一种基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂、制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种肝硬化的检测方法，具体涉及一种基于血清寡糖链g-test特异指纹图谱的肝硬化检测方法。


背景技术：

2.肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成、肝内外血管增殖为特征的病理阶段，代偿期无明显临床症状，失代偿期以门静脉高压和肝功能严重损伤为特征，患者常因并发腹水、消化道出血、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征和癌变等导致多脏器功能衰竭而死亡。肝硬化起病常隐匿，早期可无特异性症状和体征。
3.肝硬化的临床诊断需综合考虑病因、病史、临床表现、并发症、治疗过程、检验、影像学及组织学等检查，通过各种检查来评估肝功能及门脉高压，但各种技术手段均存在一定的局限性。如血液学检查白蛋白(alb)、前白蛋白、凝血因子(维生素k依赖因子ⅱ、ⅶ、
ⅸ
和
ⅹ
)、胆固醇及胆碱酶等，但是血液学检查需要同时检测多个指标，综合判断得出结论，且漏诊率较高。影像学检查包括腹部b超、肝脏硬度测定(lsm)、瞬时弹性成像(te)、ct、mri和磁共振弹性成像(mre)，影像学评估手段对晚期肝硬化的检查结果相对可靠，但是对早期肝功能异常不能准确判断，且容易受患者肥胖和操作人员经验不同的影响而造成偏差。组织学检查肝活检是诊断与评价不同病因致早期肝硬化及肝硬化炎症活动程度的“金标准”，但肝硬化患者肝穿组织易碎、不完整，有时肝组织学检查不能准确反映肝硬化病变全貌；另外肝活检为侵入性手段，由于侵入性、并发症风险高、费用高，不适合常规应用，因此患者接受程度差。门脉高压症的评估，除了常规影像学方法外，内镜检查和肝静脉压力梯度(hvpg)也常在临床中使用，但是内镜检查患者接受程度差，hvpg为由创检测，对设备及操作者的技术水平有一定要求，且成本较高，在临床难以常规应用。因此，目前急需新的标志物对肝硬化进行辅助诊断。
4.蛋白质糖基化(glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质肽链上的天冬酰胺(asn)的胺基形成n-连接聚糖或苏氨酸/丝氨酸的羟基氧原子形成o连接聚糖，参与调控蛋白质的功能。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。蛋白质上n-糖链通过加工修饰来调控蛋白质的结构，稳定性和活性，所以糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能起重要作用，从而赋予糖蛋白具有多种生物功能。因此了解糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。
5.目前己经在多种肿瘤和炎症性疾病中发现了蛋白质n-糖链的异常改变，而n-糖链的末端唾液酸修饰改变是其中之一。唾液酸是一类带负电荷的9碳糖化合物，广泛存在于生物体内，常位于聚糖链末端；其在唾液酸酶的作用下通过α-2,3或α-2,6糖苷键与糖链上的半乳糖或n-乙酰半乳糖胺连接形成聚唾液酸链。研究发现聚糖链末端的唾液酸在调控细胞的相互识别、分子相互作用、病毒感染、免疫响应以及信号传导起到重要的功能，且细胞表面糖蛋白质唾液酸修饰具有组织和细胞特异性。众多研究表明唾液酸修饰异常导致了多种
疾病的发生发展，如感染性疾病的发生，以及肿瘤的浸润和转移有着密切关系。此外，人体内血清中n-糖蛋白主要由肝脏和b淋巴细胞合成，n-糖蛋白的聚糖结构与数量的异常往往可以反映肝脏和b淋巴细胞病变。因此，检测唾液酸相关寡糖链的改变对肝硬化辅助诊断具有潜在的临床价值。


技术实现要素：

6.针对目前临床上肝硬化检测中存在的问题，如血清学检查需要同时检测多个指标，综合判断得出结论，且漏诊率较高；影像学检查对早期肝硬化不能准确判断，且受患者肥胖和操作人员经验不同的影响而造成偏差。组织学检查由于侵入性、并发症风险高、费用高，不适合常规应用，患者接受程度差；hvpg为有创检查，对设备及操作者的技术水平有一定要求，且成本较高，在临床难以常规应用等。本发明提供一种肝硬化的检测试剂，通过该试剂测定血清中的天然寡糖n-糖组图谱，通过将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种肝硬化的血清天然寡糖n-糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测肝硬化。
7.本发明采用的技术方案如下：
8.一种基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂，由以下试剂组成：
9.试剂a：浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的sds配制而成；
10.试剂b：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液ph值为5～9；
11.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制成浓度为0.02mm～1m有机物还原剂；
12.试剂d：终止液。
13.优选的，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积比是1:1:1。
14.优选的，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积都为5μl。
15.优选的，所述试剂d为超纯水。
16.一种基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
17.步骤一寡糖链的制备
18.在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥；
19.步骤二寡糖链的标记
20.在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂d终止标记反应；
21.步骤三寡糖链分离分析
22.取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行n-寡糖链分离检测，得到天然寡糖n-糖组图谱；
23.步骤四数据处理分析
24.n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
25.一种组合物在制备寡糖链肝硬化检测试剂中的应用，所述组合物由血清中的g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，所述组合物通过g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f的值来检测肝硬化。
26.所述g1f为同分异构体。
27.本发明提供一种肝硬化的血清天然寡糖n-糖组图谱模型的建立方法，通过测定血清天然寡糖链g-test特异指纹图谱，进行统计学分析。
28.材料和方法：
29.一、检测样本：肝硬化患者和健康人的血清。
30.二、实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
31.三、试剂制备：
32.1、试剂a：浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的sds配制而成；
33.2、试剂b：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液ph值为5～9；
34.3、试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制成浓度为0.02mm～1m有机物还原剂；
35.4、试剂d：终止液。
36.四、n-糖组图谱检测
37.1、寡糖链的制备
38.在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性；待冷却至室温后，加入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥。
39.2、寡糖链的标记
40.(1)干燥后的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h，进行荧光标记；
41.(2)荧光标记完成后，加入100μl试剂d终止标记反应。
42.3、寡糖链分离分析
43.取10μl寡糖链标记后的液体，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离检测，从而得到天然寡糖n-糖组图谱。
44.4、数据处理分析
45.(1)n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
46.(2)肝硬化患者与健康人群n-糖组数据分析：将肝硬化患者与健康人n-糖组数据进行对比分析。将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即n-糖组图谱的峰值量化，然后对量化后的肝硬化组和健康对照组n-糖组图谱中9个n-寡糖链峰进行比对统计分析。n-糖组图谱的组合物由g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，其中g1f为同分异构体；通过组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f值来检测肝硬化。
47.与现有技术相比，本发明的有益效果：
48.(1)将g-test指纹图谱的各个峰值进行量化，然后将肝硬化患者(180例)和健康人(160例)各峰相对含量结果进行对比分析，发现n-聚糖组合物g3s3，g2s2，g2s2f和g1s1f在
两组间存在显著的统计学差异(p《0.05)；因此，基于组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f建立的模型在区分肝硬化患者时roc曲线下auc值达到0.950，该g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f模型检测的cutoff值为8.00时，对肝硬化的检测有90.00％的灵敏度和86.00％的特异性，表明血清中的n-聚糖组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f可以作为辅助诊断肝硬化的标志物。
49.(2)本发明提出的g-test检测法是基于dna测序仪的毛细管微电泳技术(dsa-face)，将血清样本中糖蛋白n-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的糖蛋白的含量即天然寡糖n-糖组图谱。本发明通过检测生理病理状态下唾液酸寡糖链的变化与疾病状态的相关性，可以根据这些变化，建立n-聚糖组合物的预测模型来辅助诊断肝硬化状态。
50.(3)基于本发明方法构建的g-test天然n-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测肝硬化的发生和疾病进展，本发明的检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(5μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等优点，可在临床中推广使用。
附图说明
51.图1是健康人和肝硬化患者的血清天然寡糖n-糖组图谱；
52.图2是基于n-糖组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f建立的鉴别肝硬化状态模型roc曲线图；检测样本总数为340例，其中肝硬化患者血清180例，健康人血清160例，得到roc曲线下面积auc＝0.950。
具体实施方式
53.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件。
54.检测肝硬化状态，通过测定血清天然寡糖n-糖组图谱，进行统计学分析，采用的材料和方法如下列实施例。
55.实施例一
56.1.检测样本：肝硬化患者和健康人的血清。
57.2.实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
58.3.试剂制备：
59.(1)试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度2.5％的sds配制而成；
60.(2)试剂b：由3.5单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液ph值为7；
61.(3)试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成浓度为10mm有机物还原剂；
62.(4)试剂d：超纯水。
63.4.n-糖组图谱检测：
64.(1)寡糖链的制备
65.在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性；待冷却至室温后，加
入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥。
66.(2)寡糖链的标记
67.1)干燥后的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h，进行荧光标记；
68.2)荧光标记完成后，加入100μl试剂d终止标记反应。
69.(3)寡糖链分离分析
70.取10μl寡糖链标记后的液体，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离检测，从而得到天然寡糖n-糖组图谱。
71.(4)数据处理分析
72.1)n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。
73.2)肝硬化患者与健康人群n-糖组数据分析：将肝硬化患者与健康人n-糖组数据进行对比分析。如图1所示，人血清的n-糖组图谱显示出近9个n-寡糖链峰，不同寡糖链因所带电荷以及分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在n-糖组图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，其峰高代表了寡糖链的相对含量。图1中a为健康人血清n-聚糖图谱，b为肝硬化患者血清n-聚糖图谱。n-糖组图谱的组合物由g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，其中g1f为同分异构体；通过计算组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f值来辅助判断肝硬化状态。
74.基于组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f建立的模型在区分肝硬化患者时roc曲线下auc值达到0.950(图2)，该g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f模型检测的cutoff值为8.00时，对肝硬化的检测有90.00％的灵敏度和86.00％的特异性，表明血清中的n-聚糖组合物g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f可以作为辅助诊断肝硬化的标志物。
75.实施例二
76.1.检测样本：肝硬化患者和健康人的血清。
77.2.实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
78.3.试剂制备：
79.(1)试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1％的sds配制而成；
80.(2)试剂b：由0.05单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液ph值为5；
81.(3)试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成浓度为0.02mm有机物还原剂；
82.(4)试剂d：超纯水。
83.4.n-糖组图谱检测同实施例一。
84.实施例三
85.1.检测样本：肝硬化患者和健康人的血清。
86.2.实验设备：毛细管电泳分析仪，pcr，离心机。
87.3.试剂制备：
88.(1)试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度5％的sds配制而成；
89.(2)试剂b：由10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，溶液ph值为9；
90.(3)试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成浓度为1m有机物还原剂；
91.(4)试剂d：超纯水。
92.4.n-糖组图谱检测同实施例一。
93.本检测技术与现有技术相比，通过检测生理病理状态下唾液酸寡糖链的变化与疾病状态的相关性，可以根据这些变化，建立n-聚糖组合物的预测模型来辅助判断肝硬化状态。基于本发明方法构建的g-test天然n-糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测肝硬化的发生和疾病进展，可在临床中推广使用。
94.以上结合附图所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，凡在本发明的精神和原则之内，不需要付出创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂，其特征在于，由以下试剂组成：试剂a：浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的sds配制而成；试剂b：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的np-40和浓度为10mm、ph为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液ph值为5～9；试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制成浓度为0.02mm～1m有机物还原剂；试剂d：终止液。2.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂，其特征在于，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积比是1:1:1。3.根据权利要求2所述的基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂，其特征在于，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积都为5μl。4.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂，其特征在于，所述试剂d为超纯水。5.根据权利要求1所述的基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一寡糖链的制备在经过灭活处理的5μl血清样品中加入5μl试剂a，进行变性，冷却至室温后，加入5μl试剂b，37℃反应3h，然后进行干燥；步骤二寡糖链的标记在步骤一干燥后得到的样品中加入5μl试剂c，60℃反应1h后进行荧光标记，然后加入100μl试剂d终止标记反应；步骤三寡糖链分离分析取10μl寡糖链标记后的液体，用分析仪进行n-寡糖链分离检测，得到天然寡糖n-糖组图谱；步骤四数据处理分析n-糖组图谱的峰值量化：将每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和，计算得到每个峰的相对含量。6.一种组合物在制备寡糖链肝硬化检测试剂中的应用，其特征在于，所述组合物由血清中的g4s4、g3s3、g2s2、g2s2f、g2s1、g2s1f、g1f和g2f2组成，所述组合物通过g3s3/g2s2+g2s2f/g1s1f的值来检测肝硬化。7.根据权利要求6所述的一种组合物在制备寡糖链肝硬化检测试剂中的应用，其特征在于，所述g1f为同分异构体。

技术总结
本发明提供了一种基于寡糖链检测肝硬化的检测试剂及其制备方法和应用，检测试剂由以下试剂混合而成，试剂A：浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度1～5％的SDS配制而成；试剂B：由0.05～10单位/10μl糖胺酰酶、质量浓度10％的NP-40和浓度为10mM、pH为8.3的碳酸氢铵溶液混合配制而成，混合溶液pH值为5～9；试剂C：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于DMSO中配制成浓度为0.02mM～1M有机物还原剂；试剂D：终止液。本发明通过该试剂测定血清中的天然寡糖N-糖组图谱，再将峰值量化并进行统计学分析，从而提供一种肝硬化的血清天然寡糖N-糖组图谱模型的建立方法，通过测定生理病理状态下蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测肝硬化。蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测肝硬化。蛋白质的天然糖基化修饰的改变来检测肝硬化。


技术研发人员：陈翠英 张军利 徐蕾 李维泉 傅婷婷
受保护的技术使用者：江苏先思达生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.03
技术公布日：2023/7/20