一种促进青稞种子发芽和生长的非洲哈茨木霉及应用

1.本发明涉及微生物肥料技术领域，更具体地，涉及一种促进青稞种子发芽和生长的非洲哈茨木霉及应用。


背景技术：

2.青稞是禾本科大麦属植物，为大麦的一种变种，主要分布在西藏、青海、四川省、甘肃省以及云南、贵州的部分地区，是高寒地带人民的主要粮食。现有的青稞种植方法比较简单，系统化种植较弱，导致青稞的产量较低。近年来，为了追求青稞的高产，这些地区的农业生产普遍存在化肥使用超量的情况。过量的施用化肥不但不会高效提高青稞产量，反而还会导致土壤养分比例失衡、农产品品质下降，同时破坏当地生态环境。
3.生物菌肥是一种新型的环境友好型肥料，主要是由对植物生长起促进作用的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，pgpr)组成，目前针对pgpr菌肥的应用主要集中在果蔬方面，如非洲哈茨木霉菌株tm2-4用于番茄促生、木霉mu153、木霉ta97用于防治香蕉黄瓜等果蔬的病害；在青稞上的研究比较少见。因此，研制出高效的生物菌肥应有于青稞，对当地地区的农业发展、土壤修复具有重大意义。
4.非洲哈茨木霉(trichoderma afroharzianum)是新型的植物促生防病微生物，关于非洲哈茨木霉的研究正逐步增加。关于非洲哈茨木霉的研究越来越多，但主要针对果蔬作物的促生和防病，且目前市场上暂未出现商品化的非洲哈茨木霉产品。而与非洲哈茨木霉亲缘关系较近的哈茨木霉，市场上已有较多商品化菌剂产品。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于丰富市场上非洲哈茨木霉商品化菌剂产品，特别是针对农作物生长具有促进作用的生防产品，提供了一种促进青稞种子发芽和生长的非洲哈茨木霉及应用。
6.本发明所采取的技术方案是：
7.本发明的第一个方面，提供一种非洲哈茨木霉菌，为非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianum m957，于2022年07月21日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no.62645。
8.本发明的第二个方面，提供一种培养物，由本发明第一个方面所述非洲哈茨木霉菌在培养基中培养得到。
9.进一步地，根据本发明第二个方面所述的培养物，所述培养基为pdb培养基或固体发酵培养基；
10.所述固体发酵培养基的配方为：
11.固体料：干燥玉米芯40～60％，干燥小麦麸皮30～50％，干燥稻壳8～12％；
12.无机盐溶液：磷酸二氢钾3.0～4.0％，硫酸镁0.03～0.05％，硫酸铵3～5％，剩余为水；
13.更优选地，所述固体发酵培养基的配方为：
14.固体料：干燥玉米芯50％，干燥小麦麸皮40％，干燥稻壳10％；
15.无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水；
16.其中，固体料与无机盐溶液的质量比为1：(1.6～2.0)。
17.更优选地，所述固体料与无机盐溶液的质量比为1：1.8。
18.优选地，根据本发明第二个方面所述的培养物，所述培养物为本技术第一个方面所述非洲哈茨木霉菌的孢子悬液、种子液或发酵菌粉。
19.本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述培养物的制备方法。
20.其中，所述孢子悬液的制备方法为：在pda固体培养基上活化本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌，26～30℃培养5～7天，用无菌蒸馏水洗下培养基表面的孢子，得孢子悬液。
21.优选地，28℃培养5～7天至绿色孢子产满平板，用无菌蒸馏水洗下培养基表面的孢子，得孢子悬液。
22.所述种子液或发酵菌粉的制备方法，包括以下步骤：
23.s1.在pda固体培养基上活化本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌；
24.s2.待所述非洲哈茨木霉菌活化产孢后，取少量孢子，移入pdb液体培养基中，26～30℃培养3～5天，得种子液；
25.s3.将步骤s2中所述种子液接种至固体发酵培养基，26～30℃发酵培养8～9天，得发酵液。
26.优选地，步骤s1中28℃培养5～7天至绿色孢子产满平板。
27.进一步地，步骤s3中发酵液干燥后得到哈茨木霉发酵菌粉。
28.本发明的第四个方面，提供一种菌剂，包括以下(ⅰ)～(ⅲ)中的至少一种：
29.(ⅰ)本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌；
30.(ⅱ)本发明第一个方面所述非洲哈茨木霉菌的分泌物或代谢物；
31.(ⅲ)本发明第二个方面所述的培养物。
32.本发明的第五个方面，提供一种微生物肥料，包括本发明第四个方面所述的菌剂，还包括其他可促进植物生长的物质。
33.更具体地，所述可促进植物生长物质为生长激素、化学肥料或促进植物生长的微生物中的至少一种。
34.本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌、本发明第二个方面所述的培养物或本发明第四个方面所述的菌剂在制备微生物肥料中的应用。
35.进一步地，所述微生物肥料中还包括其他可促进植物生长的物质。
36.更具体地，所述可促进植物生长物质为生长激素、化学肥料或促进植物生长的微生物中的至少一种。
37.本发明的第七个方面，提供本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌、本发明第二个方面所述的培养物或本发明第四个方面所述的菌剂在制备促进植物生长的试剂中的应用。
38.具体地，所述非洲哈茨木霉菌具有铁载体分泌能力；
39.更具体地，所述非洲哈茨木霉菌可分泌铁载体，帮助作物吸收铁元素，从而促进作
物生长。
40.优选地，根据本发明第七个方面所述的应用，所述植物为禾本科植物。
41.更优选地，所述植物为青稞。
42.本发明的第八个方面，提供一种种植青稞的方法，包括浸种、发芽纸种植、收苗、移苗，所述浸种的溶液中含有本发明第一个方面所述的非洲哈茨木霉菌、本发明第二个方面所述的培养物或本发明第四个方面所述的菌剂。
43.更具体地，所述方法包括以下步骤：
44.s01.浸种:将青稞种子用酒精消毒杀菌后，用无菌水冲洗3遍。将种子加入所述非洲哈茨木霉菌菌液中浸泡。
45.s02.发芽：将培养皿放置若干层吸湿无菌水的滤纸作为发芽床，将青稞种子铺于滤纸上，置于25℃培养箱中培养发芽，发芽期间，每天定时定量滴加无菌水。
46.s03.定植：待青稞苗高至在20～30cm时，移入田间定植。
47.本发明的有益效果是：
48.本发明的提供了一种新的非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianumm957，可以产生铁载体为作物提供生长必须的铁元素。
49.本发明还提供了上述非洲哈茨木霉菌的应用，该菌可有效促进大田作物青稞生长，且易于培养，可制备成适于工业化生产的、可商品化的非洲哈茨木霉生防产品，以浸种的方式可以促进青稞出苗、提高发芽率、发芽势，包衣促进青稞苗期生长，具有广阔的应用前景。
附图说明
50.图1m957菌株在pda培养基上的菌落形态图。
51.图2m957菌株产铁载体能力示意图。
52.图3m957浸种对青稞幼苗的影响。
53.图4m957拌种对青稞幼苗的促生效果。
具体实施方式
54.为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
55.实施例1非洲哈茨木霉m957菌株的筛选及鉴定
56.非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianum m957分离自湖南省郴州市(25
°
41
′
36.66
″
，112
°
50
′
52.48
″
)的茶树种植地采集农业土壤。
57.称取5g土壤，加入45ml无菌水后用涡旋震荡仪震荡5min，再梯度稀释为10-1
～10-6
，取10-4
、10-5
和10-6
三个梯度的菌液进行平板涂布，涂布于pda固体培养基(配方为：马铃薯浸粉5g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g、氯霉素0.1g、蒸馏水1l)上，每个涂布进行三个重复，于28℃恒温培养箱中倒置培养4d，4d后挑出单菌落的菌株，接种于新的pda平板上，28℃恒温培
养箱中倒置培养5d，获得菌株纯培养，菌株在pda培养基上的菌落形态见附图1。
58.m957菌株的鉴定：
59.对该菌株的its(5.8s rdna和28s rdna基因间隔序列)序列进行种属鉴定，测定结果如序列seq no.1所示，通过blast同源比对，确定该菌株为非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianum，命名为非洲哈茨木霉m957。将非洲哈茨木霉m957送至广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)进行保藏，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼五楼，保藏日期：2022年07月21日，保藏编号：gdmcc no.62645。
[0060][0061][0062]
实施例2非洲哈茨木霉m957菌株发酵培养物制备
[0063]
在pda固体培养基上活化m957，置于28℃恒温培养箱培养5～7天至绿色孢子产满平板，用无菌蒸馏水洗下培养基表面的孢子，用无菌蒸馏水稀释调整孢子数为1x108sp/ml，即为待用孢子悬液。
[0064]
非洲哈茨木霉m957具有非常好的产孢能力，易于培养，其培养方法、发酵工艺、制备菌剂的方法都相对简单。
[0065]
m957在pda固体培养基上活化产孢后，挑取少量孢子，移至pdb液体培养基中，28℃摇床rpm120振荡培养3～5天，形成种子液，菌活为0.15～0.30cfu/ml。将种子液按10％的比例接种至固体发酵培养基，保持28℃恒温和相对湿度85％以上发酵培养8～9天，发酵液干燥以后即可得到哈茨木霉发酵菌粉。
[0066]
pda固体培养基配方:马铃薯浸粉50g(北京鸿润宝顺科技有限公司y047b)葡萄糖20.0g,琼脂20.0g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。
[0067]
pdb液体培养基配方:去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000ml。
[0068]
固体发酵培养基配方(质量百分含量)：
[0069]
固体料：干燥玉米芯50％，干燥小麦麸皮40％，干燥稻壳10％；
[0070]
无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。
[0071]
本实施例中固体料与无机盐溶液的质量比为1:1.8。
[0072]
实施例3非洲哈茨木霉m957菌株的铁载体形成能力测试
[0073]
铁是植物生长发育过程中的必需元素，它作为辅因子在植物叶绿素、物质运输等活动过程发挥至关重要的作用。且大多数的微生物生长也需要铁元素。嗜铁素也称铁载体，
是微生物或植物合成并分泌的一种螯合铁的用于摄取铁元素的低分子量化合物。分泌铁载体的植物根际促生菌不仅供给植物所需的铁元素，维持植物体内铁平衡、影响免疫功能等，还能夺走有害微生物生长所需的铁元素，抑制其生长，减缓植物发病情况。
[0074]
在确保非洲哈茨木霉m957菌株本身易培养的前提下，通过进一步验证其铁载体形成能力来检验其在提高作物养分利用效率、促进作物生长的潜力，以期验证m957的促生效果。
[0075]
铁饥饿处理：将m957接种到装有10ml mkb无铁培养基(酪蛋白氨基酸5g，甘油15ml，葡萄糖5g，七水合硫酸镁2.5g，超纯水1000ml，ph 7.2，121℃高压灭菌20min。磷酸氢二钾2.5g，超纯水50ml，121℃高压灭菌20min。接种前，每200ml培养基中加入10ml磷酸氢二钾溶液)的50ml离心管中，30℃，200rpm振荡培养24h～72h。
[0076]
3000rpm离心2min去除菌丝体，直接使用上清液(或者稀释10倍)。取10μl菌悬液接种于无铁mkb平板，每个平板滴3次均匀分布，每个菌株3个重复，置于30℃培养箱中培养1d后，每个平板上都长出明显菌落，待cas培养基(铬天青s 60.5mg，十六烷基三甲基溴化铵72.9mg，fecl3.6h2o 2.645mg，琼脂9g，nah2po4.2h2o 295.25mg，na2hpo4.12h2o 1213.5mg，氯化铵125mg，磷酸二氢钾37.5mg，氯化钠62.5mg)冷却至60℃以下，在长出菌落的平板上倒一层cas培养基，放置2h及24h观察每个平板的颜色变化。结果见附图2。
[0077]
从附图2的结果中可以看出非洲哈茨木霉m957的菌落周围有黄色晕圈形成，说明蓝色检测平板中的铁离子被微生物分泌的铁载体夺走，因此非洲哈茨木霉m957菌株是一株具有铁载体分泌能力的菌株。铁载体分泌能力表征着非洲哈茨木霉m957可以帮助作物吸收铁元素，从而促进作物生长。
[0078]
实施例4非洲哈茨木霉m957菌株浸种对青稞种子活力的影响
[0079]
按照实施例2所述方法制备m957的孢子液备用，将孢子液分别稀释至106spore/ml和5
×
105spore/ml。
[0080]
浸种：
[0081]
将青稞种子用酒精消毒杀菌后，用无菌水冲洗3遍。称取30g种子加入100ml相对应处理的菌液，以清水为对照。
[0082]
发芽纸种植：
[0083]
选用籽粒饱满，大小均匀的青稞种子。每个处理30粒，共重复3次。将培养皿放置2层吸湿无菌水的滤纸作为发芽床，置于25℃培养箱中培养发芽，发芽期间，每天定时定量滴加无菌水。
[0084]
发芽计数：
[0085]
从发芽纸种植后开始每天同时间进行发芽计数，以胚根长度超过种子长度为种子萌发的标志。
[0086]
发芽纸收苗：
[0087]
种植7d后测量青稞的芽长、根长和鲜重，计算活力指数。3d计算发芽势，7d计算发芽率。发芽指数gi＝∑gt/dt；活力指数vi＝s
×
gi。式中dt为发芽试验第几日、gt为第几日的发芽数、s为种苗生长量(长度或重量)，本试验s选取鲜重。m957浸种对青稞幼苗的影响见附图3，统计结果见下表1。
[0088]
表1m957浸种对青稞幼苗的影响
[0089][0090]
注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(dmrt法)。
[0091]
测试结果表明，m957不同用量下浸种处理的青稞发芽势、发芽率生物量等指标均较ck(空白对照)提高，但3个处理间的差异不显著。106spore/ml浸种处理的根长和单株鲜重优于5
×
105spore/ml浸种处理，5
×
105spore/ml浸种处理的发芽势、发芽率、芽长、发芽指数和活力指数均优于106spore/ml浸种处理。
[0092]
实施例5非洲哈茨木霉m957菌株拌种对青稞的促生效果
[0093]
按照实施例2中的方法制备m957孢子悬液备用。
[0094]
拌种处理：称取100g青稞种子(藏青19号)，将m957孢子悬液稀释至5x107sp/ml，取1ml对青稞种子进行包衣，模拟田间拌种处理。以未处理的种子作为对照。将化药拌种剂(洛阳市绿野生物工程有限公司)作为阳性对照。
[0095]
种植：将上述处理好的种子每盆种植3颗，每6盆为1重复，每处理3重复。
[0096]
数据收集：35d后收苗，统计植株株高、鲜重和干重等生理指标，结果见下表2和下表3和附图4。
[0097]
表2m957拌种对青稞幼苗长势指标的影响
[0098]
处理株高(cm)茎粗(mm)根长(cm)m957拌种37.72
±
0.7ab2.04
±
0.06a15.8
±
1.46ack(空白对照)32.13
±
0.49d2.12
±
0.08a13.86
±
0.38abc化药拌种36.05
±
0.89abc2.15
±
0.04a13.88
±
0.68abc
[0099]
注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(dmrt法)。
[0100]
表3m957拌种对青稞幼苗生物量的影响
[0101][0102]
注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(dmrt法)。
[0103]
从结果中可以看出，m957拌种对青稞幼苗的株高、茎粗和根长都有显著的促进效果，相比化药具有更优的促进效果，且不会对土壤或水源造成污染；对青稞幼苗生物量也有明显的促进作用，地上和地下部分的鲜重相比化药的作用相当，从干重的数据来看明显优于化药的作用，说明非洲哈茨木霉m957作为pgpr菌肥，可以有效用于促进青稞的生长，能作为替代化药而广泛用于青稞的田间种植。此外，非洲哈茨木霉m957还可与其他可促进植物生长的物质何用，包括生长激素、化学肥料或促进植物生长的微生物。
[0104]
综上所述，本发明的非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianumm957可以产生铁载体为作物提供生长必须的铁元素，且以浸种的方式可以促进青稞出苗、提高发芽率、发芽
势，包衣促进青稞苗期生长。非洲哈茨木霉m957便于工业化生产，具有广阔的应用前景。
[0105]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种非洲哈茨木霉菌，为非洲哈茨木霉trichoderma afroharzianum m957，于2022年07月21日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmccno.62645。2.一种培养物，由权利要求1所述非洲哈茨木霉菌在培养基中培养得到。3.根据权利要求2所述的培养物，其特征在于，所述培养基为pda固体培养基、pdb培养基或固体发酵培养基；所述固体发酵培养基的配方为：干燥玉米芯40～60％，干燥小麦麸皮30～50％，干燥稻壳8～12％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.0～4.0％，硫酸镁0.03～0.05％，硫酸铵3～5％，剩余为水；其中固体料与无机盐溶液的质量比为1：(1.6～2.0)。4.权利要求2或3所述培养物的制备方法，包括以下步骤：s1.在pda固体培养基上活化权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌；s2.待所述非洲哈茨木霉菌活化产孢后，取少量孢子，移入pdb液体培养基中，26～30℃培养3～5天，得种子液；s3.将步骤s2中所述种子液接种至固体发酵培养基，26～30℃发酵培养8～9天，取发酵菌液或将发酵菌液干燥后得菌粉；其中，步骤s3中所述固体发酵培养基的配方优选为：干燥玉米芯40～60％，干燥小麦麸皮30～50％，干燥稻壳8～12％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.0～4.0％，硫酸镁0.03～0.05％，硫酸铵3～5％，剩余为水；其中固体料与无机盐溶液的质量比为1：(1.6～2.0)。5.一种菌剂，包括以下(ⅰ)～(ⅲ)中的至少一种：(ⅰ)权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌；(ⅱ)权利要求1所述非洲哈茨木霉菌的分泌物或代谢物；(ⅲ)权利要求2或3所述的培养物。6.一种微生物肥料，包括权利要求5所述的菌剂，还包括生长激素、化学肥料或促进植物生长的微生物中的至少一种。7.权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌、权利要求2或3所述的培养物或权利要求5所述的菌剂在制备微生物肥料中的应用。8.权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌、权利要求2或3所述的培养物或权利要求5所述的菌剂在制备促进植物生长的试剂中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为禾本科植物，优选为青稞。10.一种种植青稞的方法，包括浸种、发芽纸种植、收苗、移苗，所述浸种的溶液中含有权利要求1所述的非洲哈茨木霉菌、权利要求2或3所述的培养物或权利要求5所述的菌剂。

技术总结
本发明公开了一种非洲哈茨木霉Trichoderma afroharzianum M957，于2022年07月21日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No.62645。本发明还提供了上述非洲哈茨木霉菌的应用，该菌可以产生铁载体为作物提供生长必须的铁元素，因此可有效促进大田作物青稞生长，且易于培养，可制备成适于工业化生产的、可商品化的非洲哈茨木霉生防产品，以浸种的方式可以促进青稞出苗、提高发芽率、发芽势，包衣促进青稞苗期生长，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：卓玛曲错 旺姆 昌西 汪云静 王一鹤 董晓雪 王生萍
受保护的技术使用者：西藏农牧学院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/7/20