新型北美萤火虫荧光素酶的变体及应用其的ATP荧光检测试剂的制作方法

新型北美萤火虫荧光素酶的变体及应用其的atp荧光检测试剂
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型北美萤火虫荧光素酶的变体及应用其的atp荧光检测试剂。


背景技术：

2.腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，atp）广泛存在于细菌中并且其含量较稳定，因此atp含量可以指示食品以及其加工环境中微生物的数量和食物被污染的情况，目前这一方法不仅可以用于快速检测食品的安全，还可以检测食品接触面的卫生状况以便于严格控制食品工业的安全生产。
3.目前已建立的用于检测食品以及其加工环境中微生物的数量和食物被污染的情况主要是通过检测atp的含量，常用电泳法（纸电泳法、凝胶电泳法和毛细管电泳法）、光学分析法（分光光度法、生物发光法）和层析法（纸层析法、薄层层析法、离子交换色谱法、高效液相色谱法）。电泳法根据核苷酸分子同时携带酸碱基团，在一定条件下，利用其在电场中的迁移速度不同而实现分离。层析法利用样品各组分之间亲和力、分配系数等化学性质的差异，实现atp与其它杂质的分离。这两种方法均需要实验室仪器和专业人员，且操作时间较长、过程繁琐，限制了在临床检测中的应用。
4.atp生物发光法的主要原理为：在有氧环境中，荧光素在荧光素酶、mg
2+
的催化作用下与atp发生反应生成荧光素-amp复合体并释放出焦磷酸（pyrophosphoric acid，ppi）；荧光素-amp复合体在o2的作用下，进一步生成氧化荧光素并释放出co2、h2o和amp；最终，激发态的氧化荧光素回归基态，发出光子，光子数量可换算成atp的含量。atp生物发光法检测步骤主要包括样品中atp的提取、荧光素-荧光素酶溶液的添加与反应、生物发光值检测3个部分，通过atp生物发光法标准曲线计算，进而反映样品中微生物的量。
5.目前应用最广的商业化克隆的是北美荧火虫（photinus pyralis）荧光素酶，此酶为一个61kda的单链酶，发黄绿光（550 nm-590 nm），生理ph条件下最大发光在562 nm处其生物发光反应非常有效，接近消耗1摩尔lh2产生1个光子（光产量达0.88），结构上包含一个大型n端的活性位点功能域（1-436残基），灵活的连接多肽（436-440残基）和一个相对n末端较小的c末端区域（440-550残基）。n末端和c末端相对接近，形成一个夹心物质在这里反应，活性袋位于n末端，认为c末端区域对腺苷酰作用和氧化步骤很重要。萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂，但在37℃放置3 min就会丧失活性，稳定性极差，对于atp荧光检测试剂的开发带来了一定的困难。目前提高荧光素酶的稳定性主要通过在重组诱导时改造酶的基因结构和加入保护剂来实现。有多种技术手段能够用来提高生物催化剂的热稳定性，包括蛋白质工程、化学修饰、固定化、溶剂中添加稳定剂。蛋白质工程的手段可以分为定向进化和理性设计两类。定向进化是通过体外模拟自然进化的形式筛选高稳定性突变体的技术手段，已经被证实是一种非常有效的提高蛋白会热稳定性的方法。定向进化通常需要进行几轮随机突变，筛选大量的突变体从而获得目的突变株，因此定向进
化的过程耗时耗力。另外定向进化过程通常需要大规模筛选手段，遗憾的是并非所有的酶都能够发展出高通量的筛选策略。理性设计作为另一种蛋白质工程手段，通过分析现有的结构信息与生物化学数据提出一种可能有效的突变策略，然后利用定点突变技术引入突变位点，理性设计方法更有效率，具有普适应同时有潜力发展成为定量预测蛋白质稳定性的算法。
6.荧光素酶的热稳定性还可从溶液中添加保护剂来实现。目前市售的商品化atp荧光检测试剂基本为干粉状态，干粉状态的荧光检测试剂在低温条件下保存较为稳定。但试剂溶解后，其活性和稳定性急剧下降。为了延长其保存时间并维持活性，扩大其应用范围，可尝试往荧光检测试剂中加入各种保护剂，如甘油、牛血清蛋白（bsa）、二硫苏糖醇（dtt）、谷胱甘肽（还原型）等。目前市售的各种atp荧光检测试剂均在一定程度提高了液体试剂的稳定性，但试剂的保存期及热稳定性还不够令人满意，亟需一种能显著提高atp荧光检测试剂热稳定性的试剂配方，为atp荧光检测试剂的大规模应用提供有效的支撑。


技术实现要素：

7.为此，本发明提供一种新型北美萤火虫荧光素酶的变体及应用其的atp荧光检测试剂。
8.为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：本发明实施例提供具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质变体，其中，seq id no. 1中的第354位的谷氨酸被除谷氨酸以外的氨基酸取代，和/或第405位的脯氨酸被除脯氨酸以外的氨基酸取代，和/或第436位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代。
9.本发明的一个实施例中，其中，所述第354位谷氨酸被赖氨酸取代；和/或所述第405位脯氨酸被丝氨酸取代，和/或所述第436位天冬氨酸被丙氨酸取代。
10.本发明的一个实施例中，其中，所述蛋白质变体为seq id no. 4的氨基酸序列。
11.本发明还提供多核苷酸，其编码上述所述的蛋白质变体。
12.本发明还提供一种载体，其包括上述所述的多核苷酸。
13.本发明另一方面还提供一种微生物，其包括上述所述的蛋白质变体，其中，所述微生物属于大肠杆菌（escherichia coli）。
14.本发明的一个实施例中，其中，所述微生物产北美萤火虫荧光素酶。
15.本发明还提供一种atp荧光检测试剂，其包含上述所述的蛋白质变体。
16.本发明的atp荧光检测试剂，还包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量百分数为0.002-0.004％的牛血清白蛋白、浓度为0.5-2.0 mm的二硫苏糖醇、质量百分数为2-4%的海藻糖、质量百分数为3-5%的甜菜碱、质量百分数为10-20%的甘油、浓度为3-7 mm的mgso4。
17.本发明最后还提供一种atp酶检测体系，其包括所述的atp荧光检测试剂，以及荧光素。
[0018]“用另一氨基酸取代”不受限制，只要另一氨基酸是与取代前的氨基酸不同的氨基酸。即，取代不受限制。
[0019]
如本文所用，术语“变体”指代这样的蛋白质：其保守取代和/或修饰的一个或多个氨基酸与限定序列不同，但其保留蛋白质的功能或性质。变体与确定的序列的区别在于取
代、缺失或添加若干氨基酸。这种变体可以总体上通过修饰蛋白质的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸和评价修饰蛋白质的性质来确定。
[0020]
如本文所用，术语“多核苷酸”指代具有预定长度或更长的dna或rna链，其是通过经由共价键连接核苷酸单体而形成的核苷酸长链聚合物。更具体地，多核苷酸指代编码蛋白质变体的多核苷酸片段。
[0021]
本发明中，北美萤火虫荧光素酶的基因突变位点：e354k，p405s，d436a。
[0022]
本发明具有以下优点：本发明的atp荧光检测试剂具有作简便、灵敏、特异、快速且可低温长时间保存的优点，荧光素酶氨基酸突变导致荧光素酶蛋白质空间结构发生改变；并在此基础上摸索糖和一些大分子蛋白对其保护力，进一步提高了该试剂的稳定性。本发明的atp荧光检测试剂便于运输保存，可实现快速检测食品以及其加工环境中微生物的数量和食物被污染的情况，便于市场使用。
附图说明
[0023]
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0024]
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
[0025]
图1为本发明实施例1提供的luc基因突变前后的氨基酸序列比对；图2为本发明实施例1提供的luc-pet-28a纯化后sds-page电泳图。
具体实施方式
[0026]
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
本发明中，atp为腺嘌呤核苷三磷酸，rlu为相对光单位，luc为荧光素酶。
[0028]
本发明中，三羟甲基氨基甲烷购买于amresco公司、虫荧光素购买于上海生工生物、海藻糖购买于国药集团、甜菜碱购买于麦克林、硫酸镁购买于国药集团、牛血清白蛋白购买于西宝生物、二硫苏糖醇购买于罗恩试剂。
[0029]
实施例1、北美萤火虫荧光素酶的突变、表达与纯化
[0030]
1 北美萤火虫荧光素酶的突变、表达与纯化1.1 北美萤火虫荧光素酶的定点突变及密码子优化在基因genbank中查找北美萤火虫荧光素酶基因，登录号为：x84847.1，序列（seq id no. 2）如下：
atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtgtgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggtcacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgcctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacgatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatgtcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccggcgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtccaaattgtaa。
[0031]
本发明突变前的北美萤火虫荧光素酶基因蛋白质氨基酸序列seq id no. 1如下：medaknikkgpapfypledgtageqlhkamkryalvpgtiaftdahievnityaeyfemsvrlaeamkryglntnhrivvcsenslqffmpvlgalfigvavapandiynerellnsmnisqptvvfvskkglqkilnvqkklpiiqkiiimdsktdyqgfqsmytfvtshlppgfneydfvpesfdrdktialimnssgstgspkgvalphrtacvrfshardpifgnqiipdtailsvvpfhhgfgmfttlgylicgfrvvlmyrfeeelflrslqdykiqsallvptlfsffakstlidkydlsnlheiasggaplskevgeavakrfhlpgirqgygltettsailitpegddkpgavgkvvpffeakvvdldtgktlgvnqrgelcvrgpmimsgyvndpeatnalidkdgwlhsgdiaywdedehffivdrlkslikykgcqvapaelesillqhpnifdagvaglpgddagelpaavvvlehgktmtekeivdyvasqvttakklrggvvfvdevpkgltgkldarkireilikakkggkskl。
[0032]
本发明将luc基因354位的谷氨酸突变为赖氨酸；405位的脯氨酸突变为丝氨酸；436位的天冬氨酸突变为丙氨酸。
[0033]
以上突变位点能够使酶发出不同波长的光进而提高酶的热稳定性。选择bamhⅰ和salⅰ作为酶切位点，将基因连接至pet-28a载体上，同时优化密码子适应大肠杆菌表达。经密码子优化后的突变序列（seq id no. 3）如下：atggaagacgcaaaaaacatcaaaaaaggtccggcaccattttatccgctggaggacggcaccgcaggtgaacagctgcacaaggctatgaaacgctacgcgctggtaccgggtaccatcgcatttaccgatgcccacatcgaggttaacattacctacgctgagtatttcgaaatgagcgttcgtctggcagaggccatgaaacgttacggtctgaaca
ccaaccaccgtatcgttgtctgctctgagaactccctgcagttcttcatgccggttctgggcgccctgttcattggcgtcgcggtagctcctgcaaacgatatctacaacgaacgtgaactgctgaactctatgaacatctctcagcctaccgtggttttcgtctccaagaaaggtctgcagaaaatcctgaacgtgcagaagaaactgccgattatccagaaaatcatcatcatggactctaagaccgattatcagggcttccagagcatgtacaccttcgtgacttctcatctgccgccgggctttaacgaatacgacttcgtgccggaatctttcgatcgtgacaaaactatcgccctgatcatgaattcttccggctccaccggcagcccgaaaggtgtggctctgcctcatcgtactgcatgcgttcgcttttcccatgctcgtgacccgatcttcggcaaccagattatcccagacacggctatcctgagcgtcgttccttttcaccacggttttggcatgttcactaccctgggctacctgatctgcggtttccgtgtggtcctgatgtaccgctttgaagaagaactgtttctgcgtagcctgcaggactacaaaattcagtctgcgctgctggttccaaccctgttttctttcttcgcgaagtccactctgatcgacaaatacgacctgtccaacctgcatgagattgcttctggcggcgccccgctgtctaaagaagtgggcgaagctgtcgcaaaacgttttcacctgccgggtatccgccagggctatggtctgacggaaaccacctccgctatcctgatcaccccgaaaggtgacgataaaccgggtgcggtcggtaaggttgtcccgttttttgaagcaaaagttgttgatctggataccggcaaaaccctgggtgttaaccagcgtggtgaactgtgtgttcgtggcccgatgattatgtccggttatgtgaacgactccgaggcgaccaacgctctgattgataaggacggttggctgcactccggtgatatcgcatactgggatgaggacgaacactttttcatcgtggcacgcctgaagagcctgatcaagtacaagggttgccaggtagctccggcagaactggagagcattctgctgcagcatccaaacatttttgacgcgggtgttgccggtctgccgggtgatgacgctggtgaactgccggccgctgtagtagtgctggaacatggtaagaccatgaccgaaaaagaaatcgttgactatgtggcatctcaggtgactactgccaaaaaactgcgtggtggtgttgttttcgttgacgaggtcccaaaaggtctgaccggtaaactggacgctcgcaagatccgtgaaatcctgattaaagcgaaaaaaggtggcaagtccaaactgtaa。
[0034]
突变后氨基酸序列（seq id no. 4）：medaknikkgpapfypledgtageqlhkamkryalvpgtiaftdahievnityaeyfemsvrlaeamkryglntnhrivvcsenslqffmpvlgalfigvavapandiynerellnsmnisqptvvfvskkglqkilnvqkklpiiqkiiimdsktdyqgfqsmytfvtshlppgfneydfvpesfdrdktialimnssgstgspkgvalphrtacvrfshardpifgnqiipdtailsvvpfhhgfgmfttlgylicgfrvvlmyrfeeelflrslqdykiqsallvptlfsffakstlidkydlsnlheiasggaplskevgeavakrfhlpgirqgygltettsailitpkgddkpgavgkvvpffeakvvdldtgktlgvnqrgelcvrgpmimsgyvndseatnalidkdgwlhsgdiaywdedehffivarlkslikykgcqvapaelesillqhpnifdagvaglpgddagelpaavvvlehgktmtekeivdyvasqvttakklrggvvfvdevpkgltgkldarkireilikakkggkskl。
[0035]
本发明的luc突变后的氨基酸序列和突变前的氨基酸序列的比对如图1所示。
[0036]
1.2 北美萤火虫荧光素酶的表达与纯化1.2.1 基因合成上海生工合成突变后的luc基因，连接到pet-28a载体上，酶切位点为bamhi、sali。
[0037]
1.2.2 诱导条件37℃震荡培养细菌至对数期，加0.5 mmol/l的iptg诱导，16℃，180 r/min诱导过夜，收集菌体沉淀。
[0038]
1.2.3 菌体破碎30 ml磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀，300w超声30 min，12000 rpm离心30 min，收集上清。
[0039]
1.2.4 纯化流程
1.2.4.1 样品准备：0.45 μm滤膜过滤上清样品，减少杂质，防止堵塞柱子，提高蛋白纯化效率。
[0040]
1.2.4.2 样品纯化：将镍填料装入层析柱，用5倍柱体积的纯水进行清洗；用10倍柱体积的buffer a进行平衡；将样品缓慢加入到平衡好的镍柱中；用5倍柱体积的buffer a进行洗杂；用5～10倍体积的buffer b洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白。
[0041]
1.2.4.2 超滤浓缩：纯化后蛋白含量较低，用30kd的超滤浓缩管浓缩蛋白并使用buffer a清洗，将蛋白中的咪唑替换为pbs。
[0042]
1.2.5 sds-page检测使用sds-page检测纯化效果，发现在63kda左右有一道明显的条带，与目的蛋白大小相符，证明已成功表达目的蛋白，如图2所示，为luc-pet-28a纯化后电泳结果图。
[0043]
实施例2、荧光素酶-荧光素溶液的制备本实施例的荧光素酶-荧光素溶液的制备过程如下：一、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的制备称量2.422g三羟甲基氨基甲烷于烧杯中，溶于800ml去离子水中，完全溶解后加入盐酸调节ph至7.8，定容至1l，形成浓度为0.02m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
[0044]
二、筛选荧光素酶和荧光素的最佳比例试验在步骤一制备的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中添加5 mm mgso4、1.5 mm edta、0.003% bsa后过滤除杂。配制虫荧光素酶和虫荧光素体系，二者浓度组合设置8个条件，分别为10 mg/l实施例1虫荧光素酶+2.5 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+5 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+10 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+20 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+30 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+50 mg/l虫荧光素、10 mg/l实施例1虫荧光素酶+60 mg/l虫荧光素。
[0045]
通过对不同添加量的荧光素酶和荧光素摸索，发现荧光素酶和荧光素的添加量为10mg/l+40mg/l时荧光值已达到最强，如表1所示，为不同荧光素酶和荧光素添加量组合的rlu荧光值。
[0046]
表1
[0047]
三、在步骤二中确定荧光信号值rlu荧光值最强的组合中，加入不同的保护剂（每一步均需0.2
µ
m滤器过滤除杂），37℃放置0、3、7天，测定荧光信号值。
[0048]
1、在步骤二得到的最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素溶液体系，分别分组，加入不同浓度的海藻糖：1%、2%、3%、4%、5%、6%。通过对不同添加量的海藻糖摸索，发现海藻糖添加量为3%时，突变atp酶荧光值最强，稳定性略好。如表2所示，为本发明的突变atp酶添加不同量的海藻糖的荧光rlu值。
[0049]
表2
[0050]
2、在上述步骤中，得到最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素+3%海藻糖的基础上加入不同浓度甜菜碱：2%、4%、6%、8%、10%。
[0051]
通过对实施例1制备的突变atp酶的不同甜菜碱添加量的试验，发现甜菜碱添加量为4%时荧光值最强，稳定性略好。如表3所示，为本发明的突变atp酶添加不同量的甜菜碱的荧光rlu值。
[0052]
表3
[0053]
3、在上述最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素+3%海藻糖+4%甜菜碱的基础上加入不同浓度牛血清白蛋白：0.001%、0.003%、0.005%、0.007%。
[0054]
通过对实施例1制备的突变atp酶的不同牛血清白蛋白添加量的试验，发现牛血清白蛋白添加量为0.003%时荧光值最强，稳定性略好。如表4所示，为本发明的突变atp酶的不同牛血清白蛋白添加量的荧光rlu值。
[0055]
表4
[0056]
4、在上述最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素+3%海藻糖+4%甜菜碱+0.003%牛血清白蛋白的基础上加入不同浓度甘油：5%、10%、15%、20%、25%、30%。
[0057]
通过对实施例1制备的突变atp酶的不同甘油添加量的试验，发现甘油添加量为15%时稳定性略好。如表5所示，为本发明的突变atp酶的不同甘油添加量的荧光rlu值。
[0058]
表5
[0059]
5、在最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素+3%海藻糖+4%甜菜碱+0.003%牛血清白蛋白+15%甘油的基础上加入不同浓度的二硫苏糖醇：0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm、1.2mm。
[0060]
通过对实施例1制备的突变atp酶的不同二硫苏糖醇添加量的试验，发现二硫苏糖醇添加量为1.0 mm时稳定性略好。如表6所示，为本发明的突变atp酶的不同二硫苏糖醇添加量的荧光rlu值。
[0061]
表6
[0062]
6、配制裂解液，最佳组合10 mg/l实施例1虫荧光素酶+40 mg/l虫荧光素+3%海藻糖+4%甜菜碱+0.003%牛血清白蛋白+15%甘油+1.0 mm二硫苏糖醇的最强的组合中，加入0.1%苯扎溴铵，0.2
µ
m滤器过滤除杂，得到本发明atp荧光检测试剂。
[0063]
将荧光素酶-荧光素检测试剂溶液300
ꢀµ
l于密封杆内，裂解液100
ꢀµ
l加到棉签头上，在超净车间里将atp荧光检测试剂组装完成，密封避光，4℃保存。
[0064]
具体的，本发明的atp荧光检测试剂是由缓冲体系、酶反应基本溶液体系、保护剂和裂解剂组成的atp荧光检测试剂。该atp荧光检测试剂的制备方法主要包括以下步骤：配制三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，加入0.003％牛血清白蛋白，1.0 mm二硫苏糖醇，3%海藻糖，4%甜菜碱，15%甘油，5 mm mgso4，ph 7.8，得到本发明的atp荧光检测试剂。
[0065]
配制酶反应体系溶液，在上述atp荧光检测试剂中加入10 mg/l 荧光素酶和40 mg/l荧光素。配制裂解液，在上述缓冲溶液中加入0.1%苯扎溴铵。将酶反应体系溶液置于密封杆内，裂解液加到棉签头上，将atp检测试剂组装完成。
[0066]
实施例3、本发明的atp荧光检测试剂荧光素酶活性和稳定性试验1.atp标准品的制备用电子天平准确称取0.0121 g atp粉末，加入2 ml三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，得到10-5
mol/ml的标准溶液，逐级稀释获得各浓度的标准溶液（10-8
~10-17
mol/ml）。
[0067]
2.取20
µ
l不同浓度的atp标准品溶液滴加到棉签上，通过atp荧光读数仪读值。
[0068]
3.结果分析3.1荧光素酶突变前后对比通过对突变前后荧光素酶活性和稳定性试验的测试，发现突变后的荧光素酶灵敏度提高10倍，在4℃放置30天略有下降，比未突变的荧光素酶更稳定。如表7所示，为突变atp酶和未突变atp酶活性值rlu的比较。如表8所示，为突变atp酶和未突变atp酶的稳定性rlu的比较。
[0069]
表7
[0070]
表8
[0071]
3.2稳定性结果分析将本发明的实施例2制备的atp荧光检测试剂放置于4℃和37℃，180天后4℃下降14%，37℃下降28%，稳定性较好。如表9所示，为本发明的atp荧光检测试剂在不同温度下放置不同时间测定的rlu值。
[0072]
表9
[0073]
3.3 atp荧光检测试剂灵敏度检测将本发明实施例2制备的atp荧光检测试剂和商品化的atp生物荧光检测试剂同时测试atp标准品，结果表明灵敏度和商品化的基本一致；对其进行低温和常温环境下长期监控，4℃条件下30天和商品化的一致，37℃条件下30天比商品化的atp生物荧光检测试剂更稳定。
[0074]
表10
[0075]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1. 具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质变体，其中，seq id no. 1中的第354位的谷氨酸被除谷氨酸以外的氨基酸取代，和/或第405位的脯氨酸被除脯氨酸以外的氨基酸取代，和/或第436位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代。2.如权利要求1所述的蛋白质变体，其中，所述第354位谷氨酸被赖氨酸取代；和/或所述第405位脯氨酸被丝氨酸取代，和/或所述第436位天冬氨酸被丙氨酸取代。3. 如权利要求2所述的蛋白质变体，其中，所述蛋白质变体为seq id no. 4的氨基酸序列。4.多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的蛋白质变体。5.载体，其包括如权利要求4所述的多核苷酸。6. 微生物，其包括如权利要求1或2所述的蛋白质变体，其中，所述微生物属于大肠杆菌（escherichia coli）。7.如权利要求6所述的微生物，其中，所述微生物产北美萤火虫荧光素酶。8.一种atp荧光检测试剂，其包括权利要求1或2所述的蛋白质变体。9.如权利要求8所述的atp荧光检测试剂，其特征在于还包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、质量百分数为0.002-0.004％的牛血清白蛋白、浓度为0.5-2.0 mm的二硫苏糖醇、质量百分数为2-4%的海藻糖、质量百分数为3-5%的甜菜碱、质量百分数为10-20%的甘油、浓度为3-7 mm的mgso4。10.一种atp酶检测体系，其特征在于，包括权利要求8所述的atp荧光检测试剂，以及荧光素。

技术总结
本发明公开了新型北美萤火虫荧光素酶的变体及应用其的ATP荧光检测试剂。具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质变体，其中，SEQ ID NO.1中的第354位的谷氨酸被除谷氨酸以外的氨基酸取代，和/或第405位的脯氨酸被除脯氨酸以外的氨基酸取代，和/或第436位的天冬氨酸被除天冬氨酸以外的氨基酸取代。本发明的ATP荧光检测试剂具有作简便、灵敏、特异、快速且可低温长时间保存的优点，荧光素酶氨基酸突变导致荧光素酶蛋白质空间结构发生改变，增加其热稳定性；并在此基础上摸索糖和一些大分子蛋白对其保护力，进一步提高了该试剂的稳定性。进一步提高了该试剂的稳定性。进一步提高了该试剂的稳定性。


技术研发人员：袁婷婷 杜帅龙 巩玉洁 赵荣茂 马孝斌 赵洁羽 张琼林 杨晓霞 赵方圆 陈娟
受保护的技术使用者：北京纳百生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/7/20