一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法与流程

1.本发涉及一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.漆酚c1、c2位为酚羟基，c3位为15-17的直链烷烃，主要由饱和漆酚和不饱和漆酚（不饱和度从0到3）组成。漆酚具有强烈的化学活性，易氧化聚合不稳定。漆酚导致的过敏性反应严重影响了漆酚的运用，漆酚主要导致过敏性接触性皮炎（acd），是一种皮肤接触各种过敏原之后引起的细胞介导免疫反应。血管再生和淋巴管再生都在变应性致敏过程中发生。
3.另一方面，漆酚具有显著的抗肿瘤细胞活性、肿瘤血管生成抑制效果以及核转录因子-κb抑制活性等。漆酚的最小抑菌浓度范围为 0.064-0.256 mg/ml，10 min即将幽门螺旋杆菌的细胞壁溶解。漆酚与三联疗法（奥美拉唑+克拉霉素+甲硝咪唑）结合，抑制幽门螺旋杆菌的增殖率为 100%。研究表明，针对 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph），2,2-联苯-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（abts）自由基，漆酚表现出较好的清除能力，且三不饱和度的漆酚抑菌性能最好。漆酚等对肝病中肠-肝细胞因子释放轴的影响，评估了漆酚等对老鼠 ald 的影响，病理学结果表明漆酚等显著降低了小鼠酒精诱导脂肪变性的程度，提高了小鼠免疫能力，具备治疗ald 的潜力。
4.但是，由于漆酚强烈的致敏特性和低毒作用，严重限制了它在药理活性领域的应用。因此，开发低毒、低敏的漆酚低聚物具有良好的前景，可以拓宽其在功能食品、药品和功能基材料领域的应用。酶法转化具有条件温和、环保的特点。因此，本专利提供一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，旨在获得高含量的漆酚低聚体，提升漆酚的利用。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有的技术不足，拓宽漆酚的应用，提供一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，所述方法的步骤在于：第一步取适量漆酚放入三口烧瓶中，用体积比1:1(v:v)甘油水溶液溶解，漆酚与甘油水溶液的比例按g/ml为1:100~1:500，然后进行搅拌剪切；然后加入固定化酶，漆酚与固定化酶的质量比为5:1~1:5(g/g)，在30~60℃恒温水浴中反应30~180min，得到反应液；第二步将上述反应液，离心，去除固定化酶，然后按体积比为1:1~1:5(v:v)，加入丙酮或乙酸乙酯，提取2~3次，每次10~30min，合并丙酮或乙酸乙酯液，于40~60℃下减压蒸发除去溶剂，得到粗提物；
第三步在氮气氛围中，将上述粗提物与与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯体积比为9:1-8:2(v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到漆酚低聚体。
7.固定化酶的制备方法为：（1）取适量的酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液;（2）取海藻酸钠和助剂2~5g，海藻酸钠和助剂质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；（3）取上述酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；（4）取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；（5）将上述含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次；酶选自酪氨酸酶、胆红素氧化酶、梨多酚氧化酶、茶多酚氧化酶中的一种或几种；助剂选自白果淀粉、玉米淀粉、微米多孔碳球、氧化石墨烯水分散液、cof有机框架材料中的一种或几种。
8.漆酚低聚体为联苯型、二苯并呋喃型和苯核-侧链耦合型的混合物，其聚合度为2~3，收率为50~80%。
[0009][0010]
本发明的有益效果
[0011]
本发明所提供的一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，还具有以下特点：(1) 本发明所用的固定化酶，具有缓慢释放酶活性的作用，并保持酶活性的稳定性，有效降低酶活损失率；(2) 本发明制备漆酚低聚体过程简便，产品易获得，且酶能够重复回收利用；(3) 本发明制备漆酚低聚体的方法，时间短，收率高，重现性好；(4) 本发明制备的漆酚低聚体，致敏性和毒性大幅度降低，可以广泛应用到功能性药物化学领域和功能性添加剂领域。
具体实施方式
[0012]
实施例1 固定化酶的制备方法取适量的酪氨酸酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到
酶液；取海藻酸钠和白果淀粉2~5g，海藻酸钠和白果淀粉质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；将含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次。
[0013]
实施例2 固定化酶的制备方法取适量的胆红素氧化酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液；取海藻酸钠和玉米淀粉2~5g，海藻酸钠和玉米淀粉质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；将含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次。
[0014]
实施例3 固定化酶的制备方法取适量的梨多酚氧化酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液；取海藻酸钠、玉米淀粉和微米多孔碳球2~5g，海藻酸钠和（玉米淀粉：微米多孔碳球）的质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；将含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次。
[0015]
实施例4 固定化酶的制备方法取适量的茶多酚氧化酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液；取海藻酸钠、氧化石墨烯水分散液2~5g，海藻酸钠和氧化石墨烯水分散液的质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；将含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次。
[0016]
实施例5 固定化酶的制备方法取适量的酪氨酸酶和胆红素氧化酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液；取海藻酸钠和cof有机框架材料2~5g，海藻酸钠和cof有机框架材料的质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；取适量氯化钙和
8:2(v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到漆酚低聚体。
[0021]
实施例10取适量漆酚放入三口烧瓶中，用体积比1:1(v:v)甘油水溶液溶解，漆酚与甘油水溶液的比例按g/ml为1:100~1:500，然后进行搅拌剪切；然后加入固定化酶，漆酚与固定化酶的质量比为5:1~1:5(g/g)，在30~60℃恒温水浴中反应30~180min，得到反应液；将上述反应液，离心，去除固定化酶，然后按体积比为1:1~1:5(v:v)，加入丙酮或乙酸乙酯，提取2~3次，每次10~30min，合并丙酮或乙酸乙酯液，于40~60℃下减压蒸发除去溶剂，得到粗提物；在氮气氛围中，将上述粗提物与与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯体积比为9:1-8:2(v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到漆酚低聚体。
[0022]
实施例11取适量漆酚放入三口烧瓶中，用体积比1:1(v:v)甘油水溶液溶解，漆酚与甘油水溶液的比例按g/ml为1:100~1:500，然后进行搅拌剪切；然后加入固定化酶，漆酚与固定化酶的质量比为5:1~1:5(g/g)，在30~60℃恒温水浴中反应30~180min，得到反应液；将上述反应液，离心，去除固定化酶，然后按体积比为1:1~1:5(v:v)，加入丙酮或乙酸乙酯，提取2~3次，每次10~30min，合并丙酮或乙酸乙酯液，于40~60℃下减压蒸发除去溶剂，得到粗提物；在氮气氛围中，将上述粗提物与与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯体积比为9:1-8:2(v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到漆酚低聚体。
[0023]
实施例12漆酚低聚体为联苯型、二苯并呋喃型和苯核-侧链耦合型的混合物，其聚合度为2~3，收率为50~80%。

技术特征：
1.一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，所述方法的步骤在于：第一步取适量漆酚放入三口烧瓶中，用体积比1:1(v:v)甘油水溶液溶解，漆酚与甘油水溶液的比例按g/ml为1:100~1:500，然后进行搅拌剪切；然后加入固定化酶，漆酚与固定化酶的质量比为5:1~1:5(g/g)，在30~60℃恒温水浴中反应30~180min，得到反应液；第二步将上述反应液，离心，去除固定化酶，然后按体积比为1:1~1:5(v:v)，加入丙酮或乙酸乙酯，提取2~3次，每次10~30min，合并丙酮或乙酸乙酯液，于40~60℃下减压蒸发除去溶剂，得到粗提物；第三步在氮气氛围中，将上述粗提物与与硅胶填料按质量比1:15-50吸附，柱长50-150 cm，柱直径4-20 cm，采用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行洗脱，收集石油醚:乙酸乙酯体积比为9:1-8:2(v:v)的部位，真空浓缩，回收溶剂，得到漆酚低聚体。2.根据权利要求1所述一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，其特征在于第一步和第二步中的固定化酶的制备方法为：（1）取适量的酶溶于磷酸盐缓冲溶液中，控制酶的浓度在400~1600u/ml，得到酶液;（2）取海藻酸钠和助剂2~5g，海藻酸钠和助剂质量比为1:5~5:1(g/g)，加水100ml，控制温度在30~60℃，搅拌使其充分溶解，得到混合溶液；（3）取上述酶液，加入到冷却后的混合溶液中，搅拌均匀，得到含酶液的混合溶液；（4）取适量氯化钙和戊二醛，加入到水中，氯化钙和水的质量体积比为3:100~8:100（g:ml），戊二醛与水的质量体积比为1:100~8:100（g:ml），得到含氯化钙和戊二醛的水溶液；（5）将上述含酶液的混合溶液缓慢分散至含氯化钙和戊二醛的水溶液中，静置固化3~24h，取出固定化酶，并用磷酸盐缓冲溶液清洗2~3次，蒸馏水清洗2~3次；其中，所述的酶选自酪氨酸酶、胆红素氧化酶、梨多酚氧化酶、茶多酚氧化酶中的一种或几种；其中，所述的助剂选自白果淀粉、玉米淀粉、微米多孔碳球、氧化石墨烯水分散液、cof有机框架材料中的一种或几种。3.根据权利要求1所述一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，其特征在于漆酚低聚体为联苯型、二苯并呋喃型和苯核-侧链耦合型的混合物，其聚合度为2~3，收率为50~80%。

技术总结
本发明公开了一种固定化酶体外催化制备漆酚低聚体的方法，属于生物工程技术领域，包括以下步骤：（1）将漆酚在甘油水溶液中分散，将固定化酶分散在分散液中，恒温水浴聚合；（2）固定化酶去除，采用萃取、柱层析分离得到漆酚低聚体。本发明方法得到的低聚体收率高，方法简便，且酶活性高，酶能够重复利用，漆酚低聚体的致敏性和毒性大幅度降低，可以广泛应用到功能性药物化学领域和功能性添加剂领域。性药物化学领域和功能性添加剂领域。


技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院林产化学工业研究所
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/20