辛弗林或者橙皮苷和辛弗林二元联用作为丙烯醛抑制剂的应用的制作方法

1.本发明属于黄酮和生物碱的应用领域，辛弗林或者橙皮苷和辛弗林二元联用作为丙烯醛抑制剂的应用。


背景技术：

2.丙烯醛(acrolein,acr)是一种高毒性的不饱和活性羰基化合物，于1995年被国际癌症研究机构(iarc)列为3类致癌物，是2a类致癌物丙烯酰胺的前体。由于其结构中含有羰基和乙烯基，acr具有较高的反应活性，可以与dna、蛋白质、核苷酸和磷脂的亲核位点共价结合，从而引起一系列病理反应。此外，acr还可以通过诱导氧化应激、破坏细胞器和改变细胞信号转导等间接机制发挥毒性作用。目前研究表明，acr可引起心血管疾病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、肿瘤等一系列慢性疾病。除了污染的空气、水源、香烟烟雾等，外源性acr最重要的来源之一是饮食摄入。值得注意的是，acr广泛存在于环境如水体溶液以及各种加工食品中，包括油炸食品，烧烤食品、烘焙食品，发酵食品、腌制食品、酒精饮料等。acr主要来源于食品加工过程中的美拉德反应、脂质过氧化、氨基酸降解、碳水化合物热解和微生物代谢。已有研究表明富含油脂、蛋白质和碳水的加工食品acr含量更高，如烤牛排和烤香肠中的acr含量分别为51
±
3μg/kg和93
±
5μg/kg，同时面包和奶酪中的acr含量分别高达161
±
21μg/kg和1000μg/kg。据统计，成人日常生活中acr的每日最大摄入量约为0.1mg/kg体重/天，然而世界卫生组织(who)规定acr的每日耐受摄入量(tdi)为7.5μg/kg体重/天，日常生活中的acr每日摄入量远远超过tdi。因此，降低环境或者食品中的acr含量具有重要意义。
3.虽然已有多种策略用于解决这一安全问题，但天然化合物作为抑制剂的应用仍然被认为是最适用的。某些酚类化合物，氨基酸和含硫化合物均被证明在体外和体内都是有效的acr清除剂。然而，现有的一些抑制剂溶解度差，遇热不稳定，抑制效果不佳，这大大限制了它们在食品领域的应用。因此，开发热稳定和高性能的acr抑制剂以广泛应用于食品加工领域是十分必要的。
4.橙皮苷(hesperidin,hes)，是一种类黄酮苷，广泛分布于水果和植物中，如柠檬、橘子、陈皮、代代花、枳壳等。它是芸香科柑橘属植物中非常重要的生物活性成分，被认为是维生素p，也是陈皮的生物标志物。《中国药典》2020版第一部中规定，陈皮中的橙皮苷含量不得低于3.5％。大量研究表明，橙皮苷不仅具有抗炎、抗癌、抗氧化和降血脂作用，并对心脑血管疾病、神经系统疾病、精神疾病和癌症等一系列疾病具有潜在的治疗作用。此外，橙皮苷还广泛应用于制药、化妆品、食品等行业。辛弗林在芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的皮、肉、汁、籽中均有分布，被认为是柑橘类水果的生物标志物，同时辛弗林含量也是评价商业减肥产品的质量指标。作为21世纪天然的兴奋剂，辛弗林通常被添加到用于运动或健身的膳食补充剂中。越来越多的研究揭示了它的生物活性，如提高血压，抗休克，促进新陈代谢，增加热量消耗，提高能量水平，氧化脂肪，减肥等。到目前为止，尚无橙皮苷和辛弗
林抑制acr的相关研究。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了辛弗林(syn)或者橙皮苷(hes)和辛弗林(syn)二元联用作为丙烯醛抑制剂的应用，本发明中辛弗林具有很好的抑制丙烯醛的作用，更为重要的是还可以以橙皮苷和辛弗林二元联用的形式发挥作用，当二元联用时微量的辛弗林作为促进剂或者催化剂可以极大地提高橙皮苷的捕获活性，进而协同抑制丙烯醛。本发明公开的辛弗林单用或辛弗林和橙皮苷二元联用可以抑制环境、食品加工以及生物体内存在的丙烯醛，解决了现有丙烯醛抑制剂热稳定性差、低效、合成抑制剂存在副作用和安全隐患等问题。
6.本发明还提出了一种环境、食品加工和生物体内丙烯醛抑制剂。
7.技术方案：为了实现上述目的，本发明所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制丙烯醛中的应用。
8.本发明所述的辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在制备丙烯醛抑制剂中的应用。
9.其中，所述橙皮苷或辛弗林的结构如下所示：
[0010][0011]
其中，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制环境中丙烯醛的应用。
[0012]
其中，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制食品或者食品加工中产生的丙烯醛的应用。
[0013]
其中，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制生物体内丙烯醛的应用。
[0014]
其中，所述辛弗林与橙皮苷联用，二者使用量为0.25*ic
50-2*ic
50
，即各自针对丙烯醛的ic
50
浓度的0.25倍-2倍。
[0015]
作为优选，所述辛弗林与橙皮苷联用，二者使用量为2*ic
50
。
[0016]
其中，所述橙皮苷或辛弗林通过捕获丙烯醛形成加合产物，从而降低丙烯醛含量。
[0017]
其中，所述加合产物包括橙皮苷与丙烯醛的一加合产物hes-acr，辛弗林与丙烯醛的二加合产物syn-2acr，其结构分别如下所示：
[0018][0019]
其中，所述辛弗林和橙皮苷二元联用时，辛弗林作为促进剂或者催化剂极大提高橙皮苷的捕获活性，从而达到协同抑制丙烯醛的作用。
[0020]
本发明所述的环境、食品加工和生物体内丙烯醛抑制剂，所述抑制剂以辛弗林为唯一的成分或者二元联用，或者作为主要成分与其他物质复配共同使用，所形成的制剂。
[0021]
本发明首次发现橙皮苷或辛弗林可以作为丙烯醛抑制剂，特别是橙皮苷和辛弗林二元联用时，微量辛弗林作为促进剂或者催化会大大提高橙皮苷的抑制活性以及反应速率，并且反应十分迅速，从而显著协同抑制食品中的丙烯醛。除此以外，橙皮苷和辛弗林均为常用的膳食补充剂，作为丙烯醛抑制剂具有较高的安全性。另外，橙皮苷和辛弗林作为柠檬、橘子、陈皮、玳玳花等柑橘属水果和植物中含量最为丰富的黄酮和生物碱，直接以食品的形式添加或食用，可避免外源添加的限制，从而能在食品加工或生物体内更好地发挥协同抑制丙烯醛的作用。
[0022]
本发明发现辛弗林不仅可以作为丙烯醛抑制剂，同时将低剂量的辛弗林和橙皮苷联用，可以显著提高橙皮苷对于丙烯醛的捕获活性，促进橙皮苷捕获更多的丙烯醛，从而达到协同抑制丙烯醛的作用。橙皮苷是柑橘属中含量最为丰富的黄酮，但它对橙皮苷的捕获活性并不高，但是本发明的研究表明添加少许辛弗林就可以极大地提高其捕获性能。与单用橙皮苷相比，微量添加辛弗林后橙皮苷对acr的抑制作用显著提高，橙皮苷与丙烯醛的一加合产物hes-acr的生成量约为橙皮苷单用时的3倍，辛弗林与丙烯醛的二加合产物syn-2acr含量与单用辛弗林相比基本不变，这充分表明了辛弗林在二元联用中起到了促进剂或者催化剂的作用。同时二者在低温和高温的情况下，均有很好的抑制效果。
[0023]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0024]
本发明首次提出了橙皮苷或辛弗林对丙烯醛的抑制作用，特别是当橙皮苷和辛弗林二元联用时，辛弗林作为促进剂或者催化剂从而与橙皮苷协同抑制丙烯醛，能够高效降低丙烯醛的含量。橙皮苷和辛弗林作为丙烯醛抑制剂，还可以以陈皮、橘子等天然食品的形式直接发挥作用，清除环境、食品加工和生物体内的丙烯醛，避免其与dna、蛋白质、核苷酸等生物大分子的亲核位点发生共价结合，进而避免形成各种不可逆的有害加合或交联产物，预防其对人体造成的危害。利用橙皮苷及辛弗林二元联用作为丙烯醛抑制剂，可以显著提高橙皮苷与丙烯醛的一加合产物hes-acr的生成量和生成速度，从而显著提高丙烯醛的抑制活性和效果；避免了部分抑制剂热稳定性差、低效、合成抑制剂存在副作用和安全隐患等问题。
附图说明
[0025]
图1为橙皮苷及其与acr加合产物的质谱结果；
[0026]
图2为辛弗林及其与acr加合产物的质谱结果；
[0027]
图3为模拟加工条件下橙皮苷或辛弗林对acr的抑制率；
[0028]
图4为模拟体内条件下橙皮苷或辛弗林对acr的抑制率；
[0029]
图5为模拟加工条件下橙皮苷和辛弗林的ic
50
值；
[0030]
图6为模拟加工条件下橙皮苷和辛弗林二元联用对acr的抑制率和fa-ci曲线图；
[0031]
图7为橙皮苷和辛弗林二元联用时孵育不同时间对acr的协同抑制机制；
[0032]
图8为橙皮苷及辛弗林单用或二元联用对烤鸭翅和曲奇中acr的抑制效果。
具体实施方式
[0033]
以下结合实施例对本发明做一步说明。
[0034]
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0035]
实施例1
[0036]
橙皮苷或辛弗林与acr加合产物的纯化和结构研究
[0037]
(1)实验材料与仪器
[0038]
橙皮苷(97％，hplc)和辛弗林(98％，hplc)(上海源叶生物科技有限公司)；丙烯醛(acr，98％水溶液，分析纯，山东西亚化学工业有限公司)；甲醇(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)。
[0039]
avance 400mhz核磁共振仪器(布鲁克公司)；waters xevo tq-xs液质联用质谱仪(沃特世科技(美国)有限公司)。
[0040]
(2)实验步骤
[0041]
①
橙皮苷与acr加合产物的制备
[0042]
称取0.61g橙皮苷溶解于2.5ml dmso中，加入用pbs(ph 7.0,0.1mol/l)稀释的acr溶液，使橙皮苷与acr按照1:5的摩尔比在100℃下反应0.5h。然后用反相ods柱(2.6cm
×
30.0cm)纯化产物，10％～30％甲醇梯度洗脱，收集30％甲醇洗脱液，浓缩后用硅胶柱(3.0cm
×
30.0cm)分离，收集洗脱液(乙酸乙酯:甲醇＝14:1,v/v)，冻干后得到橙皮苷与acr的一加合产物hes-acr(158mg)。
[0043]
②
辛弗林与acr加合产物的制备
[0044]
称取0.367g辛弗林溶解于4ml热甲醇中，加入用pbs(ph 7.0,0.1mol/l)稀释的acr溶液，使辛弗林与acr按照1:10的摩尔比在室温下反应0.5h。然后将反应液浓缩后用反相ods柱(2.6cm
×
30.0cm)分离，使用2％～5％甲醇梯度洗脱，收集5％甲醇洗脱液，经冻干后得到辛弗林与acr的二加合产物syn-2acr(46mg)。
[0045]
③
hes-acr和syn-2acr的结构鉴定
[0046]
将hes-acr溶解在dmso中，syn-2acr溶解在甲醇中，得到1mg/ml的原液，然后用dmso或甲醇分别稀释为200ng/ml的标准溶液，通过uplc-ms/ms分析分子量，具体条件如下；使用1d-nmr(1h，
13
c)，2d-nmr(hmqc，hmbc)进行结构分析。
[0047]
a)色谱条件
[0048]
仪器：waters xevo tq-xs
[0049]
色谱柱：acquity uplc beh c18(2.1
×
50mm,i.d.,1.7μm)
[0050]
柱温：40℃；流速：0.3ml/min；进样量：2μl
[0051]
流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：甲醇
[0052]
洗脱梯度：0-2min 5％b；2-3min 5-60％ b；3-3.1min 60-95％ b；3.1-4min 95％b；4-5min,95-5％ b；5-6min,5％ b。
[0053]
b)质谱条件
[0054]
离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描方式：正离子扫描；检测模式：多反应监测扫描(mrm)；毛细管电压：1.5kv；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000l/hr；锥孔气流量：150l/hr；数据采集分析软件：masslynx 4.2。主要质谱参数见表1。
[0055]
表1主要质谱参数
[0056][0057]
(3)实验结果
[0058]
①
hes-acr结构鉴定
[0059]
制备的hes-acr经lc-ms/ms测定，如图1所示,正离子模式下，其母离子质量为m/z 667[m+h]
+
，比hes的母离子质量m/z 611[m+h]
+
多56(mw
acr
＝56)，并且ms/ms中其主要碎片离子峰为m/z 359[m+h]
+
，是由hes-acr丢失了一分子葡萄糖和鼠李糖基团(m/z 308)形成的，这可初步表明hes-acr为一分子hes与acr的加合产物，hes-acr的1h nmr(400hz)和
13
c nmr(100mhz)数据详见表2。由表2可知，hes-acr从c-1到c-10与hes具有相似的碳骨架。首先，hes-acr中h-6上的氢信号消失，同时出现了3个新的氢信号δ
h 1.92、2.00(2h,m),δ
h 2.69、2.76(2h,m)和δ
h 4.75(1h,m)，以及出现了3个新的碳信号δ
c 29.49、δ
c 15.80和δ
c 97.02。此外，hmbc图谱结果显示δ
h 1.92、2.00(h-11)、δ
h 4.75(h-13)分别与δ
c 169.01(c-7)、δ
c 101.13(c-5)相关联。由于hes-acr的
13
c nmr谱中未发现羰基信号，判断为acr的羰基与hes的c-6位点结合，与c-5位的羟基形成环状半缩醛结构。因此，综合核磁谱图特征，最终确定hes-acr的结构，为一种新化合物，其结构为：
[0060][0061]
表2hes与hes-acr加合产物的1h nmr(400hz)和
13
c nmr(100mhz)
[0062]
[0063][0064]
②
syn-2acr鉴定
[0065]
制备的syn-2acr经lc-ms/ms测定，如图2所示，在正离子模式下其母离子质量为m/z 262[m+h]
+
，与syn的母离子质量m/z 168[m+h]
+
相比，增加了2个acr分子(m/z 56))和损失了1个h2o分子(m/z 18)。二级质谱图中有碎片离子峰m/z 150[m-112+h]
+
，m/z 119[m-143+h]
+
，m/z 91[m-171+h]
+
,均与syn的特征碎片相同。由此推测syn-2acr为syn与acr反应的二加合产物。syn-2acr的1h nmr(400hz)和
13
c nmr(100mhz)数据详见表3。
[0066]
由表3可知，对比syn和syn-2acr从c-1到c-6的nmr数据，syn-2acr具有与syn相似的苯环结构。syn-2acr出现了5个新的氢信号(δ
h 3.38s,2h；δ
h 9.58s,1h；δ
h 6.17d,1h；δ
h 6.54m,1h；δ
h 5.19dd,2h)和6个新的碳信号(δc48.28,δ
c 142.92,δ
c 194.00,δ
c 134.01,δ
c 131.58andδ
c 94.15)，推测为两个acr分子与syn加合。hmbc图谱结果显示h-7(δ
h 3.38)与c-2
′
(δ
c 57.93)、c-3
′
(δ
c 39.25)相关联，证实了acr加合在syn的仲胺基上。此外，h-10(δ
h 6.17)的氢信号与c-8(δ
c 142.92),c-9(δ
c 194.00)和c-11(δ
c 131.58)均相关，表明第二个acr基团共轭在c-8的位置上。因此，综合核磁谱图特征，最终确定syn-2acr的结构，为一种新化合物，其结构为：
[0067][0068]
表3syn与syn-2acr加合产物的1h nmr(400hz)和
13
c nmr(100mhz)
[0069][0070]
实施例2
[0071]
橙皮苷或辛弗林对acr的抑制活性
[0072]
(1)实验材料与仪器
[0073]
橙皮苷(97％，hplc)和辛弗林(98％，hplc)(上海源叶生物科技有限公司)；2,4-二硝基苯肼(dnph
·
hcl，纯度》98％，tokyo chemical industry)；丙烯醛(acr，98％水溶液，分析纯，山东西亚化学工业有限公司)；乙腈(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯试剂(上海国药集团化学试剂有限公司)。
[0074]
agilent technologies 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；zqty-70台式振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)；ql-861涡旋混合仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
[0075]
(2)实验步骤
[0076]
①
模拟加工条件下进行水体溶液中橙皮苷或辛弗林对丙烯醛的抑制活性
[0077]
用0.1mol/l，ph 7.0的pbs配制acr溶液，用dmso配制hes溶液，用甲醇配制syn溶液。在2ml离心管中，分别加入0.8ml acr溶液(终浓度0.5mmol/l)和0.8ml hes溶液(终浓度0.5-2.5mmol/l)或者syn溶液(终浓度0.25-2mmol/l)，用等体积的dmso或甲醇溶液分别代替hes或syn溶液作为空白对照，涡旋混匀后，橙皮苷组和辛弗林组分别置于100℃水浴锅中避光反应5、15、30、60min和1、5、15、30min。反应结束后取500μl反应液，加入300μl dnph溶液，置于37℃台式振荡培养箱中，220rpm避光衍生化2h，结束后立即冰浴，用高效液相色谱检测acr-dnph衍生物的含量，计算hes或syn溶液在模拟加工条件下对acr的抑制率。每个样品均做三组平行。
[0078]
②
模拟体内条件下进行水体溶液中橙皮苷或辛弗林对丙烯醛的抑制活性
[0079]
用0.1mol/l，ph 7.4的pbs配制acr溶液，用dmso配制hes溶液，用甲醇配制syn溶液。在2ml离心管中，分别加入0.8ml acr溶液(终浓度0.5mmol/l)和0.8ml hes溶液(终浓度1-16mmol/l)或者syn溶液(终浓度0.5-2.5mmol/l)，用等体积的dmso或甲醇溶液分别代替hes或syn溶液作为空白对照，涡旋混匀后，橙皮苷组和辛弗林组分别置于37℃台式振荡培养箱中避光反应1、2、4、8、16h和1、5、15、30、60min。衍生化及测定方法同
①
。每个样品均做三组平行。
[0080]
③
hplc条件
[0081]
色谱柱：kromasil 100-5c18色谱柱(250
×
4.6mm i.d.,5μm)；
[0082]
检测器：dad检测器；柱温：30℃；检测波长：372nm；进样量：20μl。
[0083]
洗脱条件：流动相a：水(含0.1％甲酸)；流动相b：乙腈；
[0084]
以1.0ml/min的流速用70％流动相b等度洗脱8min。
[0085]
④
acr清除率的计算公式
[0086][0087]
(3)数据分析
[0088]
实验数据采用采用spss 13.0软件进行单因素方差分析(one-way analysis of variance，anova)，采用tukey’s法进行统计分析，p《0.05表示具有显著性差异。其中，不同大写字母表示同一浓度下不同反应时间下的显著性差异(p《0.05)；不同小写字母表示相同反应时间时不同浓度下的显著差异(p《0.05)。
[0089]
(4)实验结果
[0090]
由图3和图4可以看出，无论是在模拟食品加工还是模拟体内的条件下进行水体溶液中，hes和syn都能以时间和剂量依赖的方式有效地捕获acr。在100℃孵育15min后，加入2.0mmol/l hes可清除50％左右的acr，而syn可清除80％以上的acr。在37℃时，橙皮苷和辛弗林都表现出了对acr的抑制活性，为橙皮苷和辛弗林清除人体内的acr提供依据。此外，在相同浓度和孵育时间下，syn都表现出比hes更好的acr捕获能力。已有大量研究证明黄酮类化合物通常具有一定的acr捕获能力，如杨梅素、根皮素、egcg等。而syn作为一种生物碱，在这里它表现出比hes(一种类黄酮)更好的反应活性，对丙烯醛的抑制反应迅速且高效。
[0091]
实施例3
[0092]
橙皮苷和辛弗林二元联用对acr的抑制活性
[0093]
(1)实验材料与仪器
[0094]
橙皮苷(97％，hplc)和辛弗林(98％，hplc)(上海源叶生物科技有限公司)；2,4-二硝基苯肼(dnph
·
hcl，纯度》98％，tokyo chemical industry)；丙烯醛(acr，98％水溶液，分析纯，山东西亚化学工业有限公司)；乙腈(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯试剂(上海国药集团化学试剂有限公司)。
[0095]
agilent technologies 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；zqty-70台式振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)；ql-861涡旋混合仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
[0096]
(2)实验步骤
[0097]
①
chou-talalay联合方法原理
[0098]
两物质或多物质联合采用恒定比率添加剂量，以近似两物质或多物质的ic
50
(半数抑制浓度)比值为比率，以接近ic
50
值为中点，0.125、0.25、0.5、1、2倍的中点剂量联合。两物质或多物质联合抑制作用可通过fa-ci(组合指数)曲线进行评估。ci《1，ci＝1，ci》1分别表示协同，叠加和拮抗作用。其中协同作用中，0.1《ci《0.3表示强协同,0.3《ci《0.7表示协同,0.7《ci《0.85表示中等协同。
[0099]
②
样品的制备
[0100]
分别取等体积的acr(终浓度0.5mmol/l)与hes(终浓度0.5、1、2、4、8mmol/l)或syn(终浓度0.125、0.25、0.5、1、2mmol/l)在100℃下孵育30min，用等量的dmso或甲醇代替抑制剂作为对照样品孵育30min。反应结束后，每个样品取0.5ml进行上述衍生化。衍生化结束后，检测acr-dnph衍生物的含量，所有分析均重复三次。根据chou-talalay法则，采用compusyn软件计算hes和syn的ic
50
值。然后，按终浓度0.125*ic
50-2*ic
50
的hes溶液和syn溶液单用或者二元联用与acr(终浓度0.5mmol/l)在100℃孵育30min。反应结束后，每个样品取0.5ml进行上述衍生化。用高效液相色谱检测acr-dnph衍生物的含量，检测方法同实施例2，所有分析均重复三次。
[0101]
(3)实验结果
[0102]
由图5可以得到，hes和syn的ic
50
值分别为2.144和0.240mmol/l，进一步证明syn表现出比hes更好的反应活性，与模拟加工条件下两者对acr的抑制率结果一致。根据图6，无论单用还是二元联用，hes和syn对acr的抑制均具有剂量依赖性，且二元联用比单用时明显消除了更多的acr。根据fa-ci(组合指数)曲线可以评估两物质或多物质联合抑制的作用，从图6的fa-ci曲线可以看出，当fa》0.35(抑制率》35％)时，ci《1，说明hes与syn在0.25*ic
50-2*ic
50
范围内二元联用时对抑制acr均有协同作用。当syn和hes以2*ic
50
的浓度二元联用时，ci＝0.30，表现为强协同，此时acr的清除率或抑制率可达96％。
[0103]
实施例4
[0104]
橙皮苷和辛弗林二元联用协同抑制acr的机制研究
[0105]
(1)实验材料与仪器
[0106]
橙皮苷(97％，hplc)和辛弗林(98％，hplc)(上海源叶生物科技有限公司)；hes-acr(实施例1制备)；syn-2acr(实施例1制备)；丙烯醛(acr，98％水溶液，分析纯，山东西亚化学工业有限公司)；2,4-二硝基苯肼(dnph
·
hcl，纯度》98％，tokyo chemical industry)；甲醇(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；纯净水(杭州哇哈哈集团有限公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯试剂(上海国药集团化学试剂有限公司)。
[0107]
xevo
tm tq-xs超高效液相色谱-质谱联用仪(沃特世科技(上海)有限公司)；zqty-70台式振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)；ql-861涡旋混合仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
[0108]
(2)实验步骤
[0109]
①
标准曲线的建立
[0110]
将hes-acr和syn-2acr分别溶解在dmso和甲醇中制备成1mg/ml的原液，然后用dmso或甲醇稀释成一系列浓度梯度为0.010～0.750μg/ml的标准溶液，用0.22μm有机膜过滤。每个样品取2μl进行uplc-ms/ms检测，检测方法同实施例1。
[0111]
②
不同添加剂量对acr的协同抑制
[0112]
根据chou-talalay法则结果，将0.5mlhes溶液(终浓度150、230、330、560、1200mg/l)和0.5ml syn溶液(终浓度19、29、41、70、150mg/l)单用或二元联用分别与acr(终浓度0.5mmol/l)等体积在100℃孵育30min，以相同体积的dmso或甲醇代替抑制剂作为空白。反应结束后加入20μl乙酸，然后立即冰浴，以终止反应。每个样品取0.5ml进行上述衍生化。用甲醇稀释后，用0.22μm有机膜过滤。各取2μl进行lc-ms/ms分析，检测hes和syn与acr加合物的含量。检测方法同实施例1，所有分析均重复三次。
[0113]
③
不同孵育时间对acr的协同抑制
[0114]
将0.5ml hes溶液(终浓度330mg/l)和0.5ml syn溶液(终浓度41mg/l)单用或二元联用分别与acr(终浓度0.5mmol/l)等体积在100℃孵育30min，以相同体积的dmso或甲醇代替抑制剂作为空白。反应结束后加入20μl乙酸，然后立即冰浴，以终止反应。用甲醇稀释后，用0.22μm有机膜过滤。每个样品取2μl进行lc-ms/ms检测。检测方法同实施例1，所有分析均重复三次。
[0115]
(3)实验结果
[0116]
hes-acr的标准曲线为y＝685.956x+5455.4,r2＝0.998,syn-2acr的标准曲线为y＝42357.1x+916394,r2＝0.993。hes-acr和syn-2acr的检出限(lods,s/n＝3)分别为0.4和0.6ng/ml，定量限(loqs,s/n＝10)分别为1.2和1.8ng/ml。
[0117]
从表4可以看出，无论hes和syn是单用还是二元联用，对acr的抑制作用和加合物含量都随着添加剂量的增加而显著增加，再次证明了acr抑制率与加合物的形成呈正相关。此外，与单用hes相比，添加syn后hes对acr的抑制作用显著提高，hes-acr的生成量约为hes单用时的3倍，syn-2acr含量与单用sny相比基本不变，这充分表明了微量的syn在二元联用中起到了促进剂或者催化剂的作用。
[0118]
表4不同浓度的hes和syn二元联用对acr的协同抑制机制
[0119][0120]
另一方面，研究了在hes和syn在固定剂量下二元联用时加合产物含量随时间的变化。如图7所示，在孵育1min的时候syn就发挥了捕获acr的最大能力，此时syn-2acr的含量与syn单用30min时的加合物含量相当。随着孵育时间的延长，syn-2acr的含量基本不变，而hes-acr的含量却急剧上升，远远高于hes单用时的加合物含量。这从另一个角度证明了syn是hes促进剂或者催化剂。上述有效分析了syn作为hes促进剂或者催化剂的作用机制，即显著提高hes的捕获丙烯醛活性以及捕获速度，促进hes捕获更多的acr形成更多的加和产物，从而达到协同抑制acr的作用。hes是柑橘属中含量最为丰富的黄酮，但它对acr的捕获活性并不高，但是本发明中通过添加少许syn就可以极大地提高其捕获性能。
[0121]
实施例5
[0122]
橙皮苷及辛弗林对烤鸭翅和曲奇中丙烯醛含量的影响
[0123]
(1)实验材料与仪器
[0124]
橙皮苷(97％，hplc)和辛弗林(98％，hplc)(上海源叶生物科技有限公司)；2,4-二硝基苯肼(dnph
·
hcl，纯度》98％，tokyo chemical industry)；甲醇(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)，二氯甲烷(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；中鸭翅(中国江苏千惠旗舰店)；低筋面粉(上海怡海嘉里国际贸易有限公司)；盐、糖、酱油、料酒、蜂蜜、油、黄油、泡打粉和鸡蛋(江苏省宿迁市红利a佳超市)。
[0125]
agilent technologies 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；zqty-70台式振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)；ql-861涡旋混合仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；kq-300b超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；水浴锅(金坛市数显恒温水浴锅)；crtf32k烤箱(长帝电器有限公司)。
[0126]
(2)实验步骤
[0127]
①
烤鸭翅的制备
[0128]
将鸭翅洗净，并沥干水分，在鸭翅表面均匀划口。分别称取300g鸭翅置于密闭容器中，然后在由3g盐、3g糖、3g鲜抽、5g料酒、5g蜂蜜、5g食用油组成的调料中腌制40min。将腌制好的鸭翅平放于烤盘，放入已预热的烤箱，在200℃的温度条件下烤制30min，每15min翻一次面。烤制结束将样品晾凉后分组储存在-20℃下待测，所有样品做三组平行。此为空白组配方，实验组分别在腌制调料中加入hes和syn，分组如下：
[0129]
a组：330mg/kg hes(以鸭翅的重量计)
[0130]
b组：41mg/kg syn(以鸭翅的重量计)
[0131]
c组：330mg/kg hes+41mg/kg syn(以鸭翅的重量计)
[0132]
②
曲奇的制备
[0133]
将32.0g黄油加热融化后，加入25g白砂糖和12.5g新鲜全蛋液，手持电动搅拌机中速搅拌5min，使蛋液呈微黄色蓬松泡沫状，混匀后加入50.0g低筋面粉和0.75g泡打粉，之后采用手持电动搅拌器搅拌5min即为制作曲奇的面团。用模具将面团切成边长为5厘米、厚度为2毫米的薄片，放入已预热的烤箱，采用上火180℃，下火175℃烘烤15min，冷却后，将曲奇粉碎备用。所有样品做三组平行。此为空白组配方，实验组分别在面团中加入hes和syn，分组如下：
[0134]
a组：330mg/kg hes(以整个面团的重量计)
[0135]
b组：41mg/kg syn(以整个面团的重量计)
[0136]
c组：330mg/kg hes+41mg/kg syn(以整个面团的重量计)
[0137]
③
样品的处理
[0138]
称取3g烤鸭翅(0.5g曲奇饼干)样品置于50ml离心管中，加入5.0ml蒸馏水，涡旋混合3min，8000r/min离心10min，取上清液。再向离心管中加入5.0ml 50％的甲醇水溶液，涡旋混合后超声萃取60min，8000r/min离心10min，再次取上清液，将两次上清液合并混匀，8000r/min离心15min，取上清液进行衍生化。取500μl样品溶液，加入300μl dnph溶液，涡旋混匀后于37℃，220rpm的恒温摇床中避光反应2h，反应结束后加入3ml二氯甲烷溶液，涡旋30s，超声萃取15min(冰浴)，6000r/min离心10min，重复萃取2次，合并二氯甲烷相，真空浓缩至干，取300μl 70％乙腈溶液复溶，用高效液相色谱检测acr-dnph含量。检测方法同实施例1，所有样品做六组平行。
[0139]
(3)实验结果
[0140]
由图8所示，单用hes和syn时，烤鸭翅体系中分别有88.1％和60.3％的acr残留，曲奇体系中分别有92.7％和63.6％的acr残留，单用syn的抑制效果比hes更好。而hes和syn二元联用时，烤鸭翅和曲奇中分别有30.7％和39.6％的acr残留，稍微低于模拟食品加工过程中添加相同剂量的hes和syn的抑制结果(28.66％ acr残留)，这可能是由于食品体系基质复杂而造成的。hes和syn二元联用时，食品体系中的acr含量大大降低，这充分表明hes和syn在模型系统和食品加工中对acr有显著的协同抑制作用，同时可以在高温烹饪中使用，可以作为一种新型的耐高温的高效抑制剂组合。

技术特征：
1.辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制丙烯醛中的应用。2.辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在制备丙烯醛抑制剂中的应用。3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制环境中丙烯醛的应用。4.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制食品或者食品加工中产生的丙烯醛的应用。5.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述辛弗林或者辛弗林与橙皮苷联用在抑制生物体内丙烯醛的应用。6.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述辛弗林与橙皮苷联用，二者使用量为各自针对丙烯醛的ic
50
浓度的0.25倍-2倍。7.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述橙皮苷或辛弗林通过捕获丙烯醛形成加合产物，从而降低丙烯醛含量。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述加合产物包括橙皮苷与丙烯醛的一加合产物hes-acr，辛弗林与丙烯醛的二加合产物syn-2acr，其结构分别如下所示：9.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述辛弗林和橙皮苷二元联用时，辛弗林优选作为促进剂或者催化剂提高橙皮苷的捕获活性，从而达到协同抑制丙烯醛的作用。10.一种环境、食品加工和生物体内丙烯醛抑制剂，其特征在于，所述抑制剂以辛弗林为唯一的成分或者二元联用，或者作为主要成分与其他物质复配共同使用，所形成的制剂。

技术总结
本发明公开了辛弗林或者橙皮苷和辛弗林二元联用作为丙烯醛抑制剂的应用，本发明首次了提出了橙皮苷或辛弗林对丙烯醛的抑制作用，特别是橙皮苷和辛弗林二元联用时，辛弗林作为促进剂或者催化剂从而与橙皮苷协同抑制丙烯醛的应用。本发明提出了橙皮苷和辛弗林的一种新应用，即橙皮苷和辛弗林二元联用能够快速有效捕获环境中或者食品加工中的丙烯醛以控制其含量，避免其与体内的生物大分子如DNA、蛋白质、核苷酸、磷脂等的亲核位点发生共价结合，进而形成各种有害交联或加合产物，预防其对人体造成的危害。造成的危害。造成的危害。


技术研发人员：司波 吕丽爽 梁雨 仲宇晴
受保护的技术使用者：宿迁市产品质量监督检验所
技术研发日：2023.03.10
技术公布日：2023/7/20