一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.倍半萜类化合物(sesquiterpenes)为一分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，是含有三个异戊二烯单元，为结构多样性的一组重要的天然产物。
3.据文献报道，具有不同骨架的多种倍半萜类化合物刺激了药物类似物的研究。其中，被报道的含有2-(三氢-2h-吡喃-2基)丙醇(2-(tetrahydro-2h-pyran-2-yl)propan-2-ol)的倍半萜单元为六肽-萜类化合物的一个重要亚单元，以及吲哚二萜类化合物。然而，具有2-(三氢-2h-吡喃-2基)丙醇单元的倍半萜仍然是一类极其罕见的萜类化合物。到目前为止，在1971年和1973年对六烯酮(hexaketide)-萜类化合物(terpenoids)的结构测定和生物合成的研究中，仅报告了三个含有内酯或内酯开环单元的人工产物，且没有可用的核磁数据和活性评估。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用，本发明提供的倍半萜类化合物具有免疫促进活性，能够应用于制备免疫促进药物，丰富了倍半萜类化合物的多样性。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种倍半萜类化合物，具有式1或式2所示结构：
[0007][0008]
本发明提供了上述技术方案所述的倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
将狗牙根平脐蠕孢真菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物；
[0010]
将所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到倍半萜类化合物的粗提物；
[0011]
将所述倍半萜类化合物的粗提物和硅胶混合，得到的混合料装柱，进行第一柱层析分离，所述第一柱层析分离按照体积比由大到小，采用氯仿和甲醇的体积比为100:0～10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，合并相同馏分，得到五段馏分，分别命名为fr.1～fr.5馏分；
[0012]
将fr.2馏分进行第二柱层析分离，得到含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液；所述第二柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系；
[0013]
将fr.4馏分进行第三柱层析分离，得到含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗
脱液；所述第三柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系；
[0014]
将所述含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第一凝胶色谱纯化，得到式1所示结构的倍半萜类化合物的纯品；
[0015]
将所述含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第二凝胶色谱纯化，得到式2所示结构的倍半萜类化合物的纯品。
[0016]
优选的，所述发酵培养基的原料包括马铃薯和/或大米；所述发酵为固体发酵。
[0017]
优选的，所述发酵的温度为20～25℃，所述发酵的时间为30～35d。
[0018]
优选的，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种；所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物的质量与所述醇类溶剂的体积之比为(50～70)g:(80～130)ml。
[0019]
优选的，所述第一柱层析分离为：依次采用体积比为100:0、100:1、50:1、30:1和10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱。
[0020]
优选的，所述倍半萜类化合物的粗提物干重和所述硅胶的质量比为1:(1～1.2)；
[0021]
所述硅胶的目数为300～400目。
[0022]
优选的，所述第二柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；石油醚和丙酮的体积比为30:1。
[0023]
优选的，所述第三柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；石油醚和丙酮的体积比为15:1。
[0024]
本发明提供了上述技术方案倍半萜类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的倍半萜类化合物在制备免疫促进药物中应用。
[0025]
本发明提供了一种倍半萜类化合物，具有式1或式2所示结构。本发明提供的具有式1或式2所示结构的倍半萜类化合物为含有2-(三氢-2h-吡喃-2基)丙醇(2-(tetrahydro-2h-pyran-2-yl)propan-2-ol)单元的倍半萜类化合物，丰富了倍半萜类化合物的多样性，同时，对本发明提供的倍半萜类化合物的免疫促进活性筛选试验表明，本发明提供的倍半萜类化合物对在刀豆蛋白(cona)或脂多糖(lps)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，表现出一定的促进免疫增强作用，能够应用于制备免疫促进药物。
[0026]
本发明提供了上述技术方案所述的倍半萜类化合物的制备方法。本发明提供的制备方法基于微生物发酵制备得到，制备方法周期短、培养条件温和、副产物少、成本低，实现了环保低碳的需求，易于实现工业化。
附图说明
[0027]
图1为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的1h-nmr谱图；
[0028]
图2为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的
13
c-nmr和dept谱图；
[0029]
图3为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的1h-1
h cosy谱图；
[0030]
图4为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的hmbc谱图；
[0031]
图5为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的hsqc谱图；
[0032]
图6为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的noesy谱图；
[0033]
图7为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的hr-esi-ms谱图；
[0034]
图8为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine e的ecd实验和计算图谱；
[0035]
图9为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的1h-nmr谱；
[0036]
图10为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的
13
c-nmr和dept谱图；
[0037]
图11为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的1h-1
h cosy谱图；
[0038]
图12为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的hmbc谱图；
[0039]
图13为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的hsqc谱图；
[0040]
图14为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的roesy谱图；
[0041]
图15为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的hr-esi-ms谱图；
[0042]
图16为本发明中免疫促进活性化合物bipodonine g的ecd实验和计算图谱。
具体实施方式
[0043]
本发明提供了一种倍半萜类化合物，具有式1或式2所示结构：
[0044][0045]
在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。
[0046]
本发明通过一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱(1d/2d nmr)、hr-esi-ms以及量子化学ecd计算结合对式1和式2所示结构的倍半萜类化合物的结构进行鉴定，1h、
13
c、1h-1
h cosy、hmbc、hsqc、roesy核磁数据，hr-esi-ms以及ecd计算图谱见说明书附图1～16。
[0047]
本发明提供了上述技术方案所述的倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0048]
将狗牙根平脐蠕孢真菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物；
[0049]
将所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到倍半萜类化合物的粗提物；
[0050]
将所述倍半萜类化合物的粗提物和硅胶混合，得到的混合料装柱，进行第一柱层析分离，所述第一柱层析分离按照体积比由大到小，采用氯仿和甲醇的体积比为100:0～10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，合并相同馏分，得到五段馏分，分别命名为fr.1～fr.5馏分；
[0051]
将fr.2馏分进行第二柱层析分离，得到含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液；所述第二柱层析分离的洗脱剂为第一石油醚-丙酮体系；
[0052]
将fr.4馏分进行第三柱层析分离，得到含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液；所述第三柱层析分离的洗脱剂为第二石油醚-丙酮体系；
[0053]
将所述含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第一凝胶色谱纯化，得到式1所示结构的倍半萜类化合物的纯品；
[0054]
将所述含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第二凝胶色谱纯化，得到式2所示结构的倍半萜类化合物的纯品。
[0055]
本发明将狗牙根平脐蠕孢真菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物。
[0056]
在本发明中，所述狗牙根平脐蠕孢真菌为短距乌头的内生真菌，优选从短距乌头的根部分离得到。本发明对所述分离的方法无特殊要求，采用本领域常规的技术手段即可。进行所述发酵之前，本发明优选对所述狗牙根平脐蠕孢真菌进行活化；所述活化优选为：将所述狗牙根平脐蠕孢真菌接种到pda斜面培养基上，进行恒温培养，得到活化的狗牙根平脐蠕孢真菌。在本发明中，所述恒温培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃，时间优选3～7天，更优选为5天。本发明优选将得到的活化的狗牙根平脐蠕孢真菌置于5℃的环境中储存备用。
[0057]
在本发明中，所述发酵优选为固体发酵。
[0058]
在本发明中，所述发酵培养基的原料优选包括马铃薯和/或大米。在本发明中，所述发酵采用的所述发酵培养基的制备方法优选包括以下步骤：
[0059]
将培养基的原料依次进行高温灭菌和冷却，得到所述发酵培养基。
[0060]
在本发明中，所述培养基的原料优选为马铃薯时，所述高温灭菌之前，本发明优选将所述马铃薯进行去皮和破碎，所述破碎优选将所述马铃薯进行切块，所述切块得到的块体的体积优选为1.0cm3。在本发明中，所述发酵培养基的制备过程优选在组织培养瓶中进行；所述发酵培养基的原料的质量与所述组织培养瓶的体积之比优选为45～55g：75～85ml，更优选为50g：80ml。在本发明中，所述高温灭菌的温度优选为120～150℃，更优选为121～130℃；时间优选为30～50min，更优选为35～40min。本发明在进行所述高温灭菌时优选将组织培养瓶进行加盖处理。本发明对所述冷却的方式无特殊限定，只要能够冷却至室温即可。
[0061]
在本发明中，所述发酵优选为：将所述活化的狗牙根平脐蠕孢真菌接种在发酵培养基中，所述接种的接种量(狗牙根平脐蠕孢真菌和发酵培养基的质量比)优选为0.5％。本发明对所述接种的条件没有特殊的要求，选用本领域技术人员熟知的方式进行接种即可。在本发明中，所述发酵的温度优选为20～30℃，更优选为20～25℃；时间优选为30～40天，更优选为35天。本发明采用固体发酵方式能够有效缩短发酵时间。
[0062]
得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物后，本发明将所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到倍半萜类化合物的粗提物。
[0063]
在本发明中，所述醇类溶剂优选包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种，更优选包括甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇，进一步优选为甲醇。在本发明中，所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物的质量与醇类溶剂的体积之比优选为(50～70)g:(80～130)ml，更优选为60g:120ml。在本发明中，所述醇类溶剂对式1和式2所示结构倍半萜类化合物具有很好的溶解性，能够很好的将式1和式2所示结构倍半萜类化合物从狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物中分离出来。本发明对混合的方式无特殊要求只要能够混合均匀即可。
[0064]
在本发明中，所述超声提取的功率优选为250～350w，更优选为300w，时间优选为20～40min，更优选为30min。
[0065]
在本发明中，所述超声提取后，本发明还优选包括将超声提取后的体系过滤；本发明对所述过滤无特殊限定，采用常规的过滤方式即可。所述过滤后，本发明优选对所得滤液进行减压蒸馏除去滤液中溶剂，得到倍半萜类化合物的粗提物。在本发明中，所述减压蒸馏的的真空度优选为10～15kpa，更优选为12kpa；所述减压蒸馏的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。本发明对减压蒸馏的时间无特殊限定只要能够将滤液中溶剂除去即可。
[0066]
得到倍半萜类化合物的粗提物后，本发明将所述倍半萜类化合物的粗提物和硅胶混合，得到的混合料装柱，进行第一柱层析分离，所述第一柱层析分离按照体积比由大到小，采用氯仿和甲醇的体积比为100:0～10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，合并相同馏分，得到五段馏分，分别命名为fr.1～fr.5馏分。
[0067]
在本发明中，所述倍半萜类化合物的粗提物优选以粗提物溶液的形式与所述硅胶混合。在本发明中，所述粗提物溶液中的溶剂优选为二氯甲烷。本发明优选用二氯甲烷所述倍半萜类化合物的粗提物，得到所述粗提物溶液。
[0068]
在本发明中，所述倍半萜类化合物的粗提物干重和所述硅胶的质量比优选为1:(1～1.2)。在本发明中，所述硅胶的目数为300～400目。本发明优选去除溶剂后得到的混合料，将所述混合料装柱。
[0069]
在本发明中，所述第一柱层析分离优选为：依次采用体积比为100:0、100:1、50:1、30:1和10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱。在本发明中，各比例分别洗脱3个柱体积，然后合并各比例的洗脱液。所得洗脱液进行薄层层析(tlc)，合并相同馏分，得到五段馏分，分别命名为馏分fr.1馏分、fr.2馏分、fr.3馏分、fr.4馏分和fr.5馏分；所述第一柱层析分离优选在室温条件下进行。
[0070]
本发明将fr.2馏分进行第二柱层析分离，得到含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液。在本发明中，所述第二柱层析分离优选为硅胶柱层析分离；所述第二柱层析分离的洗脱剂优选为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系，更优选为石油醚-丙酮体系。在本发明中，所述第二柱层析分离使用的石油醚-丙酮体系中，石油醚和丙酮的体积比优选为30:1。在本发明中，所述第二柱层析分离的洗脱剂的流速优选为2～5ml/min，更优选为3.5ml/min。
[0071]
本发明将fr.4馏分进行第三柱层析分离，得到含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液。在本发明中，所述第三柱层析分离优选为硅胶柱层析分离；所述第三柱层析分离的洗脱剂优选为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系，更优选为石油醚-丙酮体系。在本发明中，所述第二柱层析分离使用的石油醚-丙酮体系中，石油醚和丙酮的体积比优选为15:1。在本发明中，所述第三柱层析分离的洗脱剂的流速优选为2～5ml/min，更优选为3.5ml/min。
[0072]
本发明将所述含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第一凝胶色谱纯化，得到式1所示结构的倍半萜类化合物的纯品。在本发明中，所述第一凝胶色谱纯化的填料优选为葡聚糖凝胶，所述第一凝胶色谱纯化的溶剂优选为甲醇或甲醇-氯仿体系，更优选为甲醇；所述甲醇-氯仿体系中，甲醇和氯仿的体积比优选为2:1。所述第一凝胶色谱纯化的溶剂的流速优选为0.5～0.7ml/min，更优选为0.6ml/min。在本发明中，第一凝胶色谱纯化得到第一纯化液，本发明优选对所述第一纯化液除溶剂，得到式1所示结构的倍半萜类化合物的纯品。在本发明中，所述去除溶剂的方法优选为减压蒸馏；所述减压蒸馏的温度优选为48～55℃，更优选为50℃。
[0073]
本发明将所述含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第二凝胶色谱纯化，得到式2所示结构的倍半萜类化合物的纯品。在本发明中，所述第二凝胶色谱纯化的填料优选为葡聚糖凝胶，所述第二凝胶色谱纯化的溶剂优选为甲醇或甲醇-氯仿体系，更优选为甲醇；所述甲醇-氯仿体系中，甲醇和氯仿的体积比优选为2:1。所述第二凝胶色谱纯化的
溶剂的流速优选为0.5～0.7ml/min，更优选为0.6ml/min。在本发明中，第二凝胶色谱纯化得到第二纯化液，本发明优选对所述第二纯化液除溶剂，得到式2所示结构的倍半萜类化合物的纯品。在本发明中，所述去除溶剂的方法优选为减压蒸馏；所述减压蒸馏的温度优选为48～55℃，更优选为50℃。
[0074]
本发明提供了上述技术方案倍半萜类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的倍半萜类化合物在制备免疫促进药物中应用。
[0075]
本发明提供了一种免疫促进药物，包括上述技术方案倍半萜类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的倍半萜类化合物和药物辅料。在本发明中，所述免疫促进药物中，上述技术方案倍半萜类化合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的倍半萜类化合物的质量百分含量优选为1～99％，更优选为55～90％。本发明对所述药用辅料没有特殊的限定，选择本领域常规的制药辅料即可。本发明对所述免疫促进药物的剂型和制备方法没有特殊的限定，采用本领域熟知的制备方法制成片剂、颗粒剂或注射剂等剂型均可。
[0076]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0077]
实施例1
[0078]
将狗牙根平脐蠕孢真菌接种到pda斜面培养基上，在28℃条件下恒温培养5天后，得到活化的狗牙根平脐蠕孢真菌，置于5℃环境中储存备用；
[0079]
将5.0kg马铃薯去皮洗净切成体积为1cm3的土豆块并分装于100个体积为350ml组织培养瓶中(50g/瓶)，然后将组织培养瓶加盖后在121℃条件下高温灭菌30min，冷却，得到发酵培养基；
[0080]
将所述活化的狗牙根平脐蠕孢真菌按照0.5％的接种量接种到所述发酵培养基中，加盖后在常温培养35天，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物；
[0081]
取得到的狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与120ml甲醇按照质量体积比(50g/120ml)混合，混合后在40khz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压蒸馏(真空度为12kpa，50℃)至无醇味，得到83.0g粗提物；
[0082]
将所述83.0g粗提物溶解于100ml二氯甲烷中，再与83.0g硅胶(300～400目)混合后减压浓缩(真空度为12kpa，50℃)去除溶剂，装柱；利用氯仿和甲醇的体积比为100:0、100:1、50:1、30:1、10:1的溶液进行梯度洗脱，分别得到五个馏分fr.1馏分、fr.2馏分、fr.3馏分、fr.4馏分和f.r5馏分；将所述fr.3馏分以体积比为30:1的石油醚-丙酮为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到式1所示结构的倍半萜类化合物(记为bipodonine e)的洗脱液，将所述fr.4馏分以体积比为15:1的石油醚-丙酮为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到式1所示结构的倍半萜类化合物(记为bipodonine g)的洗脱液；
[0083]
将bipodonine e的洗脱液和bipodonine g的洗脱液分别经葡聚糖凝胶以甲醇为溶剂纯化得到化合物bipodonine e的纯品和化学物bipodonine g的纯品。
[0084]
实施例2结构的鉴定
[0085]
将实施例1制备得到的bipodonine e和bipodonine g进行核磁共振光谱仪检测，得到1d/2d nmr(一维核磁共振波谱和二维核磁共振波谱)、hr-esi-ms(高分辨电喷雾电离质谱)以及量子化学ecd计算(如图1～16)鉴定得到的化合物bipodonine e和bipodonine g及其结构。
[0086]
由hsqc谱结合碳谱可以得到化合物bipodonine e和bipodonine g的h和与之相连接的c的化学位移δ归属如表1所示。
[0087]
表1 bipodonine e和bipodonine g的
13
c和1h nmr数据。
[0088]
no.1
a 2bꢀꢀ
δh(jinhz)δcδh(jinhz)δc11.76dd(6.9,1.2)44.610.01d207.2 1.10overlap
ꢀꢀꢀ
24.14td(11.2,4.7)66.52.07s64.83 211.5 71.442.43m57.31.41m39.1
ꢀꢀꢀ
1.75dt(14.3,3.1) 51.50m29.01.45m21.4 1.96dt(12.7,4.1) 1.66m 63.20overlap82.13.16dd(11.9,3.5)83.77 33.7 37.681.31m38.51.57dd(12.6,3.9)37.6 1.60m 1.91dt(11.5,3.8) 91.47m21.61.50m24.0 1.60m 1.84m 103.23oerlap85.43.25dd(11.7,2.8)85.111 72.0 72.0121.16s3h26.11.18s3h26.1 131.14s3h23.91.17s3h24.0 140.91s3h16.51.23s3h13.8 152.19s3h29.11.21s3h31.1
[0089]ameasured in cdcl3(600 mhz for 1
h nmr and 150 mhz for 13
c nmr)
[0090]
b measured in cdcl3(400 mhz for 1
h nmr and 100 mhz for 13
c nmr)
[0091]
化合物1是白色粉末。化合物1的高分辨质谱(high-resolution electrospray ionization mass spectrum，hr-esi-ms)的m/z 293.1723[m+na]
+
(calcd.for c
15h26
o4na
+
,293.1723)表明其分子式为c
15h26
o4，不饱和度为3。其中一个羰基(-co-)占据了一个不饱和度，其余2个不饱和度表明化合物1具有两环骨架。综合分析化合物1的1h，
13
c，dept和hsqc nmr谱图可知化合物1显示有15个碳，包括三个甲基[δ
h 1.16(h
3-12),1.14(h
3-13),0.91(h
3-14),2.19(h
3-15)；δ
c 26.1(c-12),23.9(c-13),16.5(c-14),29.1(c-15)]，四个亚甲基[δ
h 1.76(h-1a),1.10(h-1b),1.50(h-5a),1.96(h-5b),1.31(h-8a),1.60(h-8b),1.47(h-9a),1.60(h-9b)；δ
c 44.6(c-1),29.0(c-5),38.5(c-8),21.6(c-9)]，四个次甲基[δ
h 4.14(h-2,oxygenated),2.43(h-4),3.20(h-6,oxygenated),3.23(h-10,oxygenated)；δ
c 66.5(c-2,oxygenated),57.3(c-4),82.1(c-6,oxygenated),85.4(c-10,oxygenated)]，三个季碳[δ
c 33.7(c-7),72.0(c-11,oxygenated)]，以及一个羰基[δ
c 211.5(c-3)]。
[0092]
结合化合物1的1d和2d nmr图谱分析，从hmbc谱可观察到h-10和h
2-8分别与c-6相
pbs离心洗两次(1000rpm/min，5min)，弃上清，得到灰白色的脾细胞沉淀，用rpmi-1640培养基悬浮细胞，制成一定浓度的单细胞悬液，台盼蓝染色细胞计数，活细胞数大于95％，调整细胞浓度为1
×
105个/ml。
[0100]
mts法检测小鼠脾淋巴细胞增殖：取已制备的小鼠脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，180μl/孔。试验分为细胞空白对照组(每孔加40μlrpmi-1640)；诱导剂cona或lps单独刺激组(每孔加10μl诱导剂，10μlrpmi-1640)；样品协同cona或lps刺激组，每孔加样品溶液10μl(样品终浓度为20μm)，10μl的诱导剂cona或lps(终浓度为10μg/ml)，每组3个复孔。于37℃，5％co2培养箱中培养72h，加入20μlmts,培养3h，振荡10min，于490nm处，测吸光值。
[0101]
实验结果显示，化合物bipodonine e和bipodonine g对在刀豆蛋白(cona)或脂多糖(lps)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，表现出一定的促进免疫增强作用。(表2cona/lps为阳性对照，control为空白对照)。因此，bipodonine e和bipodonine g具有作为先导化合物开发免疫促进药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的免疫促进化合物bipodonine e和bipodonine g的方法，不仅可以实验环保低碳的需求，而且还能实现量产新途径，为开发免疫促进药物提供新的选择。
[0102]
表2化合物bipodonine e和bipodonine g对(a)刀豆蛋白(cona)和(b)脂多糖(lps)诱导细胞增殖率
[0103]
compdcell proliferation(％)compdcell proliferation(％)化合物1-化合物128.8化合物237.2化合物240.3control12.3control11.0cona28.9lps21.3
[0104]
实施例4
[0105]
将狗牙根平脐蠕孢真菌接种到pda斜面培养基上，在28℃条件下恒温培养5天后，得到活化的狗牙根平脐蠕孢真菌，置于5℃环境中储存备用；
[0106]
将50g大米在水中浸泡过夜，将浸泡后的大米置于体积为350ml组织培养瓶中，然后将组织培养瓶加盖后在121℃下高温灭菌30min，冷却，得到发酵培养基；
[0107]
将所述活化的狗牙根平脐蠕孢真菌按照0.5％的接种量接种到所述发酵培养基中，加盖后在常温培养35天，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物；
[0108]
取得到的狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与120ml甲醇按照质量体积比(50g/120ml)混合，混合后在40khz条件下超声30min，过滤，取滤液进行减压蒸馏(真空度为12kpa，50℃)至无醇味，得到14.0g粗提物；
[0109]
将所述14.0g粗提物溶解于40ml二氯甲烷中，再与14.0g硅胶(300～400目)混合后减压浓缩(真空度为12kpa，50℃)去除溶剂，装柱；利用氯仿和甲醇的体积比为100:0、100:1、50:1、30:1、10:1的溶液进行梯度洗脱，分别得到五个馏分fr.1馏分、fr.2馏分、fr.3馏分、fr.4馏分和fr.5馏分；将所述fr.3馏分以体积比为30:1的石油醚-丙酮为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到bipodonine e的洗脱液，将所述fr.4馏分以体积比为15:1的石油醚-丙酮为洗脱剂进行硅胶柱层析洗脱，得到bipodonine g的洗脱液，以上各洗脱液经葡聚糖凝胶以甲醇为溶剂纯化得到化合物bipodonine e和bipodonine g。
[0110]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，
而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种倍半萜类化合物，其特征在于，具有式1或式2所示结构：2.权利要求1所述的倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将狗牙根平脐蠕孢真菌接种于发酵培养基中进行发酵，得到狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物；将所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物与醇类溶剂混合，进行超声提取，得到倍半萜类化合物的粗提物；将所述倍半萜类化合物的粗提物和硅胶混合，得到的混合料装柱，进行第一柱层析分离，所述第一柱层析分离按照体积比由大到小，采用氯仿和甲醇的体积比为100:0～10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱，合并相同馏分，得到五段馏分，分别命名为fr.1～fr.5馏分；将fr.2馏分进行第二柱层析分离，得到含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液；所述第二柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系；将fr.4馏分进行第三柱层析分离，得到含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液；所述第三柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系或石油醚-乙酸乙酯体系；将所述含有式1所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第一凝胶色谱纯化，得到式1所示结构的倍半萜类化合物的纯品；将所述含有式2所示结构的倍半萜类化合物的洗脱液进行第二凝胶色谱纯化，得到式2所示结构的倍半萜类化合物的纯品。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的原料包括马铃薯和/或大米；所述发酵为固体发酵。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为20～25℃，所述发酵的时间为30～35d。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种；所述狗牙根平脐蠕孢真菌发酵物的质量与所述醇类溶剂的体积之比为(50～70)g:(80～130)ml。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一柱层析分离为：依次采用体积比为100:0、100:1、50:1、30:1和10:1的氯仿-甲醇体系进行梯度洗脱。7.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，所述倍半萜类化合物的粗提物干重和所述硅胶的质量比为1:(1～1.2)；所述硅胶的目数为300～400目。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第二柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系；石油醚和丙酮的体积比为30:1。9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第三柱层析分离的洗脱剂为石油醚-丙酮体系，石油醚和丙酮的体积比为15:1。10.权利要求1所述的倍半萜类化合物或权利要求2～9所述的制备方法制备得到的倍
半萜类化合物在制备免疫促进药物中应用。

技术总结
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用。本发明提供了一种倍半萜类化合物，具有式1或式2所示结构。本发明提供的具有式1或式2所示结构的倍半萜类化合物为含有2-(三氢-2H-吡喃-2基)丙醇单元的倍半萜类化合物，丰富了倍半萜类化合物的多样性，同时，对本发明提供的倍半萜类化合物的免疫促进活性筛选试验表明，本发明提供的倍半萜类化合物对在刀豆蛋白(ConA)或脂多糖(LPS)诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，表现出一定的促进免疫增强作用，能够应用于制备免疫促进药物。物。物。物。


技术研发人员：蔡乐 丁中涛 舒燕 王家鹏
受保护的技术使用者：云南大学
技术研发日：2023.03.27
技术公布日：2023/7/20