一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法

1.本发明属于软骨组织保存技术领域，具体为一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法。


背景技术：

2.近年来，随着大健康理念深入人心，越来越多的人加入到运动锻炼行列中，但随之也带来关节软骨损伤这一常见现象。然而，关节软骨损伤的修复治疗目前缺乏理想的治疗方法。因此，关节软骨损伤的修复治疗是临床上亟待解决的难题。同种异体骨软骨移植是将供体区的骨软骨组织移植到受体区缺损处，达到修复透明软骨，恢复软骨的生理和机械功能的目的。基础研究和临床研究已经证明，同种异体骨软骨移植是治疗软骨损伤（尤其是大面积软骨损伤）安全有效的治疗手段。然而，在我国同种异体骨软骨移植技术尚未广泛应用的瓶颈是国内尚未建立体外保存活性关节软骨技术。关节软骨在体外组织培养液中保存是一种常见并且十分有前景的组织库技术，然而，在缺乏力学刺激情况下骨软骨组织在组织培养液中体外保存1﹣2周软骨细胞存活率将显著下降，当软骨组织细胞存活率低于70%将会影响移植手术效果以及预后，因而限制了骨软骨组织移植临床应用。
3.关节软骨是载荷组织，在体内处于不断变化的力学环境中实现正常代谢，维持其生物学功能，而体外缺乏力学刺激必然会影响正常关节软骨的生理功能。
4.超声应用于医学领域历史悠久，研究表明，超声刺激能够影响体内软骨细胞的代谢活动，促进合成代谢功能，抑制其分解代谢功能。然而，超声刺激是否提高体外保存骨软骨组织的效果未见报道。


技术实现要素：

5.为解决现有技术体外保存活性关节软骨1-2周后软骨细胞存活率显著下降的问题，本发明提供一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，在体外骨软骨组织保存过程中施加超声刺激，以实现提升体外组织培养保存软骨细胞活性和力学性能效果的目标，并建立了体外组织培养环境中提高软骨体外保存效果的超声刺激新方法。本发明提供的技术方法如下所述：作为本发明的第一个目的，在于提供一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，包括以下步骤：步骤一：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织；步骤二：将体外获取的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于组织培养液中，对骨软骨组织施加超声刺激；超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mw/cm2、频率0.1~5mhz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压。
6.优选的，采用超声刺激装置对骨软骨组织施加超声刺激，所述超声刺激装置选自
超声波治疗仪超声波治疗仪、超声电刺激治疗仪、超声波理疗仪和超声电疗仪。
7.软骨组织细胞存活率是一项公认的检测软骨活性的指标，杨氏模量是检测骨软骨组织力学性能的公认指标，也是组织库产品质量重要指标之一。
8.优选的，所述方法还包括步骤三：超声刺激后，对骨软骨组织在第1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对骨软骨组织的作用及效果。优选的，步骤一中，骨软骨组织取材方法为，无菌取材来自大动物或捐赠的人体四肢关节软骨，所述骨软骨组织取材自非活体大动物或捐赠的人体四肢关节软骨；所述关节软骨为带有长度6.0~28.0mm软骨下骨的骨软骨复合体，可以为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块；所述骨软骨组织取材部位为关节面的负重区。
9.更优选的，步骤一中，骨软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，pbs冲洗后放入无菌培养袋中；更进一步的，步骤一中取材获得的无菌骨软骨组织为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块。其中，骨软骨柱的规格为长度7.0~15.0mm，直径4.5~15mm。
10.在临床应用中，一般在受体关节用环形钻取相应大小的骨软骨柱，然后在软骨损伤区做相同大小的骨隧道，将骨软骨柱打入到骨隧道内，然而，在软骨大面积损伤或多发部位损伤情况下，受体损伤区域为不规则形状，骨软骨柱的使用受限，基于本发明提供的技术，采用关节端完整的骨软骨块在超声刺激保存后，可在使用前将骨软骨块修剪为合适形状大小的骨软骨组织，以适应受体损伤区域。然而该处理过程对供体移植物的强度有较高要求，现有技术保存后的骨软骨其生物力学性能随时间延长而降低，在研究中，发明人惊讶地发现，通过本发明提供的方法进行超声处理，对完整骨软骨块的保存也具有良好的效果，可延缓骨软骨组织生物力学性能的降低，采用本发明方法保存后的完整骨软骨块可经修剪后，可以满足不规则形状的受体损伤区域损伤移植修复的需要。
11.体内软骨组织主要依靠细胞外基质抵抗压缩力和剪切力，细胞外基质结构和功能的完整性是保证软骨生物力学性能的基础，良好的生物力学性能保证关节软骨承受载荷能力。细胞外基质的主要成分是ⅱ型胶原和蛋白多糖，蛋白多糖含量的高低反映了细胞外基质的成分高低，延缓蛋白多糖含量降低，对于细胞外基质抵抗压缩力和剪切力至关重要。
12.在本发明提供的实施例中，经超声处理后的骨软骨柱或者关节端完整骨软骨块的蛋白多糖含量和杨氏模量降低速率低于静态组，可见本发明提供的超声刺激方法延缓了骨软骨组织力学性能降低的速率，可保证更长保存时间内骨软骨组织的力学强度，骨软骨柱可承受力敲入受体孔洞内，或者大块的骨软骨块可进行修剪后使用。
13.优选的，步骤二中所述组织培养液选自dmem培养液、emem培养液和tsmu培养液，dmem培养液和emem培养液为市售的常用组织、细胞培养培养液，作为优选的实施例，本发明使用了tsmu培养液；所述tsmu培养液成分为：每1000ml所述培养液包括，葡萄糖80~125mmol、氨基酸0.1~2.0mmol、抗氧化剂0.2~2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5~60nmol、无机盐1~120mmol、维生素1~9mmol、丙酮酸钠1~2mmol、青霉素50~70u、余去为离子水。无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种组合。所述tsmu培养液为已公开的中国专利申请“一种骨软骨移植物保存液极其制备方法”（申请号为201510093497.0）中所述骨软骨
移植物保存液。所述tsmu培养液在基础培养液的基础上添加抗氧化等成分，在4℃保存条件下，较基础培养液能有效提高软骨体外保存效果。
14.由于培养液和保存条件的不同，不同温度下，软骨组织的保存效果也不同，而本发明方法在4℃、25℃和37℃下均具有良好的保存效果。
15.更优选的，步骤二中超声刺激骨软骨组织的具体操作方法为：将体外获取的带软骨下骨的关节软骨组织置于含有组织培养液的无菌培养袋内，将超声刺激装置的超声探头上均匀地涂抹医用耦合剂，设置超声刺激参数，开启超声，手动匀速的以1~5mm/s的速度在无菌培养袋表面移动超声探头，超声刺激1~60min后，关闭超声。
16.进一步的，所述无菌培养袋中组织培养液的体积为不少于关节软骨组织体积的1.5倍或没过关节软骨的体积。超声处理前在无菌培养袋上、与超声探头接触位置涂抹医用耦合剂。采用超声探头接触无菌培养袋对无菌培养袋对应侧的骨软骨组织进行超声刺激。
17.优选的，步骤三中，通过fda/eb双荧光染色法检测软骨细胞存活率；采用番红o-固绿染色法检测蛋白多糖含量和分布，杨氏模量检测骨软骨组织生物力学性能。
18.本发明的另一个目的在于提供组织库骨软骨保存方法，采用上述一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法对骨软骨进行保存。
19.不同于常规的体内超声处理方法，由于体内处理时，基质为软骨细胞不间断地提供营养物质，并保证软骨细胞正常的生存环境，有利于细胞正常生理结构和功能；而处于体外保存的软骨组织会发生细胞大量凋亡，基质中的主要成分（如蛋白多糖）降解，影响软骨组织的结构和功能。通过本发明提供的方法可有效延缓蛋白多糖含量的降低，维持软骨组织的力学性能，抑制细胞凋亡，延长软骨组织体外保存时间。另一方面，本技术相对于体内的软骨组织超声治疗技术，避免了超声波在不同组织中的衰减，尤其是胶原蛋白含量高的组织对超声波存在吸收、反射和折射作用，例如骨头对频率在0.7-3.3mhz 的治疗性超声波的衰减率为96%，软骨为68%，肌腱为59%，皮肤为39%，该数据摘自《物理因子治疗学》（第三版），isbn号为978-986-6538-55-1，出版年份2009.12，出版社名称：台湾爱斯维尔有限公司，页码：177-178。
20.采用超声处理关节软骨组织，不同于软骨细胞可直接种植于细胞培养皿中，另外，由于超声的特性，只有放置在超声辐射范围中的样本才能接收到超声的刺激，这就限制了培养基中软骨组织的位置放置，目前尚没有对关节软骨组织进行放置的设备，本发明创造性地采用了超声探头对置于组织培养液中的关节软骨组织进行超声处理，达到了很好的效果。无菌培养袋为关节软骨组织提供了良好的无菌环境，本发明提供的超声刺激方式及无菌环境进一步延缓了软骨细胞活性衰减，延长其存活时间。
21.与常用的骨软骨组织在组织液中静态保存方法相比，本发明提供的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法可显著提高软骨细胞存活率及骨软骨组织的生物力学性能，通过激活自噬减少软骨细胞凋亡，提高保存效果，有利于提高骨软骨组织库利用率和临床软骨移植修复技术水平。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：1，目前国内外对于软骨的研究多集中于在软骨细胞水平以及累及到软骨组织改变的骨性关节炎相关疾病的病理生理改变方面；本发明针对提高离体骨软骨组织体外保存效果的目标，提供了通过对置于含组织培养液的无菌培养袋中的骨软骨组织进行超声刺
激，该方法可用于骨软骨柱或者关节端完整骨软骨块，在抑制细胞凋亡的同时延缓了骨软骨组织力学性能降低，从而应用于组织库技术及异体骨软骨移植的技术领域，为异体骨软骨移植提供了更有效的保存方法。
23.2，与现有的骨软骨组织在组织液中静态保存方法相比，本发明提供的方法可显著提高体外骨软骨组织的软骨细胞存活率及骨软骨组织的生物力学性能，通过激活自噬减少软骨细胞凋亡，提高保存效果，有利于提高骨软骨组织库利用率和临床软骨移植修复技术水平。
附图说明
24.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1为发明提供的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法流程图；图2为本发明实施例1中超声刺激骨软骨柱后第1天、7天、14天、21天、28天检测细胞存活率的结果示意图；图3为本发明实施例1中超声刺激骨软骨柱后第1天、7天、14天、21天、28天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图4为本发明实施例1中超声刺激骨软骨柱后第1天、7天、14天、21天、28天检测杨氏模量的结果示意图；图5为本发明实施例1中超声刺激骨软骨柱后采用wstern blot法检测软骨中凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2的超声组和静态保存组示意图；图6为本发明实施例2中超声刺激骨软骨柱后第1天、21天、35天、42天、49天检测细胞存活率的结果示意图；图7为本发明实施例2中超声刺激骨软骨柱后第1天、21天、35天、42天、49天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图8为本发明实施例2中超声刺激骨软骨柱后第1天、21天、35天、42天、49天检测杨氏模量含量的结果示意图；图9为本发明实施例3中超声刺激骨软骨柱第1天、21天、35天、42天、49天检测细胞存活率的结果示意图；图10为本发明实施例3中超声刺激骨软骨柱第1天、21天、35天、42天、49天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图11为本发明实施例3中超声刺激骨软骨柱第1天、21天、35天、42天、49天检测杨氏模量的结果示意图；图12为本发明实施例4中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、7天、14天、21天检测细胞存活率的结果示意图；图13为本发明实施例4中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、7天、14天、21天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图14为本发明实施例4中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、7天、14天、21天检测杨氏模量的结果示意图；图15为本发明实施例5中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测细
胞存活率的结果示意图；图16为本发明实施例5中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图17为本发明实施例5中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测杨氏模量的结果示意图；图18为本发明实施例6中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测细胞存活率的结果示意图；图19为本发明实施例6中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测蛋白多糖含量的结果示意图；图20为本发明实施例6中超声刺激关节端完整骨软骨块第1天、21天、35天检测杨氏模量的结果示意图；图21为本发明实施例1中超声刺激骨软骨柱后采用wstern blot法检测软骨中自噬相关蛋白lc3、p62、beclin1、p-ulk1的超声组和静态保存组示意图。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
28.本发明在大动物和捐赠的人体四肢关节取材，取材骨软骨组织所用的设备为专业的骨软骨移植器械，从而提高取材的准确性和精准度。
29.本发明采用的超声刺激装置包括主机、超声探头和适配器，超声探头发出超声，施加超声刺激。可选择超声波治疗仪或超声电刺激治疗仪等可以提供超声波的装置。本实施例中采用的超声刺激装置商品名为超声理疗仪。本发明还提供了软骨放置装置，包括无菌培养袋和不同成分的培养液。
30.本发明具体操作步骤为：将体外获取的带软骨下骨的关节软骨组织置于含有组织培养液的无菌环境内，将超声探头表面均匀地涂抹医用耦合剂，设置超声刺激参数，按下开关按钮开启超声，手动匀速的以1~5mm/s的速度移动超声探头，超声刺激1~60min后，关闭超声，完成一次超声。
31.所述含有组织培养液的环境采用如下方式实现：采用柔性材质的无菌培养袋，加入组织培养液，所述组织培养液的体积为关节软骨组织体积的1.5倍或没过关节软骨。在超声处理前在无菌培养袋上、与超声探头接触位置涂抹医用耦合剂。采用超声探头接触无菌培养袋对无菌培养袋对应侧的关节软骨进行超声刺激。
32.作为一种实施方式，由于手术用关节软骨组织体积较小，将其置于含有组织培养液的无菌培养袋后，操作人员一手固定无菌培养袋内的关节软骨，另一手持超声探头对关节软骨进行超声处理。
33.本发明采用fda/eb双荧光染色法检测软骨细胞存活率，所述fda/eb双荧光染色法具体过程为：使用骨软骨移植器械在关节远端骨软骨上获取骨软骨柱；固定骨软骨柱，切片厚度为15
µ
m；用fda/eb染液避光孵育20分钟；摊片并用荧光显微镜观察并摄影。绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。
34.采用生物力学测试机检测骨软骨组织杨氏模量。具体操作过程为：去除骨软骨柱的软骨下骨部分，保留软骨部分，使用配套软件，检测软骨的杨氏模量。实验结果以测量3次结果的平均值为准。
35.本发明中用到的基础组织培养液选自tsmu培养液和/或商用细胞组织培养液。
36.所述tsmu培养液为已公开的中国专利申请“一种骨软骨移植物保存液及其制备方法”(申请号：cn201510093497.0)中所述骨软骨移植物保存液，每1000ml所述骨软骨移植物保存液包括：葡萄糖80~125mmol、氨基酸0.1~2.0mmol、抗氧化剂0.2~2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5~60nmol、无机盐1~120mmol、维生素1~9mmol、丙酮酸钠1~2mmol、青霉素50~70u、余为去离子水。所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或几种的组合。本发明中用到的tsmu培养液具体配制步骤为：取葡萄糖14.4g、氨基酸0.21g、抗氧化剂0.23g、碱性成纤维细胞生长因子0.0016g、氯化钠0.60g、维生素1.06g、丙酮酸钠0.22g、青霉素70u和去离子水配制成1000ml溶液，充分搅拌均匀，调节ph值至7.40，过滤除菌，即得，将tsmu培养液放入4℃保存。
37.所述商用细胞组织培养液可采用dmem培养液或emem培养液。
38.本发明提供的一种基于超声刺激提高体外骨软骨组织保存效果的方法，其流程如图1所示，包括以下步骤：步骤一：骨软骨组织取材，具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，pbs冲洗后放入无菌培养袋中；所取的关节软骨为带有长度6.0mm~28.0mm软骨下骨的骨软骨复合体；步骤二：将步骤一体外获取的骨软骨组织置于含有组织培养液的环境内，对骨软骨组织施加超声刺激；所述超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mw/cm2、频率0.1~5mhz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次，以1.0~5.0mm/s的速度进行超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存，结合温度、气压等环境因素体外保存骨软骨组织；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压。
39.步骤三：超声刺激后，骨软骨组织在第1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率，蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对骨软骨组织的作用及效果。
40.下面结合具体实施例对本发明的应用原理作出进一步的描述：实施例1：（1）体外无菌获取新鲜的，大动物和捐赠的人体四肢关节负重区骨软骨柱，直径为4.5mm，长度为10.0mm。
41.（2）超声刺激方案：将体外获取的骨软骨柱置于含有dmem细胞培养液的超声刺激装置内，对骨软骨柱施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为1000mw/cm2、频率0.5mhz、占空比10%，刺激时间为10min/次的组合参数，给予骨软骨柱每2天刺激1次的
超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存培养液并体外；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在4℃，1个标准大气压；（3）在超声刺激后第1天、7天、14天、21天、28天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和杨氏模量，评价超声刺激后的作用效果。如图2所示，超声组第1天软骨细胞存活率95.15%，静态保存组94.88%；超声组第7天软骨细胞存活率84.40%，静态保存组76.30%；超声组第14天软骨细胞存活率74.43%，静态保存组68.12%；超声组第21天软骨细胞存活率65.45%，静态保存组58.13%，差异有统计学意义；超声组第28天软骨细胞存活率52.15%，静态保存组49.73%，差异无统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图3和图4，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率超过70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存骨软骨柱细胞存活率提升的作用时间为14天。
42.（4）探索相关机理：超声刺激后，第28天采用western blot法检测超声组和静态保存组中凋亡相关蛋白caspase-3、bax、bcl-2和自噬相关蛋白（lc3、p62、beclin1、p-ulk1）。提取样本蛋白，进行sds-page凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗、显影，分析目标条带的灰度值。如图5和图21所示，显示超声组促亡蛋白caspase-3和bax蛋白表达比静态保存少，而超声组抗凋亡蛋白bcl-2表达比静态保存组多；关于自噬蛋白表达结果显示，超声组lc3ⅱ/ⅰ、beclin1、p-ulk1蛋白表达高于静态保存组，而p62蛋白表达低于静态保存组；因此，得出结论：超声刺激可能是通过激活自噬抑制细胞凋亡从而提高骨软骨组织体外保存活力。
43.实施例2：（1）遵照无菌原则将大动物和捐赠的人体四肢关节样本固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，使用专用骨软骨采集器械取材圆柱形骨软骨柱（直径约15.0mm，长度约8.0mm），将骨软骨柱骨质面修剪平整，pbs冲洗后放入含有tsmu培养液的无菌培养袋中；（2）超声刺激方案：将体外获取的骨软骨柱置于含有tsmu培养液的超声刺激装置内，对骨软骨柱施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为2000mw/cm2、频率4.0mhz、占空比30%，刺激时间为60min/次的组合参数，每3天刺激1次，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在25℃，1个标准大气压；（3）在超声刺激后第1天、21天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和杨氏模量，评价超声刺激后的作用效果。如图6所示，超声组第1天软骨细胞存活率92.09%，静态保存组91.64%；超声组第21天细胞存活率83.72%，静态保存组77.44%；超声组第35天细胞存活率78.17%，静态保存组71.12%；超声组第42天细胞存活率71.86，静态保存组60.20%；超声组第49天细胞存活率62.18%，静态保存组49.19%，差异有统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图7和图8，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率高于70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存骨软骨柱细胞存活率提升的作用时间为42天。
44.实施例3：
（1）体外无菌获取圆柱形骨软骨柱（直径约8.0mm，长度约12.0mm），将骨软骨柱骨质面修剪平整，pbs冲洗后放入含有tsmu培养液的无菌培养袋中；（2）超声刺激方案：将体外获取的骨软骨柱置于含有tsmu培养液的超声刺激装置内，对骨软骨柱施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为1500mw/cm2、频率1.5mhz、占空比40%，刺激时间为30min/次的组合参数，每周刺激5次，体外保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在37℃，1个标准大气压；（3）在超声刺激后第1天、21天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和杨氏模量，评价超声刺激后的作用效果。如图9所示，超声组第1天软骨细胞存活率91.80%，静态保存组91.64%；超声组第21天细胞存活率81.06%，静态保存组77.44%；超声组第35天细胞存活率78.17%，静态保存组75.71%；超声组第42天细胞存活率67.27%，静态保存组60.20%；超声组第49天细胞存活率56.18%，静态保存组49.19%，差异有统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图10和图11，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率高于70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存骨软骨柱细胞存活率提升的作用时间为35天。
45.如下实施例提供的是对关节软骨块的超声刺激保存方法：本发明的一种典型的实施方法中，如图1所示，一种基于超声刺激提高体外骨软骨组织保存效果的方法包括以下步骤：步骤一：关节端完整骨软骨块取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取负重关节面取材，获取的无菌骨软骨组织为关节端完整骨软骨块，pbs冲洗后放入无菌培养袋中；步骤二：将步骤一体外获取的骨软骨块置于含有组织培养液的环境内，对骨软骨组织施加超声刺激；所述超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mw/cm2、频率0.1~5mhz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次，以1~5mm/s的速度进行超声刺激，结合温度、气压等环境因素体外保存骨软骨组织；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压；步骤三：超声刺激后，关节端完整骨软骨块在第1天、7天、14天、21天、28天、35天检测软骨细胞存活率，蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对关节端完整骨软骨块的作用及效果。
46.下面结合具体实施例对本发明的应用原理作出进一步的描述：实施例4：（1）遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取负重区关节面取材，将获取的骨软骨块组织的骨质面修剪平整，pbs冲洗后放入含有dmem细胞培养液的无菌培养袋中；（2）超声刺激方案：将体外获取的关节端完整骨软骨块置于含有dmem细胞培养液的超声刺激装置内，对关节端完整骨软骨块施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为3000mw/cm2、频率5.0mhz、占空比60%，刺激时间为60min/次的组合参数，每周刺激2次，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在25℃，1个标准大气压；
（3）在超声刺激后第1天、7天、14天、21天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和杨氏模量，评价超声刺激后的作用效果。如图12所示，超声组第1天软骨细胞存活率91.66%，静态组91.19%；超声组第7天软骨细胞存活率82.59%，静态组73.31%；超声组第14天软骨细胞存活率70.44%，静态组60.84%；超声组第21天软骨细胞存活率56.81%，静态组49.05%，差异有统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图13和图14，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率超过70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存关节端完整骨软骨块细胞存活率提升的作用时间为14天。
47.实施例5：（1）体外无菌获取关节端完整骨软骨块，pbs冲洗后放入含有tsmu培养液的无菌培养袋中；（2）超声刺激方案：将体外获取的关节端完整骨软骨块置于含有tsmu培养液的超声刺激装置内，对关节端完整骨软骨块施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为500mw/cm2、频率3.0mhz、占空比50%，刺激时间为40min/次的组合参数，每周刺激4次，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在4℃，1个标准大气压；（3）在超声刺激后第1天、21天、35天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和杨氏模量，评价超声刺激后的作用效果。如图15所示，超声组第1天软骨细胞存活率90.83%，静态组91.33%；超声组第21天软骨细胞存活率78.87%，静态组72.04%；超声组第35天软骨细胞存活率63.26%，静态组55.89%，差异有统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图16和图17，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率超过70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存关节端完整骨软骨块细胞存活率提升的作用时间为21天。
48.实施例6：（1）体外无菌获取关节端完整骨软骨块，pbs冲洗后放入含有tsmu培养液的无菌培养袋中；（2）将体外获取的关节端完整骨软骨块置于含有tsmu培养液的超声刺激装置内，对关节端完整骨软骨块施加超声刺激；所述的超声刺激方法为：按照刺激强度为2500mw/cm2、频率1.0mhz、占空比40%，刺激时间为50min/次的组合参数，每3天刺激1次，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在25℃，1个标准大气压；（3）在超声刺激后第1天、21天、35天检测软骨细胞存活率，评价超声刺激后的作用效果。如图18所示，超声组第1天软骨细胞存活率92.70%，静态组91.33%；超声组第21天软骨细胞存活率75.07%，静态组72.04%；超声组第35天软骨细胞存活率60.04%，静态组55.89%，差异有统计学意义；蛋白多糖含量和杨氏模量检测数据显示如图19和图20，第一天各组杨氏模量差异无统计学意义，在体外保存的其他时间点，超声组的蛋白多糖含量和杨氏模量数值均高于静态保存组，且差异有统计学意义。因此，在保证细胞存活率超过70%的前提下，超声刺激后，组织培养保存关节端完整骨软骨块细胞存活率提升的作用时间为21天。
49.从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：（1）本发明公开的一种基于超声刺激提高体外骨软骨组织保存效果的方法，采用超声刺激，按照刺激强度、频率、占空比的参数组合（0.1~3000mw/cm2、0.1~5mhz、1%~60%），给予骨软骨组织每周2~次，刺激时间为1~60min/次，移动速度为1~5mm/s进行超声刺激，结合无菌环境中温度、湿度、气压等环境因素体外保存骨软骨组织。这种超声刺激产生了抑制细胞凋亡的效应，与静态保存组相比，更好的提高软骨细胞活力，提高骨软骨组织体外保存效果。可为骨软骨组织库保存骨软骨组织提供一种新的保存方法，提高骨软骨组织库组织利用率。
50.（2）本发明提供的骨软骨组织体外保存超声刺激方法可以延长骨软骨柱第42天软骨细胞存活率；同时可以延长关节端完整骨软骨块第21天软骨细胞存活率，为异体移植物提供了一种新的体外保存方法。
51.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织；步骤二：将体外获取的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于组织培养液中，对骨软骨组织施加超声刺激；超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mw/cm2、频率0.1~5mhz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压。2.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，采用超声刺激装置对骨软骨组织施加超声刺激，所述超声刺激装置选自超声波治疗仪、超声电刺激治疗仪、超声波理疗仪和超声电疗仪。3.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，所述方法还包括步骤三：超声刺激后，对骨软骨组织在第1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对骨软骨组织的作用及效果。4.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤一中，骨软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，pbs冲洗后放入无菌培养袋中；所述骨软骨组织取材自非活体大动物或捐赠的人体四肢关节软骨；所述关节软骨为带有长度6.0~28.0mm软骨下骨的骨软骨复合体。5.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤一中取材获得的无菌骨软骨组织为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块；其中，骨软骨柱的规格为长度7.0~15.0mm，直径4.5~15mm。6.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤二中所述组织培养液选自dmem培养液、emem培养液和tsmu培养液；所述tsmu培养液成分为：每1000ml所述培养液包括，葡萄糖80~125mmol、氨基酸0.1~2.0mmol、抗氧化剂0.2~2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5~60nmol、无机盐1~120mmol、维生素1~9mmol、丙酮酸钠1~2mmol、青霉素50~70u、余去为离子水；无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种组合。7.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤二中超声刺激骨软骨组织的具体操作方法为：将体外获取的带软骨下骨的关节软骨组织置于含有组织培养液的无菌培养袋内，将超声刺激装置的超声探头上均匀地涂抹医用耦合剂，设置超声刺激参数，开启超声，手动匀速的以1~5mm/s的速度在无菌培养袋表面移动超声探头，超声刺激1~60min后，关闭超声。8.根据权利要求7所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，所述无菌培养袋中组织培养液的体积为不少于关节软骨组织体积的1.5倍或没过关节软骨的体积；超声处理前在无菌培养袋上、与超声探头接触位置涂抹医用耦合剂；采用超声探头接触无菌培养袋对无菌培养袋对应侧的骨软骨组织进行超声刺激。9.根据权利要求3所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤三中，通过fda/eb双荧光染色法检测软骨细胞存活率；采用番红o-固绿染色法检
测蛋白多糖含量和分布，杨氏模量检测骨软骨组织生物力学性能。10.一种组织库骨软骨保存方法，其特征在于，采用权利要求1~9任一项所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法对骨软骨进行保存。

技术总结
本发明公开了一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，属于软骨组织保存技术领域。所述方法包括以下步骤：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于含有组织培养液的无菌培养袋内，对骨软骨组织施加超声刺激，超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mW/cm2、频率0.1~5MHz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，结合温度、气压等环境因素给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激。本发明提供的方法可显著提高体外保存期间的软骨细胞存活率及骨软骨组织的生物力学性能，通过激活自噬减少软骨细胞凋亡，提高保存效果，有利于提高骨软骨组织库利用率和临床软骨移植修复技术水平。骨移植修复技术水平。骨移植修复技术水平。


技术研发人员：亓建洪 董军 宋洪强 华真 郑茂坤 焦颖 周路
受保护的技术使用者：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/7/20