基于转录组快速获得荧光原位杂交探针的方法及探针组

1.本发明涉及分子细胞遗传学领域，尤其涉及一种基于转录组快速获得荧光原位杂交探针的方法及探针组。


背景技术：

2.植物基因组中含有大量重复序列，由于其多拷贝性及相对保守性，在荧光原位杂交中常用作探针，主要包括核糖体dna、端粒重复序列、着丝粒重复序列。其中最为常用的是核糖体dna，分为45s rdna和5s rdna两类，可以特异识别染色体，并且常常在检验原位杂交技术的可靠与否上发挥作用。
3.常规的5s rdna和45s rdna探针通常需要通过bac克隆，且获得的探针还需经过的缺刻平移法或随机引物法标记，过程繁琐，成本较高。除此以外，以常用的pta71(45srdna)探针为例，该探针来源于小麦的45s rdna，其中异源的片段可能会对荧光信号产生干扰。其次，小麦作为单子叶植物，与双子叶植物的差异也可能对相应结果产生影响。因此，有必要开发更特异便捷的重复序列寡核苷酸探针。如今，新兴的寡核苷酸荧光原位杂交(oligo-fish)技术被广泛应用，基于重复序列开发的寡核苷酸探针进行fish分析，逐渐成为植物基因组分析的重要方法，并且已经在小麦(triticum aestivum)、玉米(zea may)、草莓(fragaria vesca)、黄瓜(cucumis sativus)、菊花(chrysanthemummorifolium)等植物上成功运用。
4.但是，目前还缺少专门针对蚕豆与燕麦设计的寡核苷酸探针组、寡核苷酸探针杂交液及其在染色体高分辨率荧光原位杂交上的方法。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种基于转录组快速获得荧光原位杂交探针的方法及探针组，方法简单易行，可操作性强，高效性和实用性突出。
6.技术方案：
7.本发明的第一个目的是提供一种荧光原位杂交探针组，其特征在于：该寡核苷酸探针组包括重复序列寡核苷酸探针：
8.[0009][0010]
本发明的第二个目的是提供上述荧光原位杂交探针的基于转录组快速获得方法，其特征在于：包括下述步骤：1)在european nucleotide archive公共数据库(https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/)中下载蚕豆vicia faba与燕麦avena sativa转录组illumina双端测序原始数据文件，原始sra数据文件编号分别为srr1635084与srr8589818；利用misa(microsatellite identification tool)本地分析脚本分析上述转录组中存在ssr基序，脚本运行均使用默认参数；2)通过rstudio统计分析misa统计结果中所有ssr基序数目，分别筛选两个物种分析结果中占比排名前三的ssr在蚕豆与燕麦中分别开发并合成共6条ssr寡核苷酸探针，其中2条为5’端fam修饰，4条为5’端tamra修饰，且探针长度控制在30-40nt。
[0011]
本发明的第三个目的是提供包含上述荧光原位杂交探针的寡核苷酸探针杂交液，其特征在于：该寡核苷酸探针杂交液每个制片使用量成分为2
×
ssc+1
×
te 7.0ul；将探针1.0μl置于0.2ml离心管中混匀，振荡离心后得到寡核苷酸探针杂交液。
[0012]
其中，所述的探针组中，各探针浓度为：cd-1 0.55ng/μl；cd-2 0.55ng/μl；cd-30.55ng/μl；ym-1 0.55ng/μl；ym-2 0.55ng/μl；ym-3 0.55ng/μl；各探针加入量均为1.0μl。
[0013]
本发明的第四个目的是提供一种利用探针组或寡核苷酸探针杂交液进行染色体高分辨率荧光原位杂交的方法，其特征在于：包括下述步骤：
[0014]
1)将有丝分裂间期制片置于44℃水浴的碱变性液中变性4min，依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；配置寡核苷酸探针杂交液，将寡核苷酸探针杂交液以8μl/片的滴加量，滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2
×
ssc润湿的湿盒中杂交培养6h以上；
[0015]
2)揭去盖玻片，用缓水流冲洗制片；44℃水浴条件下，2
×
ssc、2
×
ssc、ddh2o溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8ul dapi封片；镜检。
[0016]
其中，所述的步骤1)中碱变性液是将naoh与体积百分比70％乙醇以6g/l的比例溶解混匀配制而成。
[0017]
其中，所述的步骤2)中镜检具体为将封片后的染色体制片置于olympus bx60型荧光显微镜下镜检，利用spot ccd拍摄有丝分裂中期染色体图像，并通过photoshop(v6.0)对获得的图像进行处理。
[0018]
本发明的第五个目的是提供包含探针组或包含寡核苷酸探针杂交液的试剂盒或检测试剂。如蚕豆重复序列信号快速检测试剂、燕麦重复序列信号快速检测试剂。
[0019]
本发明的第六个目的是提供上述探针组、上述寡核苷酸探针杂交液、上述试剂盒
或检测试剂在植物染色体高分辨率荧光原位杂交中的应用。
[0020]
上述应用为在蚕豆或燕麦高分辨率有丝分裂中期染色体荧光原位杂交中的应用。
[0021]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明基于转录组快速获得荧光原位杂交重复序列寡核苷酸，方法简单可行。针对蚕豆和燕麦，一共开发6条重复序列寡核苷酸探针，探针的荧光信号强，易于检测，且重复性高，能够获得高分辨率的蚕豆和燕麦重复序列染色体核型，实用性和科学性突出。同时，通过简单的变性即可用于fish检测，即可达到传统fish的检测效果，大大提高了实验效率。
[0022]
与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
[0023]
(1)本发明的先进性在于利用转录组数据进行开发重复序列寡核苷酸探针，方法简单易行，可操作性强，高效性和实用性非常突出。基于基因组数据开发重复序列探针需要的前期分析工作较为繁琐，时间成本较高。为快速获得植物荧光原位杂交重复序列寡核苷酸，本发明创新性得绕开基因组测序，挖掘公开的植物转录组中的ssr序列，选取占比较高的ssr序列开发适宜植物使用的高分辨率的寡核苷酸探针以及获得其重复序列的信号位点分布。可有效的用于植物染色体分析核型图谱的构建，利用开发的寡核苷酸探针通过fish分析进行检测，避免克隆重组、标记探针的繁琐程序和异源片段，大大简化了fish分析的程序，提高了实验效率。
[0024]
(2)通过寡核苷酸探针进行荧光原位杂交(fish)检测，仅需要通过简单变性即可用于fish检测，相较于传统的fish程序，大大简化了荧光原位杂交探针的制备和标记、分析方法，提高了实验效率。
[0025]
(3)本发明得到的fish信号位点明亮适中，杂质信号少，且杂质信号易于被上述洗脱条件洗脱，有利于获得更好的fish核型。
[0026]
(4)经典fish分析中常规使用的重复序列探针例如小麦pta71(45s rdna)探针，其中来源于小麦的异源片段的干扰信号也会对实验结果产生影响。本发明中对转录组分析筛选出占比前三的重复序列作为寡核苷酸探针，利用上述设计的探针进行fish分析时，显示出明亮的杂交信号，有助于获得高分辨率的有丝分裂中期染色体核型，有助于分子细胞遗传学研究。而将上述基于蚕豆转录组开发的探针(cd-1)对大蒜(allium sativum)进行fish以及基于燕麦转录组开发的探针(ym-1)对兰州百合(lilium davidii var.unicolor)进行fish时，未见杂交信号，表明基于转录组开发重复序列寡核苷酸探针的方法是特异针对本转录组物种使用的。
附图说明
[0027]
图1为蚕豆转录组ssr序列占比排名前十结果图；
[0028]
图2为蚕豆有丝分裂间期重复序列探针fish结果图；其中标尺大小为10μm；a为(aag)10信号；b为(acc)10信号；c为(ag)20信号；
[0029]
图3为蚕豆有丝分裂中期重复序列探针fish结果图；其中标尺大小为10μm；a为(aag)
10
dapi核型；b为(aag)
10
(3
’‑
fam)信号；c为(aag)
10
fish合成图；d为(acc)
10
dapi核型；e为(acc)
10
(5
’‑
tamra)信号；f为(acc)
10
fish合成图；g为(ag)
20
dapi核型；h为(ag)
20
(5
’‑
tamra)信号；i为(ag)
20
fish合成图；
[0030]
图4为大蒜有丝分裂中期重复序列探针(cd-1)fish结果图；其中标尺大小为10μm；
[0031]
图5为燕麦转录组ssr序列占比排名前十结果图；
[0032]
图6为燕麦有丝分裂间期重复序列探针fish结果图；标尺大小为10μm；a为(ccg)
10
信号；b为(agc)
10
信号；c为(agg)
10
信号；
[0033]
图7为燕麦有丝分裂中期重复序列探针fish结果图；标尺大小为10μm；a为(ccg)
10
dapi核型；b为(ccg)
10
(3
’‑
fam)信号；c为(ccg)
10
fish合成图；d为(agc)
10
dapi核型；e为(agc)
10
(5
’‑
tamra)信号；f为(agc)
10
fish合成图；g为(agg)
10
dapi核型；h为(agg)
10
(5
’‑
tamra)信号；i为(agg)
10
fish合成图；
[0034]
图8为兰州百合有丝分裂中期重复序列探针(ym-1)fish结果图；标尺大小为10μm。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
[0036]
本发明的重复序列寡核苷酸探针开发：
[0037]
以蚕豆为例，在公共数据库中下载蚕豆的转录组原始数据文件；利用软件misa分析转录组中的ssr序列；通过r统计得到的所有ssr序列各自的数目，选取占比排名前三的ssr序列开发为寡核苷酸探针，一条为3’端fam修饰(seq id no.1所示)，两条为5’端tamra修饰(seq id no.2、seq id no.3所示)，且探针长度控制在30-40nt。燕麦寡核苷酸探针开发方法同上。
[0038]
所述寡核苷酸探针包括蚕豆探针(seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3)及燕麦探针(seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6)序列特征如下：
[0039][0040]
本发明的制备重复序列寡核苷酸探针杂交液：
[0041]
寡核苷酸探针杂交液配置体系如下：
[0042]2×
ssc+1
×
te
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
7.0μl
[0043]
探针
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.0μl
[0044]
进一步的，所述寡核苷酸探针中，各探针浓度分别为cd-1(0.55ng/μl)；cd-2(0.55ng/μl)；cd-3(0.55ng/μl)；ym-1(0.55ng/μl)；ym-2(0.55ng/μl)；ym-3(0.55ng/μl)。各探针加入量均为1.0μl。
[0045]
将上述成分于0.2ml离心管中混匀，振荡离心后备用。
[0046]
本发明的重复序列寡核苷酸探针信号检测及高分辨率染色体荧光原位杂交：
[0047]
实验材料：蚕豆和燕麦染色体。
[0048]
试验方法：
[0049]
1)根尖处理：将种子置于2层滤纸的培养皿中，加水直至没过种子，放在28℃培养箱中发根。24h后，将多余的水倒掉(仅保持滤纸湿润)，继续放在28℃培养箱中培养48h。待胚根根长约2cm时，剪取根系，将其浸入装有0.2μmol/l甲基氨草磷溶液的培养皿中处理3h后用清水冲净，将根系置于1.5ml打有小孔离心管中，1.1mpa下n2o处理40min；加入体积百分比90％冰醋酸冰上处理10min，再换至装有70％乙醇的1.5ml离心管中-20℃下保存；
[0050]
2)有丝分裂中期染色体制片：取步骤(1)处理得到的根尖进行染色体制片，利用相差显微镜观察，挑选染色体分散良好、形态结构清晰且重叠较少，可用于荧光原位杂交的有丝分裂中期染色体制片放在-80℃冰箱保存，过夜揭片，置于100％乙醇溶液中脱水10min，晾干备用；
[0051]
3)荧光原位杂交：取步骤(2)挑选的染色体制片，置于44℃水浴的碱变性液(将naoh与体积百分比70％乙醇以6g/l的比例溶解混匀配制而成)中变性4min，接着依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；取实施例2制备的寡核苷酸混合探针杂交液，以8μl/片的滴加量，缓慢滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2
×
ssc润湿的湿盒(置于37℃恒温箱)中杂交培养10h以上；
[0052]
4)洗片及镜检：揭去盖玻片，先用缓水流冲洗制片10s左右；44℃水浴条件下，2
×
ssc、2
×
ssc、ddh2o溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8ul dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)封片；将封片后的染色体制片置于olympus bx60型荧光显微镜下镜检，利用spot ccd(spot cooled color digital camera)拍摄有丝分裂中期染色体图像，并通过photoshop(v6.0)对获得的图像进行处理。
[0053]
核型分析时，每个材料观察3-12个细胞，从中选取染色体数完整且分散良好的1个细胞利用photoshop(v6.0)进行核型分析，少数材料由于染色体重叠或不完整等原因需选用2个细胞进行核型分析。
[0054]
运用本方法对蚕豆有丝分裂间期染色体制片进行寡核苷酸探针信号检测，其结果如图2(a-c)所示，燕麦结果如图6(a-c)所示，由图中可以看出：采用重复序列寡核苷酸探针进行fish分析，通过杂交信号及其强度可看出信号清晰且无信号重叠现象，从而可用于重复序列fish核型分析。
[0055]
对蚕豆有丝分裂中期染色体制片进行fish分析，其结果如图3(a-i)所示，图3a/d/g分别为dapi染色(蓝色)的蚕豆染色体；图3b/e/h分别为蚕豆染色体的(aag)
10
(fam绿色)/(acc)
10
(tamra红色)/(ag)
20
(tamra红色)信号；图3c/f/i分别为蚕豆染色体的fish合成图像。
[0056]
对燕麦有丝分裂中期染色体制片进行fish分析，其结果如图7(a-i)所示，图7a/d/g分别为dapi染色(蓝色)的燕麦染色体；图7b/e/h分别为燕麦染色体的(ccg)
10
(fam绿色)/(agc)
10
(tamra红色)/(agg)
10
(tamra红色)信号；图7c/f/i分别为燕麦染色体的fish合成图像。
[0057]
对比例1利用探针cd-1对大蒜进行染色体荧光原位杂交：
[0058]
根尖处理、染色体制片、荧光原位杂交、洗片及镜检方法同上。结果显示：应用本方法开发的蚕豆重复序列寡核苷酸探针套进行fish检测，未发现荧光信号，说明本发明基于转录组开发的蚕豆寡核苷酸探针具有特异性(图4)。
[0059]
对比例2利用探针ym-1对兰州百合进行染色体荧光原位杂交：
[0060]
根尖处理、染色体制片、荧光原位杂交、洗片及镜检方法同上。结果显示：应用本方法开发的燕麦重复序列寡核苷酸探针套进行fish检测，未发现荧光信号，说明本发明基于转录组开发的燕麦寡核苷酸探针具有特异性(图8)。

技术特征：
1.一种荧光原位杂交探针组，其特征在于：该寡核苷酸探针组包括重复序列寡核苷酸探针：2.根据权利要求1所述荧光原位杂交探针的基于转录组快速获得方法，其特征在于：包括下述步骤：1)在european nucleotide archive公共数据库中下载蚕豆vicia faba与燕麦avena sativa转录组illumina双端测序原始数据文件；利用microsatellite identification tool本地分析脚本分析上述转录组中存在ssr基序；2)通过rstudio统计分析misa统计结果中所有ssr基序数目，分别筛选两个物种分析结果中占比排名前三的ssr在蚕豆与燕麦中分别开发并合成共6条ssr寡核苷酸探针，其中2条为5’端fam修饰，4条为5’端tamra修饰，且探针长度控制在30-40nt。3.包含权利要求1所述荧光原位杂交探针的寡核苷酸探针杂交液，其特征在于：该寡核苷酸探针杂交液每个制片使用量成分为2
×
ssc+1
×
te 7.0ul；将探针1.0μl置于0.2ml离心管中混匀，振荡离心后得到寡核苷酸探针杂交液。4.根据权利要求3所述的寡核苷酸探针杂交液，其特征在于：所述的探针组中，各探针浓度为：cd-1 0.55ng/μl；cd-2 0.55ng/μl；cd-3 0.55ng/μl；ym-1 0.55ng/μl；ym-2 0.55ng/μl；ym-3 0.55ng/μl；各探针加入量均为1.0μl。5.一种利用权利要求1所述探针组或权利要求3所述的寡核苷酸探针杂交液进行染色体高分辨率荧光原位杂交的方法，其特征在于：包括下述步骤：1)将有丝分裂间期制片置于44℃水浴的碱变性液中变性4min，依次置于体积百分比70％乙醇、70％乙醇、100％乙醇溶液中，室温下依次梯度脱水各5min，晾干备用；配置寡核苷酸探针杂交液，将寡核苷酸探针杂交液以8μl/片的滴加量，滴加在制片上，盖上盖玻片，置于37℃2
×
ssc润湿的湿盒中杂交培养6h以上；2)揭去盖玻片，用缓水流冲洗制片；44℃水浴条件下，2
×
ssc、2
×
ssc、ddh2o溶液中各浸洗5min，晾干后在制片上滴加8ul dapi封片；镜检。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)中碱变性液是将naoh与体积百分比70％乙醇以6g/l的比例溶解混匀配制而成。7.包含权利要求1所述探针组或包含权利要求3所述寡核苷酸探针杂交液的试剂盒或检测试剂。8.权利要求1所述探针组、权利要求3所述寡核苷酸探针杂交液、权利要求7所述试剂盒或检测试剂在植物染色体高分辨率荧光原位杂交中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，为在蚕豆或燕麦高分辨率有丝分裂中期染色体荧光原
位杂交中的应用。

技术总结
本发明公开了一种荧光原位杂交探针组，该寡核苷酸探针组包括重复序列寡核苷酸探针SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6。同时，公开了该荧光原位杂交探针的基于转录组快速获得方法，包含该荧光原位杂交探针的寡核苷酸探针杂交液，进行染色体高分辨率荧光原位杂交的方法。本发明方法简单易行，可操作性强，高效性和实用性突出。用性突出。用性突出。


技术研发人员：王海滨 张爽爽 何俊 饶欣雨 赵勇 陈发棣 房伟民
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.03.16
技术公布日：2023/7/20