一种绿绒蒿总黄酮的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及中药的制备及其应用技术领域，具体涉及一种绿绒蒿总黄酮的制备方法及其应用。


背景技术：

2.绿绒蒿为一年生或多年生草本，主根肥厚呈萝卜状，茎分枝或不分枝，株高0.3-1m，有的品种可达1.5m二其叶长椭同形、阔卯形或具长柄如汤匙形或分裂为琴形等，叶面具有柔长的茸毛，因而得名"绿绒蒿"。味甘，性凉。清热，消炎，降压。主治肺热，肝热，具有保肝，缓解头痛等作用。在临床上常用于抗炎，充血，止疼和传染病等疾病的治疗。
3.绿绒蒿主要化学成分为黄酮、生物碱类，其中以黄酮类化合物居多，现有的绿绒蒿总黄酮制备方法得到的总黄酮多为粗提物，纯度较低，应用价值不高。
4.肝纤维化作为肝癌的前期状态，该概念是由德国科学家于上世纪五十年代提出，很多慢性肝脏疾病如营养代谢紊乱、药物及病毒感染等原因均会导致肝纤维化，纤维化过程发生在组织瘢痕组织修复过程中，稳态调节机制被破坏，从而引发大量的纤维化组织堆积，该过程是进行性、不受控制的，最终，由于正常组织被破坏，导致器官衰竭。众所周知，肝纤维化的产生是由于肝损伤导致肝脏细胞外基质(extracellular matrix，ecm)累积在肝细胞周围，发生肝纤维化，随后进阶为肝硬化。其实，肝纤维化的发病机制却是十分复杂，而且，早期的肝纤维化是很难被发现的，由多种促纤维化因子参与，是细胞、蛋白等因素共同组成的复杂系统。肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础，随着对肝纤维化发病机制的不断深入，认为肝纤维化是可以被逆转的过程，因此，治疗肝纤维化对肝硬化及肝癌防治具有很大意义。
5.现有研究表明，不同病因引起的肝纤维化的核心环节是肝星状细胞(hepatic stellate cell，hsc)活化，转化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质(extracellular matrix，ecm)过度沉积肝内，从而破坏肝组织结构和肝脏生理功能。然而，目前尚无有效的抗肝纤维化治疗西药，如何有效治疗肝纤维化依旧是一项医学重大难题。中医药在治疗肝纤维化方面有着显著的特色和丰富的经验，早在先秦时期就有一定认识。中医理论表明，肝纤维化常见证候有湿热瘀阻、瘀血互结等，归肝、脾、胃经，中药结合辨证论治能够改善症状，提高患者的生存质量。但是目前抗肝纤维化的中药极其稀少，因此，研发安全有效的抗肝纤维化中药具有极其重大的临床意义。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是目前的绿绒篙总黄酮的制备方法中总黄酮的提取率很低导致绿绒篙总黄酮在医疗领域的应用价值较低的问题，目的在于提供一种绿绒蒿总黄酮的制备方法及其应用，解决了目前的绿绒篙总黄酮的制备方法中总黄酮的提取率很低导致绿绒篙总黄酮在医疗领域的应用价值较低的问题。
7.本发明通过下述技术方案实现：
8.提出了一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，包括以下步骤；
9.步骤1：将绿绒篙全草洗净后干燥，得到干燥的绿绒篙；
10.步骤2：将干燥的绿绒篙粉碎后过筛，备用；
11.步骤3：过筛后的绿绒篙使用乙醇浸泡，然后按照料液比1：(10～20)的比例补足提取液后进行多次超声处理，超声处理后过滤，再合并所有的滤液并进行减压浓缩，浓缩后使用大孔树脂进行纯化，即得到绿绒篙总黄铜。
12.进一步的，步骤3中大孔树脂的纯化方法为：将大孔树脂使用浓度为95％的乙醇浸泡后湿法装柱，以浓度为95％的乙醇冲洗至流出液加水不浑浊为止，水洗去除乙醇至水洗液无醇味为止，依次使用naoh溶液、蒸馏水、hcl溶液、蒸馏水冲洗，最后呈中性，以2ml/min的流速洗脱。
13.进一步的，所述洗脱方法为：使用5-10bv体积浓度为50-75％的乙醇，以0.5-1.0ml/min的流速洗脱，收集洗脱液。
14.进一步的，所述naoh溶液的浓度为5％，hcl溶液的浓度为5％。
15.进一步的，所述大孔树脂为ab-8大孔吸附树脂、d101大孔吸附树脂、hpd100大孔吸附树脂、h103大孔吸附树脂中的任意一种。
16.进一步的，大孔树脂纯化中的上样液的使用浓度为5％的盐酸将ph值调整至2-5。
17.进一步的，步骤1中的干燥温度控制在30-50℃。
18.进一步的，步骤3中浸泡绿绒篙的乙醇的浓度为30-90％。
19.进一步的，步骤3中超声处理时的超声功率为80-120w，微波的频率为30-45khz；每次超声处理的时间为30-60min。
20.为了实现上述目的，本技术还提出了一种上述绿绒篙总黄酮的制备方法制备的绿绒篙总黄酮在制备抑制肝纤维化药物中的应用。
21.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
22.(1)本技术采用大孔树脂对绿绒篙总黄酮进行纯化，提高了绿绒篙总黄酮的提取率，提取率高达85％以上，比传统方法的绿绒篙提取率高出了4倍左右；
23.(2)使用本技术中的绿绒篙总黄酮的制备方法制备的绿绒篙总黄酮对肝纤维化具有很好的抑制作用，可用于开发抗肝纤维化的新药，特别是针对肝硬化造成的肝纤维化。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
25.图1是实施例1中总黄酮检测标准曲线；
26.图2是实施例12中绿绒蒿总黄酮抑制hsc-t6细胞增殖的检测结果显示图；
27.图3是实施例12中ln mrna相对表达量的测定结果显示图；
28.图4是实施例12中col4 mrna相对表达量的测定结果显示图；
29.图5是实施例13中收样时大鼠肝脏系数的测定结果显示图；
30.图6是实施例13中肝功能指标血清中alt水平；
31.图7是实施例13中肝功能指标血清中ast水平；
32.图8是实施例13中肝纤维化指标血清中ln水平；
33.图9实施例13中肝纤维化指标是血清中col4水平。
具体实施方式
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
35.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
37.实施例1
38.绿绒篙总黄酮制备方法研究
39.设备仪器
40.超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；电子天平(上海皓庄仪器有限公司)；超纯水仪(四川沃特浦科技有限公司)；紫外分光光度计(北京普西通用仪器有限公司)；多功能粉碎机(上海霸辉工具有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
41.试剂
42.芦丁标准品(纯度＞98％，成都曼斯特生物科技有限公司)；氢氧化钠(成都市科隆化学品有限公司)；亚硝酸钠(天津博迪化工股份有限公司)；氯化铝(成都市科隆化学品有限公司)；无水乙醇(成都市科隆化学品有限公司)。
43.芦丁标准曲线绘制
44.精密称取芦丁标准品10mg，用30％乙醇溶解，全部转入50ml容量瓶中，用30％乙醇定容，摇匀，得质量浓度为0.2mg/ml的芦丁标准液。分别取芦丁标准溶液0.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml置于25ml容量瓶，加入5％亚硝酸钠0.7ml，摇匀，静置7min，加入10％硝酸铝0.7ml，摇匀，静置5min，加入4％氢氧化钠5.0ml，混匀，用30％乙醇稀释至刻度，10min后于波长510nm处测定吸光度值a，以试剂空白参比。以吸光度为纵坐标(y)，对照品含量(mg)为横坐标(x)，绘制标准曲线，详见图1，线性回归方程y＝10.266x-0.0141，r2＝0.9986，结果表明，芦丁含量在0.016～0.08mg/m l之间与吸光度成良好线性关系。
45.该实施例提供一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，包括以下步骤；
46.步骤1：将绿绒篙全草洗净后干燥，得到干燥的绿绒篙；
47.步骤2：将干燥的绿绒篙粉碎后过筛，备用；
48.步骤3：称取绿绒蒿粉末1g于锥形瓶中，加入15ml浓度50％的乙醇溶液，并用在功率为90w，频率为40khz的超声条件下进行超声辅助提取30min，提取液过滤；
49.大孔吸附树脂预处理：将ab-8大孔吸附树脂以95％乙醇浸泡树脂24h充分溶胀后
湿法装柱；以95％乙醇冲洗至流出液加水至乙醇：水＝1:5不显浊为止，水洗去乙醇，至水洗液无醇味为止，依次用5％naoh溶液、蒸馏水、5％hcl溶液、蒸馏水冲洗，最后至中性，备用。
50.大孔吸附树脂纯化：用5％盐酸调节上样液的ph至2。将调节好ph的上样液，装到处理好的ab-8大孔吸附树脂上，重复上样，上样完毕后，以流速为0.5ml/min按照以下步骤进行洗脱：
51.(1)用水进行洗脱5个bv；
52.(2)用浓度为50％的乙醇进行洗脱5个bv，收集浓度为50％的乙醇部分的洗脱液，既得绿绒蒿总黄酮。
53.按照上述芦丁标准曲线的方法，在510nm波长下测定绿绒篙总黄酮提取液的吸光度，再通过总黄酮提取率(％)＝cv/m计算绿绒篙总黄酮的提取率，v为提取液体积，m为绿绒蒿粉末的质量。
54.采用实施例1中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.05％，纯度为98.03％。
55.实施例2
56.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3中加入的乙醇溶液的浓度为53％，其余与实施例1完全相同。
57.采用实施例2中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.02％，纯度为98.03％。
58.实施例3
59.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3中加入的乙醇溶液的浓度为55％，其余与实施例1完全相同。
60.采用实施例3中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.0％，纯度为98.02％。
61.实施例4
62.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3中使用的超声功率为95w，超声频率为42khz。其余与实施例1完全相同。
63.采用实施例4中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.01％，纯度为98.03％。
64.实施例5
65.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3中使用的超声功率为100w，超声频率为45khz。其余与实施例1完全相同。
66.采用实施例5中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.04％，纯度为98.05％。
67.实施例6
68.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段上样液的ph值调整至3，其余与实施例1完全相同。
69.采用实施例6中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.06％，纯度为98.03％。
70.实施例7
71.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段上样液的ph值调整至5，其余与实施例1完全相同。
72.采用实施例7中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.08％，纯度为98.0％。
73.实施例8
74.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段的洗脱流速为0.8ml/min，其余与实施例1完全相同。
75.采用实施例8中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.06％，纯度为98.02％。
76.实施例9
77.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段的洗脱流速为1ml/min，其余与实施例1完全相同。
78.采用实施例9中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.08％，纯度为98.05％。
79.实施例10
80.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段的洗脱步骤为：
81.(1)用水进行洗脱7个bv；
82.(2)用浓度为55％的乙醇进行洗脱7个bv，收集浓度为55％的乙醇部分的洗脱液，既得绿绒蒿总黄酮。
83.其余与实施例1完全相同。
84.采用实施例10中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.0％，纯度为98.0％。
85.实施例11
86.该实施例与实施例1的不同之处在于步骤3的大孔吸附树脂纯化阶段的洗脱步骤为：
87.(1)用水进行洗脱10个bv；
88.(2)用浓度为60％的乙醇进行洗脱10个bv，收集浓度为60％的乙醇部分的洗脱液，既得绿绒蒿总黄酮。
89.其余与实施例1完全相同。
90.采用实施例11中的制备方法得到的绿绒篙总黄酮的提取率为85.02％，纯度为98.0％。
91.综上所述，采用本技术中的绿绒篙总黄酮的制备方法提取的总黄酮的提取率均达到了85％以上，纯度均在98％以上，因此在本技术限定的工艺条件范围内，并采用本技术的制备方法，即可得到提取率较高的绿绒篙总黄酮。
92.对比例
93.该对比例提供一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，包括以下步骤；
94.步骤1：将绿绒篙全草洗净后干燥，得到干燥的绿绒篙；
95.步骤2：将干燥的绿绒篙粉碎后过筛，备用；
96.步骤3：称取绿绒蒿粉末1g于锥形瓶中，加入15ml浓度50％的乙醇溶液，并用在功率为90w，频率为40khz的超声条件下进行超声辅助提取30min，提取液过滤。
97.按照上述芦丁标准曲线的方法，在510nm波长下测定提取液的吸光度，计算提取液中总黄酮的浓度c(％)，再通过以下公式计算绿绒蒿总黄酮提取率。
98.总黄酮提取率(％)＝cv/m为提取液中总黄酮的浓度，v为提取液体积，m为绿绒蒿粉末的质量。
99.对比例中最终总黄酮提取率为22.98％。
100.通过上述对比可知，采用本技术中的制备方法提取的绿绒篙总黄酮的提取率比现有技术中的提取率高出4倍左右。
101.实施例12
102.绿绒蒿总黄酮治疗肝纤维化体内药理作用研究
103.1.实验材料
104.hsc-t6细胞、cck-8试剂盒(日本dojindo)，ln、col4 mrna引物(上海生工)，氯仿(四川科隆)，异丙醇(四川科隆)，无酶水(上海生工)。
105.2.实验方法
106.细胞活性的检测：采用cck-8法进行细胞活性检测。将hsc-t6细胞以1
×
105个/ml接种于96孔板，每孔100μl。待细胞贴壁并增殖到70％左右时，分别加入含0(对照组)、1、5、25、125、250、500μg/ml)的完全培养基(即含10％fbs、1％青霉素-链霉素的dmem培养基)，于37℃、5％co2下培养(培养条件下同)，同时设置空白孔。24h后，加入cck8，孵育2h后，使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的光密度。
107.细胞中ln、col4表达情况的检测：将hsc-t6细胞以1
×
105个/ml接种于6孔板，每孔2ml。培养24h后，分别加入含0(对照组)、50、100、200μg/ml，24h后，收集细胞，24h后，收集细胞，加入trizol试剂和氯仿、异丙醇等试剂提取细胞的总rna并用无酶水复溶；取上述复溶溶液1μl于微量分光光度计和荧光分光光度计上测定rna含量并验证其纯度后，按试剂盒说明书操作将rna反转录成cdna，并以cdna为模板进行pcr扩增。
108.3.实验结果
109.如图2所示，细胞活性的检测：绿绒蒿总黄酮能抑制肝星状细胞hsc-t6增殖，在给药剂量为5μg/ml时细胞存活率为87.5％，具有显著性差异，同时绿绒蒿总黄酮对hsc-t6细胞抑制作用呈现剂量依赖性。
110.如图3和图4所示，使用rt-qpcr法检测细胞中纤维化相关mrna表达：实验结果表明绿绒蒿总黄酮可抑制hsc-t6细胞中纤维化相关蛋白的mrna ln与col4水平，且呈现出剂量依赖性，在给药剂量为50μg/ml时表表现出良好的效果，证明了绿绒蒿总黄酮体外抑制细胞纤维化具有良好效果。
111.实施例13
112.绿绒蒿总黄酮治疗肝纤维化体外药理作用研究
113.1.实验材料
114.180～220g左右spf级雄性sd大鼠，由成都达硕实验动物有限公司提供。
115.2.药物与试剂
116.取实施例1中所制备的绿绒蒿总黄酮提取物为实验治疗药物。
117.3.实验方法
118.(1)分组：将60只雄性c57 b/6j小鼠随机分为以下六组：空白组、模型组、绿绒蒿总黄酮低量组、绿绒蒿总黄酮中量组、绿绒蒿总黄酮高剂量组、阳性给药组，每组10只。
119.(2)造模：除空白组外，其余组将ccl4与橄榄油按体积1:10(v/v)配制成10％ccl4溶液，腹腔注射小鼠(0.05ml/10g体重)，每周两次，连续六周，建立肝纤维化小鼠模型。
120.(3)给药：造模结束后，绿绒蒿总黄酮低剂量治疗组、绿绒蒿总黄酮中剂量治疗组、绿绒蒿总黄酮高剂量治疗组小鼠分别灌胃给药200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg绿绒蒿总黄酮。模型组、空白对照组小鼠分别灌胃等量的生理盐水，阳性给药组给予3mg/kg秋水仙碱。每次0.2ml，持续6周。小鼠处死前12h禁食不禁水，将小鼠固定在解剖板上，迅速取血及肝脏。
121.4.标本采集及测定
122.绿绒蒿总黄酮对肝纤维化大鼠肝脏系数的影响与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝脏系数显著增大。
123.如图6和图7所示，利用生化仪对纤维化小鼠血清肝损伤指标进行了检测小鼠肝功能指标alt、ast。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠血清中的alt、ast含量显著升高。与模型组相比，经秋水仙碱和绿绒蒿总黄酮治疗后，小鼠血清中的alt、astp含量显著降低，证明绿绒蒿总黄酮可减轻肝损伤。
124.如图8和图9所示，肝纤维化指标检测，采用elisa试剂盒检测小鼠肝纤维化指标ln、col4含量,实验步骤按照试剂盒说明书进行。与正常对照组比较,模型对照组大鼠血清ln、col4含量明显升高，表明大鼠肝纤维化模型成功；与模型对照组比较,各给药组大鼠血清ln、col4含量明显降低，证明绿绒蒿总黄酮可抑制肝纤维化水平。
125.因此，绿绒蒿总黄酮提取物可用于开发抗肝纤维化的新药，特别是针对肝硬化造成的肝纤维化。
126.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；步骤1：将绿绒篙全草洗净后干燥，得到干燥的绿绒篙；步骤2：将干燥的绿绒篙粉碎后过筛，备用；步骤3：过筛后的绿绒篙使用乙醇浸泡，然后按照料液比1：(10～20)的比例补足提取液后进行多次超声处理，超声处理后过滤，再合并所有的滤液并进行减压浓缩，浓缩后使用大孔树脂进行纯化，即得到绿绒篙总黄铜。2.根据权利要求1所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤3中大孔树脂的纯化方法为：将大孔树脂使用浓度为95％的乙醇浸泡后湿法装柱，以浓度为95％的乙醇冲洗至流出液加水不浑浊为止，水洗去除乙醇至水洗液无醇味为止，依次使用naoh溶液、蒸馏水、hcl溶液、蒸馏水冲洗，最后呈中性，以2ml/min的流速洗脱。3.根据权利要求2所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，所述洗脱方法为：使用5-10bv体积浓度为50-75％的乙醇，以0.5-1.0ml/min的流速洗脱，收集洗脱液。4.根据权利要求2所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，所述naoh溶液的浓度为5％，hcl溶液的浓度为5％。5.根据权利要求2所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为ab-8大孔吸附树脂、d101大孔吸附树脂、hpd100大孔吸附树脂、h103大孔吸附树脂中的任意一种。6.根据权利要求2所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，大孔树脂纯化中的上样液的使用浓度为5％的盐酸将ph值调整至2-5。7.根据权利要求1所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤1中的干燥温度控制在30-50℃。8.根据权利要求1所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤3中浸泡绿绒篙的乙醇的浓度为30-90％。9.根据权利要求1所述的一种绿绒蒿总黄酮的制备方法，其特征在于，步骤3中超声处理时的超声功率为80-120w，微波的频率为30-45khz；每次超声处理的时间为30-60min。10.一种权利要求1-9任意一项所述的绿绒篙总黄酮的制备方法制备的绿绒篙总黄酮在制备抑制肝纤维化药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种绿绒蒿总黄酮的制备方法及其应用，涉及中药的制备及其应用技术领域，首先将绿绒篙全草洗净后干燥，得到干燥的绿绒篙；然后将干燥的绿绒篙粉碎后过筛，备用；最后过筛后的绿绒篙使用乙醇浸泡，然后按照料液比1：(10～20)的比例补足提取液后进行多次超声处理，超声处理后过滤，再合并所有的滤液并进行减压浓缩，浓缩后使用大孔树脂进行纯化，即得到绿绒篙总黄铜。采用大孔树脂对绿绒篙总黄酮进行纯化，提高了绿绒篙总黄酮的提取率，提取率高达85％以上；本申请中的绿绒篙总黄酮的制备方法制备的绿绒篙总黄酮对肝纤维化具有很好的抑制作用，可用于开发抗肝纤维化的新药，特别是针对肝硬化造成的肝纤维化。特别是针对肝硬化造成的肝纤维化。特别是针对肝硬化造成的肝纤维化。


技术研发人员：赵学勇 隋美玲
受保护的技术使用者：成都融济华泰医药科技有限公司
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/7/20