X
受保护的技术使用者：再生生物股份有限公司
技术研发日：2021.10.29
技术公布日：2023/7/20