用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基及应用

1.本发明涉及功能性培养基制备技术领域，具体涉及一种用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基及其应用。


背景技术：

2.微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。常见的检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查等。中国药典2020版规定霉菌和酵母菌微生物限度检查使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，此种培养基使用前需配置并在121℃，15min条件下进行灭菌。灭菌后放至40℃左右进行注皿，待培养基冷却凝固后试验完成。上述技术中的沙氏葡萄糖琼脂培养基需要经热压灭菌后冷却至合适温度进行注皿试验，如温度过高会导致供试液中微生物死亡无法真实反映供试品中真实的微生物数量。温度过低注皿则会凝固或结块，导致供试液无法均匀分散至培养基中，从而后期到达培养时间后菌落存在抱团叠加现象，不利于微生物计数。目前进行霉菌及酵母菌微生物限度检查试验所需用品除培养基外均有灭菌好一次性用品。如一次性培养皿、一次性刻度管、一次性试管等，使用便利。虽然有厂家配置好并完成注皿的一次性培养基，但此类培养基已经凝固，只能进行沉降菌试验或划线接种试验，无法进行微生物限度检查试验，导致进行微生物限度检查试验必须经过热压灭菌这一环节。当无法进行热压灭菌时则无法进行微生物限度检查试验，存在很大局限性。


技术实现要素：

3.为解决上述问题，本发明提供了一种在室温下为液体在适宜培养温度下为固体的用于检查霉菌和酵母菌的微生物限度检查用培养基。本发明克服了传统培养基使用前需要热压灭菌，使用时需掌握注皿温度，无成熟产品可直接购买使用的问题，具体方案如下：一种用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，包括动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、纯化水。
4.进一步地，上述温敏凝胶培养基中，各组分按质量份数计，包括：动物组织胃蛋白酶水解物4-6份，胰酪胨4-7份，无水葡萄糖18-25份，泊洛沙姆188 12-18份，泊洛沙姆407 200-260份，总份数为950-1300份，剩余为纯化水。
5.进一步地，上述温敏凝胶培养基中，各组分按质量份数计，包括：动物组织胃蛋白酶水解物5份，胰酪胨5份，无水葡萄糖20份，泊洛沙姆188 15份，泊洛沙姆407 230份，总份数为950-1300份，剩余为纯化水。
6.进一步地，上述温敏凝胶培养基的制备方法包括：s1、按配方比例称取各组分原材料；s2、将称取的动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖用部分纯化水溶解，得到溶液a；
s3、另取部分纯化水，在连续搅拌下加入泊洛沙姆188、泊洛沙姆407 直至完全溶解，得到溶液b；s4、将溶液b冷藏；s5、将溶液a与冷藏后的溶液b混合均匀，并加入剩余的纯化水，混合均匀；s6、所得产物经灭菌、冷藏后，得到用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基。
7.优选地，s4、s6所述冷藏，包括将溶液置于4℃环境下冷藏24-48h。
8.优选地，s6所述灭菌，包括将所得产物置于灭菌锅内，121℃灭菌15min。
9.优选地，s2所述纯化水用量为溶液a中其他原材料质量的9-11倍。
10.优选地，s3所述纯化水用量为溶液b中其他原材料质量的1.5-2.5倍。
11.上述用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基可应用于制备治疗霉菌酵母菌相关疾病的药物。
有益效果
12.本发明的有益效果在于：本发明沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基在室温下为液体状态，在培养箱中温度温为20-25℃的条件下为凝胶状态，符合中国药典中霉菌及酵母菌培养最适温度，ph为5.6左右符合中国药典要求，可通过中国药典中培养基适用性检查可作为霉菌及酵母菌微生物限度检查用培养基。传统琼脂培养基在菌落生长在培养基液面层内时，如需要进一步鉴定菌种试验如质谱检测，划线培养，需将菌落挑出。琼脂培养基在挑出菌落数会伴随琼脂影响进一步试验。温敏凝胶培养基可将其置于冰箱内，培养基会恢复为液体态，更方便与将菌落取出进行进一步检测。同时，本发明提供的培养基使用方便，可一次性热压灭菌后分装使用，无需每次使用前使用灭菌锅进行灭菌。可商品化弥补市场空缺，使微生物限度检查更加便利。
附图说明
13.图1是沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基室温下液体状态照片；图2是沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基在培养温度下凝胶状态照片；图3是沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基与沙氏葡萄糖琼脂培养基对黑曲霉及白色念珠菌培养结果照片，其中左侧为沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，右侧为沙氏葡萄糖琼脂培养基；图4是沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基与沙氏葡萄糖琼脂培养基对黑曲霉及白色念珠菌培养结果照片，其中左侧为沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，右侧为沙氏葡萄糖琼脂培养基；图5是对比例1培养基室温下液体状态照片；图6是对比例1培养基在培养温度下液体状态照片；图7是对比例1在其凝胶温度下凝胶状态照片。
具体实施方式
14.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。
15.除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。本技术全部培养基室温下状态照片为室内正常放置状态稳定后拍摄，室温随天气变化，在合理范围内；全部培养基培养温度/凝胶温度下状态照片，为培养基在维持该特定温度的恒温培养装置中放置状态稳定后，将培养基取出并立即拍摄，照片中拍摄附带的温度显示为该培养基在恒温培养装置的温度，显示温度装置为该恒温培养装置；上述照片证明本发明能够达到应有的效果。
16.表1培养基及试剂信息
17.表2菌种信息
18.实施例1用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基制备：称取下述重量的原料药：动物组织胃蛋白酶水解物5.0g，胰酪胨5.0g，无水葡萄糖
20.0g，泊洛沙姆18815.0g，泊洛沙姆407230.0g。将动物组织胃蛋白酶水解物5.0g，胰酪胨5.0g，无水葡萄糖20.0g用200ml纯化水溶解。另取600ml纯化水，在连续搅拌下加入泊洛沙姆18815.0g，泊洛沙姆407230.0g直至完全溶解，置4℃冰箱内冷藏24h。将两溶液混合均匀并用纯化水加至1000ml。将成品溶液放入灭菌锅内进行121℃，15min热压灭菌。放置4℃冰箱内冷藏即得。
19.实施例2用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基制备：称取下述重量的原料药：动物组织胃蛋白酶水解物4.5g，胰酪胨5.5g，无水葡萄糖19.0g，泊洛沙姆18816.0g，泊洛沙姆407240.0g。将动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖用200ml纯化水溶解。另取600ml纯化水，在连续搅拌下加入泊洛沙姆188、泊洛沙姆407直至完全溶解，置4℃冰箱内冷藏24h。将两溶液混合均匀并用纯化水加至1000ml。将成品溶液放入灭菌锅内进行121℃，15min热压灭菌。放置4℃冰箱内冷藏即得。
20.对比例1称取下述重量的原料药：动物组织胃蛋白酶水解物5.0g，胰酪胨5.0g，无水葡萄糖20.0g，泊洛沙姆18815.0g，泊洛沙姆407230.0g。将动物组织胃蛋白酶水解物5.0g，胰酪胨5.0g，无水葡萄糖20.0g用200ml纯化水溶解。另取600ml纯化水，在连续搅拌下加入泊洛沙姆18840.0g，泊洛沙姆407160.0g直至完全溶解，置4℃冰箱内冷藏24h。将两溶液混合均匀并用纯化水加至1000ml。将成品溶液放入灭菌锅内进行121℃，15min热压灭菌。放置4℃冰箱内冷藏即得。
21.取以上实施例及对比例所得培养基进行性能检测试验，以下内容以实施例1样品举例：1.胶凝温度的测定：量取凝胶4ml于试管中，放入温度可控的恒温水浴锅中，待溶液凝胶后，记录胶凝时间，取出试管，将试管反转180
°
，观察试管中的凝胶胶凝状态，凝胶开始融化并流动时的温度，即为胶凝温度。
22.经测定胶凝温度为19.7摄氏度，符合中国药典中需氧菌培养温度。
23.2.ph测定：先采用ph4.01标准缓冲溶液、ph7.00标准缓冲溶液、ph9.21标准缓冲溶液对ph计进行自动校正，将配制好的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基溶液分成4份，进行测定，每份沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基溶液测两次，两次ph值的读数相差应不超过0.1，取平均值作为其ph值。
24.表3ph值记录
25.经测定沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基ph值为5.60，符合中国药典5.6
±
0.2要求。
26.3.培养基适用性检查-1：接种白色念珠菌的瓷珠一颗，置10ml沙氏葡萄糖液体培养基中，23℃培养2d。上述新鲜培养物用ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为不大于100cfu和不大于10000cfu的菌悬液备用。
27.取黑曲霉的浓孢子悬液，用含0.05%聚山梨酯80的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数为不大于100cfu和不大于10000cfu的菌悬液备用。
28.取制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（不大于100cfu），分别注入无菌平皿中，倾注配置好的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，置23℃培养箱中待凝胶凝固倒置平皿进行培养，在5天内观察结果。同时用中国药典2020版中（1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）中的沙氏葡萄糖琼脂培养基作为对照培养基替代沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基进行上述实验。若被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5-2范围内，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
29.表4培养基适用性检查结果
30.经上述适用性试验，沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基可适用于需氧菌微生物限度检查。
31.4.培养基适用性检查-2：使用中国医学科学院北京协和医院三种院内制剂进行沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基适用性试验。
32.4.1醋酸溶液（批号20210628）4.1.1供试液制备取本品2瓶，混匀，作为供试品原液。取供试品原液10ml，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。
33.4.1.2沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基适用性试验试验组：分别取供试品原液1ml，置ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，采用薄膜过滤法。以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗3次，每次100ml，在最后一次冲洗液中各加入1ml含菌量不大于100cfu的试验菌液（白色念珠菌、黑曲霉），取滤膜贴于提前凝固好的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基平板上，每种试验菌株平行制备2个皿，测定霉菌酵母菌总数，测定结果见表5，回收比值见表8。
34.供试品对照组：取供试品原液1ml，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表6。
35.菌液对照组：以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试品原液同试验组操作，测定上述制备好的菌液中的活菌数，测定结果见表7。
36.表5试验组菌落计数（cfu/皿）
37.表6供试品对照组菌落计数（cfu/皿）
38.表7菌液对照组菌落计数（cfu/皿）
39.表8需氧菌回收比值测定结果
40.经上述适用性试验，采用沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基进行本品的霉菌和酵母菌总数计数可使回收比值达到要求。
41.4.2薄荷淀粉（批号20210624）4.2.1供试液制备取本品10g，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀，作为1:10的供试液。
42.4.2.2沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基适用性试验试验组：分别取1:10的供试液10ml（2支管），各加入试验菌液（黑曲霉、白色念珠菌）0.1ml，混匀，使1ml供试液含菌量不大于100cfu，取1:10的供试液1ml，注皿，每种试验菌株平行制备2个平皿，测定霉菌酵母菌总数，测定结果见表9，回收比值见表12。
43.供试品对照组：取1:10的供试液10ml，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表10。
44.菌液对照组：以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:10的供试液同试验组操作，测定上述制备好的菌液中的活菌数，测定结果见表11。
45.表9试验组菌落计数（cfu/皿）
46.表10供试品对照组菌落计数（cfu/皿）
47.表11菌液对照组菌落计数（cfu/皿）
48.表12需氧菌回收比值测定结果
49.经上述适用性试验，采用沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基进行本品的霉菌和酵母菌总数计数可使回收比值达到要求。
50.4.3薄酚甘油洗剂（批号20210810）4.3.1供试液制备取本品10ml，加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀，作为1:10的供试液。
51.4.3.2沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基适用性试验试验组：分别取1:10的供试液10ml（2支管），各加入试验菌液（黑曲霉、白色念珠菌）0.1ml，混匀，使1ml供试液含菌量不大于100cfu，取1:10的供试液1ml，注皿，每种试验菌株平行制备2个平皿，测定霉菌酵母菌总数，测定结果见表13，回收比值见表16。
52.供试品对照组：取1:10的供试液10ml，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表14。
53.菌液对照组：以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替1:10的供试液同试验组操
作，测定上述制备好的菌液中的活菌数，测定结果见表15。
54.表13试验组菌落计数（cfu/皿）
55.表14供试品对照组菌落计数（cfu/皿）
56.表15菌液对照组菌落计数（cfu/皿）
57.表16需氧菌回收比值测定结果
58.经上述适用性试验，采用沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基进行本品的霉菌和酵母菌总数计数可使回收比值达到要求。
59.经上述四组适应性试验可观察到传统沙氏葡萄糖琼脂培养基与本发明实施例1制备的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基在进行菌培养时均符合药典中培养基适用性检查规定，菌落平均数的比值在0.5-2范围内，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定；采用实施例2制备的温敏凝胶培养基替换实施例1制备的样品，所得
结论与实施例1相同。而对比例1在常温下以及在培养温度下均呈现液态，凝胶温度在40℃以上（图5-图7），不符合实验要求。该温度下不利于霉菌、酵母菌生长，该温度下进行微生物限度试验的结果无法真实反应被检测样品中微生物的情况，造成患者用药安全存在隐患。因微生物操作使用器具为刻度吸管且取样量为1ml并未使用移液枪，可能造成取样量误差导致取菌数量误差，上述误差在可接受范围内。沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基对于北京协和医院已获得北京市药监局生产批件的三种不同剂型的制剂进行菌检，均可实现回收率比值为0.5-2.0的要求，对于样品不同的前处理方法该培养基具有很好的适应性，可满足日常检验要求。相比沙氏葡萄糖琼脂培养基该培养基对于霉菌酵母菌具有相同的培养能力，更具有使用方法简便，一次性可大量配置储存使用减少培养基配置次数实现商品化的大规模生产的优点。使用时无需监测培养基温度，可进行快速菌检，大幅缩短菌检所用时间。
60.以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

技术特征：
1.一种用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：包括动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、纯化水。2.根据权利要求1所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：各组分按质量份数计，包括：动物组织胃蛋白酶水解物4-6份，胰酪胨4-7份，无水葡萄糖18-25份，泊洛沙姆188 12-18份，泊洛沙姆407 200-260份，总份数为950-1300份，剩余为纯化水。3.根据权利要求1所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：各组分按质量份数计，包括：动物组织胃蛋白酶水解物5份，胰酪胨5份，无水葡萄糖20份，泊洛沙姆188 15份，泊洛沙姆407 230份，总份数为950-1300份，剩余为纯化水。4.根据权利要求1所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：培养基制备方法包括：s1、按配方比例称取各组分原材料；s2、将称取的动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖用部分纯化水溶解，得到溶液a；s3、另取部分纯化水，在连续搅拌下加入泊洛沙姆188、泊洛沙姆407 直至完全溶解，得到溶液b；s4、将溶液b冷藏；s5、将溶液a与冷藏后的溶液b混合均匀，并加入剩余的纯化水，混合均匀；s6、所得产物经灭菌、冷藏后，得到用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基。5.根据权利要求4所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：s4、s6所述冷藏，包括将溶液置于4℃环境下冷藏24-48h。6.根据权利要求4所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：s6所述灭菌，包括将所得产物置于灭菌锅内，121℃灭菌15min。7.根据权利要求4所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：s2所述纯化水用量为溶液a中其他原材料质量的9-11倍。8.根据权利要求4所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基，其特征在于：s3所述纯化水用量为溶液b中其他原材料质量的1.5-2.5倍。9.一种权利要求1-8任一项所述的用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基在制备治疗霉菌酵母菌相关疾病药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于霉菌酵母菌微生物限度检查的沙氏葡萄糖温敏凝胶培养基及应用，涉及功能性培养基制备技术领域，培养基中包括动物组织胃蛋白酶水解物、胰酪胨、无水葡萄糖、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、纯化水。上述培养基在室温下为液体状态，在培养箱中温度温为20-25℃的条件下为凝胶状态，符合中国药典中霉菌及酵母菌培养最适温度，pH为5.6左右符合中国药典要求，可通过中国药典中培养基适用性检查可作为霉菌及酵母菌微生物限度检查用培养基。同时使用方便，可一次性热压灭菌后分装使用，无需每次使用前使用灭菌锅进行灭菌。可商品化弥补市场空缺，使微生物限度检查更加便利。使微生物限度检查更加便利。使微生物限度检查更加便利。


技术研发人员：左玮 李文瀚 张波 张鹏霄 许婷婷 刘建茹 王晨夕
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/7/20