一种硬葡聚糖发酵液脱色的方法

1.本发明涉及一种微生物多糖高效提取方法，属于微生物多糖制备技术领域。硬葡聚糖以其良好的溶解性、假塑性、增稠性和稳定性广泛应用于食品工业、石油工业和化妆品行业等。


背景技术：

2.硬葡聚糖(scleroglucan)又称小核菌多糖，是由小核菌属的一些丝状真菌合成分泌的微生物多糖，其中以齐整小核菌最为典型。硬葡聚糖的水溶液是典型的非牛顿流体，具有高稳定性。可应用于石油工业，例如钻井泥浆、隔离液、乳化沥青。其他方面可用于粘贴剂、水彩、打印油墨、日用化妆品、面膜、医药、农药、鱼虾饲料等等，具有极佳的市场前景和研发价值，是一种附加价值高的新型产品。
3.近年来国内外学者对齐整小核菌产硬葡聚糖的提取条件进行了一系列的研究，但对于从齐整小核菌发酵液中高效提取硬葡聚糖溶液的脱色研究较少。提高发酵液的多糖提取率可以提高生产效率，有效降低生产成本；有效的脱色方法可以减少多糖中含有的色素对多糖的纯化和结构分析等科学研究的影响，为进一步开发和利用硬葡聚糖提供了理论依据。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服从齐整小核菌发酵液中提取硬葡聚糖步骤繁琐及对于多糖溶液的脱色效果差，提供一种简化硬葡聚糖多糖提取步骤及高效的多糖溶液脱色方法。
5.本发明所述的齐整小核菌菌种编号为atcc15205。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
7.1.齐整小核菌发酵液中硬葡聚糖的提取
8.取一定量的发酵液倒入量筒中，分别准备发酵液体积2-5倍的无水乙醇，醇沉静置8-12h，去除上层无水乙醇，清洗吹干后复溶于清水中。
9.2.硬葡聚糖水溶液的脱色
10.选取水溶液质量比1％-5％的活性炭或者d101大孔吸附树脂或者s-8大孔吸附树脂进行吸附脱色，在适宜温度35-45℃、ph4-6下，在震荡水浴锅中脱色时间30-60min，过滤得清液。
11.有益效果
12.本发明利用醇沉的方法提取多糖时，乙醇可通过蒸馏回流得方式回收再利用，节省了原材料，降低了生产成本，实现了低投资高收益，具有广泛的适应性和实用性。
13.2.本发明选择脱色使用的材料易于获取，并且相对安全，脱色时设置温度较低可以节省能源，保护环境。
具体实施方式
14.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.下面结合一个具体的实施例对本发明进行进一步说明。
16.实施例
17.本发明中所使用的原料如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
18.1.菌种培养及发酵液制备
19.(1)将菌种接种到pda培养基中进行活化；
20.(2)已经活化的齐整小核菌接种到摇瓶中，在25℃、150rpm摇床中进行培养5-7d；
21.培养基配方：葡萄糖(40g/l)、硝酸钠(3g/l)、磷酸氢二钾(2g/l)、氯化钾(0.5g/l)、硫酸镁(0.5g/l)、七水合硫酸亚铁(0.05g/l)、酵母膏(9g/l)、七水合柠檬酸(0.7g/l)。
22.2.齐整小核菌发酵液中硬葡聚糖的提取
23.取一定量的发酵液倒入量筒中，准备发酵液体积2倍的无水乙醇，将无水乙醇倒入量筒，以1：2的比例进行醇沉，静置12小时，等待下层沉淀，去除上层无水乙醇，称量沉淀湿重后再使用水分测定仪测量多糖含水量，计算出多糖干重。得出多糖保留率高达96.66％。
24.3.一种提高齐整小核菌硬葡聚糖脱色率的方法
25.选取添加量为2％的小颗粒活性炭进行脱色，将稀释后的多糖溶液在40摄氏度、ph 4，在震荡水浴锅中处理50min。脱色后的溶液颜色较浅，脱色效果最好，颜色最接近于透明，色素去除率为92.99％，多糖保留率为92.65％。
26.4.多糖溶液的冷冻干燥
27.将多糖溶液倒进培养皿中，用封口膜先放进冰箱冷冻，然后用冷冻干燥机进行冻干，获得的冻干粉可长时间保存。
28.5.脱色后的硬葡聚糖抗氧化能力的测定
29.分别取3mg/ml、6mg/ml两种浓度的多糖溶液，以3mg/ml、6mg/ml的燕麦提取物溶液作为对照进行多糖总还原能力的测定和多糖对dpph的清除能力的测定。
30.(1)硬葡聚糖总还原能力的测定
31.首先分别吸取3mg/ml、6mg/ml的齐整小核菌硬葡聚糖溶液1.0ml于不同的离心管中，再分别向每个离心管中加入ph为6.6的磷酸钠缓冲液1.5ml，和1.0％的铁氰化钾1.5ml，50摄氏度水浴反应20min后，向每个离心管中加入10％的三氯乙酸溶液1.0ml，迅速混匀，5000r/min离心10min后，分别取2.0ml的上清液于10ml的比色管中，再向各个比色管中加入1％的三氯化铁溶液0.5ml，用酶标仪快速测700nm波长处的吸光度值，以多糖浓度为横坐标，700nm吸光度值为纵坐标绘制曲线，并与相同浓度的燕麦提取物溶液做阳性对照分析。在6mg/ml的浓度下，多糖溶液的总还原能力强于燕麦提取物，其吸光度为0.329。
32.(2)硬葡聚糖对dpph的清除能力
33.分别吸取浓度为3mg/ml、6mg/ml的齐整小核菌硬葡聚糖溶液1.0ml于试管中，向各试管中加入2.0ml浓度为0.2mmol/l的dpph溶液，振荡混匀。将混合物在黑暗条件下室温静置30min，然后通过酶标仪测定517nm波长处的吸光度并记为ac。同时，用1.0ml质量分数为
50％的乙醇代替齐整小核菌硬葡聚糖溶液作为空白组，在相同条件下测定517nm波长处的吸光度并记录为ao。同样，测定0.5ml 50％的乙醇加0.5ml蒸馏水，再加入2.0mldpph备用液后，517nm波长下的吸光度，并记为as，以多糖浓度为横坐标，dpph清除率为纵坐标绘制曲线，并与vc溶液做阳性对照分析。得出相同浓度的燕麦提取物溶液和多糖溶液相比，多糖溶液对于dpph的清除率较高，分别为96.17％和90.60％。


技术特征：
1.一种适于齐整小核菌atcc15205发酵液中硬葡聚糖脱色的方法，包括以下步骤：1)取一定量的发酵液倒入量筒中，分别准备发酵液体积2-5倍的无水乙醇，醇沉静置8-12h，去除上层无水乙醇，清洗吹干后复溶于清水中。2)选取水溶液质量比1％-5％的活性炭或者d101大孔吸附树脂或者s-8大孔吸附树脂进行吸附脱色，在适宜温度35-45℃、ph4-6下，在震荡水浴锅中脱色时间30-60min，过滤得清液。

技术总结
本发明公开一种适于齐整小核菌ATCC15205发酵液中硬葡聚糖脱色的方法，其内容包括：菌种培养及发酵液制备；体积2倍的无水乙醇提取；活性炭或树脂振荡脱色。处理后的溶液色素去除率达90％以上，多糖保留率超过90％，且具有良好的抗氧化性。好的抗氧化性。


技术研发人员：黄亮 何俣卓 王楠
受保护的技术使用者：天津农学院
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/7/20