一种用于提高眼镜王蛇联合肽DAMP4-OH30高密度表达的方法与流程

一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法。


背景技术：

2.眼镜王蛇联合肽damp4-oh30是按照眼镜王蛇抗菌肽序列和酵母密码子偏爱性全基因合成的联合肽，具有较强抗细菌感染的多肽，能够对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌及大肠杆菌等革兰氏阴性菌具有较好的抑菌效果。现阶段采用传统的方法生产眼镜王蛇联合肽damp4-oh30，培养基原料成本高，发酵生产周期长，表达量较低，抑菌活性不强，无法进行工业化生产等。为了解决上述问题，我们提出并多次试验了本方法，通过实验证明该方法可以大幅提高了眼镜王蛇联合肽damp4-oh30的分泌水平，具有较强的抑菌活性，工业生产成本较低，能够作为规模化生产。


技术实现要素：

3.本发明是提供一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，该方法在溶解氧（do）、甲醇流加上进行优化，大幅度提高了眼镜王蛇联合肽damp4-oh30的分泌水平，工业生产成本低，能够作为规模化生产。
4.本发明采用以下技术方案：1、对眼镜王蛇联合肽damp4-oh30进行发酵培养（1）眼镜王蛇联合肽damp4-oh30制备根据现有的眼镜王蛇抗菌肽氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的偏好性对眼镜王蛇抗菌肽基因序列进行优化，随后送至生物公司进行全基因合成得到眼镜王蛇联合肽。
5.（2）发酵培养前的准备：
①
对眼镜王蛇联合肽菌株在含博来霉素（zeo）的ypd平板上进行划线活化，在29℃恒温培养箱上培养3-4天，采用反复冻融法提取单克隆酵母基因组，然后pcr扩增、dna电泳验证目的基因条带。
6.②
在无菌工作台上挑取目的条带大小、亮度合适的单克隆菌株接种于一级种子液培养基中，接种完成后将其转移到29℃，220rpm恒温摇床进行摇培16-17h， 当值在1.5-1.7时在无菌工作台上转接到二级种子液培养基中，接种量为1%-2%，将接种好的二级种子液继续在29℃，220rpm恒温摇床进行摇培12h-14h，当在1.7-1.8时即可转入发酵罐中进行发酵。
7.（3）对发酵罐罐体进行空消后自然冷却至常温，将提前配置好的bmmy培养基倒入发酵罐中，121℃灭菌30min，用冷却水将其冷却至28℃-30℃，调节发酵罐ph值、溶解氧等条件，再将摇培好的二级种子液，10xynb、0.02%生物素于发酵罐接种口中倒入发酵罐中，进行发酵培养120h-160h；（4）生长阶段各条件设置为30℃、ph 5.0、溶氧维持在27%-33%之间，生长阶段发酵
时间24h-36h，当发酵罐中碳源消耗完成时立即补加40%葡萄糖，菌株继续高密度培养，菌体湿重达到诱导标准时停止补加葡萄糖，并立即进行饥饿培养1h-1.5h；饥饿培养结束后即进入诱导阶段，诱导阶段各条件设置温度为25℃，ph 5.0，溶氧为5%-30%之间，诱导阶段按6g/l/h（0-7h）-1g/l/h(8-11h)、7g/l/h（12-18h）-1g/l/h(19-22h)...11g/l/h（23-29h）-1g/l/h(30-33h)甲醇流加策略，总计诱导时间为3*33h，即重复3次所述甲醇流加策略，每12h取样做平板抑菌实验，观察实验结果，若抑菌活性降低则可结束发酵。
8.（5）发酵结束后将发酵液排出发酵罐，在管式离心机13400-13500 rpm将发酵液离心取上清液，将离心好的上清液过膜过滤，保留目标分子，然后制备成眼镜王蛇联合肽粗品。
9.其中，所述步骤（3）中10xynb、0.02%生物素不能高温灭菌，无菌抽滤在无菌工作台进行。
10.其中，所述步骤（4）中的甲醇为工业甲醇。
11.其中，所述步骤（4）中溶氧值在15%
±
2%。
12.其中，所述步骤（5）中最后将离心剩下的菌体进行烘干研磨成粉末，将其添加到家禽饲料中。
13.其中，一级种子液和二级种子液培养基配制方法为：取葡萄糖 200g/l、胰蛋白胨 20g/l、酵母提取物 11g/l，葡萄糖与蛋白胨和酵母提取物分开单独灭菌，将葡萄糖加去离子水溶解完成后定容至1l，108℃灭菌30min待用；将称量好的胰蛋白胨、酵母提取物加入去离子水搅拌均匀，121℃灭菌30min，自然冷却至常温，在无菌工作台按1:3的比例加入灭菌好的葡萄糖，制得一级种子液培养基和二级种子液培养基。
14.其中，10l发酵罐培养基配制方法如下：按6l的体系培养该培养基，取葡萄糖 50g/l、胰蛋白胨 20g/l、酵母提取物 11g/l、ph 6.0磷酸钾缓冲液 450ml、10xynb 600ml、0.02%生物素 12ml,采用常规方法制备发酵罐培养基，将配置好的培养基加去离子水搅拌均匀，在发酵罐中108℃灭菌30min，因在配置发酵罐培养基时把葡萄糖也一同加进去。灭菌完成后先用无菌空气给发酵罐降温，等温度降至80℃以下时，为了快速降温可以用直来水或冷却水降温，冷却至30℃时停止继续降温，将发酵罐温度维持在30℃，制得10l发酵罐培养基。
15.其中，磷酸钾缓冲液配制方法：取磷酸二氢钾 136g/l、磷酸氢二钾 228.2g/l，将配置好的溶液倒入容器中，用磷酸二氢钾调节溶液ph至6.0。
16.其中，10xynb配制方法如下：取硫酸铵 100g/l、生物素4mg/l、泛酸钙 8mg/l、叶酸 4mg/l、肌醇 40mg/l、烟酸 8mg/l、对羟基苯甲酸 4mg/l、盐酸吡哆辛8mg/l、核黄素 4mg/l、盐酸硫胺素 8mg/l、硼酸 10mg/l、硫酸铜 0.8mg/l、碘化钾 2mg/l、三氯化铁 4mg/l、硫酸锰 8mg/l、硫酸锌 8mg/l、钼酸钠 4mg/l、磷酸二氢钾 20g/l、硫酸镁 10g/l、氯化钠 2g/l、氯化钙 2g/l，加去离子水搅拌溶解等溶解完成后定容至1l备用。
17.本发明所提供的方法的优势是：本发明在对溶解氧（do）、温度及甲醇流加策略上进行优化后，显著提高了眼镜王蛇联合肽damp4-oh30分泌水平，且操作简单，工业生产成本低，能够为规模化生产打下基础。
附图说明
18.图1为实施例1的抑菌结果图。
19.图2为实施例2的抑菌结果图。
20.图3为实施例3的抑菌结果图。
21.图4为表1：10l发酵罐诱导期各条件具体数值的表格。
22.图5为表2：10l发酵罐诱导期各条件具体数值的表格。
23.图6为表3：10l发酵罐诱导期各条件具体数值的表格。
具体实施方式
24.本发明提供一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，下面结合附图进行具体说明。
25.胰蛋白胨、酵母提取物购于北京鸿润宝顺科技有限公司；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾购于四川金地亚美科技有限公司：硫酸铵、无水甲醇、生物素、硼酸、硫酸铜、碘化钾、三氯化铁、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、琼脂购于国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖购于齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司：10xynb为复配试剂级，除以上标注外，其他原料均购于上海麦克林生化科技有限公司；以下5种试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖均为食品级试剂；无水甲醇为工业级。除以上特别指明外，本发明以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。
26.本发明各级培养基的制备方法如下：一级种子液培养基和二级种子液培养基：取葡萄糖 200g/l、胰蛋白胨 20g/l、酵母提取物 11g/l，将葡萄糖加去离子水溶解完成后定容至1l，108℃灭菌30min待用。在称量好胰蛋白胨、酵母提取物中加入离子水搅拌均匀，121℃灭菌30min，自然冷却至常温，然后在无菌超净工作台按1:3的比例加入灭菌好的葡萄糖，制得一级种子液培养基。
27.10l发酵罐bmmy培养基：按6l的体系培养该培养基，取葡萄糖 45g/l、胰蛋白胨 20g/l、酵母提取物 11g/l、ph 6.0磷酸钾缓冲液 600ml、10xynb 600ml、0.02%生物素 12ml,采用常规方法制备培养基，将配置好的培养基加去离子水搅拌均匀，在发酵罐中121℃灭菌30min，灭菌完成后开启冷却设备用无菌空气降温，冷却至30℃，制得10l发酵罐培养基。
28.磷酸钾缓冲液：取磷酸二氢钾 136g/l、磷酸氢二钾 228.2g/l，将配置好的溶液倒入容器中，用磷酸二氢钾调节溶液ph至6.0。
29.10xynb配方如下：取硫酸铵 100g/l、生物素4mg/l、泛酸钙 8mg/l、叶酸 4mg/l、肌醇 40mg/l、烟酸 8mg/l、对羟基苯甲酸 4mg/l、盐酸吡哆辛8mg/l、核黄素 4mg/l、盐酸硫胺素 8mg/l、硼酸 10mg/l、硫酸铜 0.8mg/l、碘化钾 2mg/l、三氯化铁 4mg/l、硫酸锰 8mg/l、硫酸锌 8mg/l、钼酸钠 4mg/l、磷酸二氢钾 20g/l、硫酸镁 10g/l、氯化钠 2g/l、氯化钙 2g/l，加去离子水搅拌溶解等溶解完成后定容至1l备用。
实施例
30.1.对眼镜王蛇联合肽damp4-oh30进行发酵培养（1）眼镜王蛇联合肽damp4-oh30的制备根据现有的眼镜王蛇抗菌肽氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的偏好性对眼镜王蛇抗菌肽基因序列进行优化，随后送至生物公司进行全基因合成得到眼镜王蛇联合肽。
31.（2）发酵培养前的准备：
①
对眼镜王蛇联合damp4-oh30肽菌株在含博来霉素（zeo）的ypd平板上进行划线活化，在29℃恒温培养箱上培养3-4d，采用反复冻融法提取单克隆酵母基因组，然后pcr扩增、dna电泳验证目的基因条带。
32.②
选取目的条带大小、亮度合适的单克隆在无菌工作台上接种于一级种子液培养基中，接种完成后将其转移到29℃，220rpm恒温摇床进行摇培16-17h，当 值在1.5-1.7时在无菌工作台上转接到二级种子液培养基中，接种量为1%-2%，将接种好的二级种子液继续在29℃，220rpm恒温摇床进行摇培12h-14h，当在1.7-1.8时即可转入发酵罐中进行发酵。
33.（3）对发酵罐罐体进行空消后自然冷却至常温，将提前配置好的bmmy培养基倒入发酵罐中，121℃灭菌30min，用冷却水将其冷却至28℃-30℃，调节发酵罐ph值、溶解氧等条件，再将摇培好的二级种子液，10xynb、0.02%生物素于发酵罐接种口中倒入发酵罐中，进行发酵培养120h-160h。10xynb、0.02%生物素不能高温灭菌，只能在无菌工作台进行无菌抽滤。
34.（4）生长阶段各条件设置为30℃、ph 5.0、溶氧维持在27%-33%之间，生长阶段发酵时间24h-36h，当发酵罐中碳源消耗完成时立即补加40%葡萄糖，菌株继续高密度培养，菌体湿重达到诱导标准时停止补加葡萄糖，并立即进行饥饿培养1h-1.5h，饥饿培养结束后即进入诱导阶段，诱导阶段各条件设置温度为25℃，ph 5.0，溶氧为5%-30%之间，诱导阶段按6g/l/h（0~9h）-1g/l/h(10~14h)、7g/l/h（15~23h）-1g/l/h(24~28h)、11g/l/h（29~37h）-1g/l/h(38~42h)流加工业甲醇，重复3次，总计诱导时间为42h*3，每12h取样做平板抑菌实验，观察实验结果，若抑菌活性降低则可结束发酵。
35.（4）发酵结束后将发酵液排出发酵罐，在管式离心机13400-13500 rpm将发酵液离心取上清液，将离心好的上清液过膜过滤，保留目标分子，然后制备成眼镜王蛇联合肽粗品。将离心剩下的菌体进行烘干研磨成粉末，可以将其添加到家禽饲料中，避免造成资源浪费和环境污染。
36.发酵具体数值如图4的表2，抑菌结果见图1。
37.由图1抑菌平板可以看出6个发酵罐的发酵离心上清液对大肠杆菌抑菌活性效果显著，对大肠杆菌抑菌圈在2.3cm-2.72cm。3号发酵罐抑菌效果最为显著，抑菌活性为2.55cm。
38.实施例2：本发明提供的高密度表达实验继续在溶氧（do）、甲醇添加量进行优化。一、二级种子液和发酵罐培养基的制备，各级种子液接种、发酵过程中生长阶段各条件设置、补料、饥饿培养及后期发酵液的处理等重复实施1发酵工艺步骤进行实验。
39.发酵具体数值如下图5表2，抑菌结果见图2。
40.由图2抑菌平板可以看出6个发酵罐的发酵离心上清液对大肠杆菌都有不同程度
的抑菌活性，对大肠杆菌抑菌圈在1.8cm-3.5cm。3号发酵罐抑菌效果最为显著，抑菌活性为3.5cm。
41.实施例3：本发明提供的高密度表达实验继续在溶氧（do）、甲醇添加量进行优化。一、二级种子液和发酵罐培养基的制备，各级种子液接种、发酵过程中生长阶段各条件设置、补料、饥饿培养及后期发酵液的处理等重复实施1发酵工艺步骤进行实验。
42.发酵具体数值如图6的表3，抑菌结果见图3。
43.由图3抑菌平板可以看出6个发酵罐的发酵离心上清液对大肠杆菌都有不同程度的抑菌活性，对大肠杆菌抑菌圈在2.3cm-2.85cm。4号发酵罐抑菌效果最为显著，抑菌活性为2.85cm。
44.结论：在诱导期其他条件保持不变，溶氧（do）=15%
±
2%、甲醇添加量为：6g/l/h（7h）-1g/l/h(4h)、7g/l/h（7h）-1g/l/h(4h)...11g/l/h（7h）-1g/l/h(4h)时眼镜王蛇联合肽表达量最高。

技术特征：
1.一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，主要包括以下步骤：（1）眼镜王蛇联合肽damp4-oh30制备根据现有的眼镜王蛇抗菌肽氨基酸序列，按照毕赤酵母密码子的偏好性对眼镜王蛇抗菌肽基因序列进行优化，随后送至生物公司进行全基因合成得到眼镜王蛇联合肽；（2）发酵培养前的准备
①
对眼镜王蛇联合肽菌株在含博来霉素的ypd平板上进行划线活化，在29℃恒温培养箱上培养3-4天，采用反复冻融法提取单克隆酵母基因组，然后pcr扩增、dna电泳验证目的基因条带；
②
在无菌工作台上挑取目的条带大小、亮度合适的单克隆菌株接种于一级种子液培养基中，接种完成后将其转移到29℃，220rpm恒温摇床进行摇培16-17h，当od600值在1.5-1.7时在无菌工作台上转接到二级种子液培养基中，接种量为1%-2%，将接种好的二级种子液继续在29℃，220rpm恒温摇床进行摇培12h-14h，当od600在1.7-1.8时即可转入发酵罐中进行发酵；（3）对发酵罐罐体进行空消后自然冷却至常温，将提前配置好的bmmy培养基倒入发酵罐中，121℃灭菌30min，用冷却水将其冷却至28℃-30℃，调节发酵罐ph值、溶解氧等条件，再将摇培好的二级种子液，10xynb、0.02%生物素于发酵罐接种口中倒入发酵罐中，进行发酵培养120h-160h；（4）生长阶段各条件设置为30℃、ph 5.0、溶氧维持在27%-33%之间，生长阶段发酵时间24h-36h，当发酵罐中碳源消耗完成时立即补加40%葡萄糖，菌株继续高密度培养，菌体湿重达到诱导标准时停止补加葡萄糖，并立即进行饥饿培养1h-1.5h；饥饿培养结束后即进入诱导阶段，诱导阶段各条件设置温度为25℃，ph 5.0，溶氧为5%-30%之间，诱导阶段按6g/l/h（0-7h）-1g/l/h(8-11h)、7g/l/h（12-18h）-1g/l/h(19-22h)...11g/l/h（23-29h）-1g/l/h(30-33h)甲醇流加策略，总计诱导时间为3*33h，即重复3次所述甲醇流加策略，每12h取样做平板抑菌实验，观察实验结果，若抑菌活性降低则可结束发酵；（5）发酵结束后将发酵液排出发酵罐，在管式离心机13400-13500 rpm将发酵液离心取上清液，将离心好的上清液过膜过滤，保留目标分子，然后制备成眼镜王蛇联合肽粗品。2.根据权利要求1所述的一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，所述步骤（3）中10xynb、0.02%生物素不能高温灭菌，无菌抽滤在无菌工作台进行。3.根据权利要求1所述的一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，所述步骤（4）中的甲醇为工业甲醇。4.根据权利要求1所述的一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，所述步骤（4）中诱导阶段溶氧值在15%
±
2%。5.根据权利要求1所述的一种用于提高眼镜王蛇联合肽damp4-oh30高密度表达的方法，所述步骤（5）中最后将离心剩下的菌体进行烘干研磨成粉末，将其添加到家禽饲料中。

技术总结
本发明公开了一种用于提高眼镜王蛇联合肽DAMP4-OH30高密度表达的方法，该发酵方法对溶解氧（DO）、温度及甲醇流加策略上进行优化，上述BMMY培养基配方为按6L的体系培养该培养基，取葡萄糖50g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母提取物11g/L、PH 6.0磷酸钾缓冲液450mL、10xYNB 600mL、0.02%生物素12mL,采用常规方法制备发酵罐培养基，将配置好的培养基加去离子水搅拌均匀；该方法生长阶段各条件为：温度30℃、DO 30%


技术研发人员：吴杭 丁冬 刘杰 章政 钱申根 李瑶瑶
受保护的技术使用者：江苏亢钧生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.25
技术公布日：2023/7/20