SlCSN5B基因在调控番茄开花时间中的应用

slcsn5b基因在调控番茄开花时间中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及slcsn5b基因在调控番茄开花时间中的应用。


背景技术：

2.番茄作为我国重要的蔬菜经济作物之一，全球年总产量居世界蔬菜作物首位，在蔬菜产业中占据重要位置。开花是番茄获得果实和种子的前提，开花时间是影响植物生育期、产量、品质等重要农艺性状的主要因素之一，对经济作物开花时间方面的研究一直是植物学家重点关注的方向，早花、高产也是育种家一直追求的目标。因此，开展番茄开花时间相关方向的研究，对缩短生长周期、均衡优化产业需求、提高番茄产量有重大的应用价值和意义。
3.目前，与拟南芥等其它模式植物相比，关于番茄开花基因的研究仍旧很有限，新的开花基因仍待发现，并且挖掘新的开花基因有利于番茄早花新种质的创制，为番茄开花期改良提供新的基因资源和指导，具有重要的应用前景。


技术实现要素：

4.本发明利用crispr-cas9介导的基因编辑技术，对番茄slcsn5b基因进行突变，突变该基因致其功能丧失后，番茄植株表现出提早开花的表型，由此确认了该基因与番茄开花时间相关。
5.本发明的目的之一在于保护slcsn5b基因编码的蛋白质在调控番茄开花时间中的应用，所述slcsn5b基因编码的蛋白质的序列如seq id no:5所示。
6.本发明的目的之二在于保护slcsn5b基因在调控番茄开花时间中的应用，所述slcsn5b基因编码的蛋白质的序列如seq id no:5所示。
7.具体地，所述slcsn5b基因选自下述(1)～(3)中的任一种：
8.(1)核苷酸序列如seq id no:3所示的序列或与其互补的序列；
9.(2)核苷酸序列如seq id no:4所示的序列或与其互补的序列；
10.(3)包含(1)或(2)中核苷酸序列的序列。
11.本发明的目的之三在于保护slcsn5b基因起始密码子上游序列或终止密码子下游序列在调控番茄开花时间中的应用，其中上游序列的核苷酸序列如seq id no:1所示，下游序列的核苷酸序列如seq id no:2所示。
12.本发明的目的之四在于保护含有上述基因序列的重组载体、表达盒或工程菌在调控番茄开花时间中的应用。
13.本发明的目的之五在于保护一种使番茄开花时间提前的方法，具体为：敲除上述基因。
14.本发明通过设计slcsn5b基因的靶点，构建u6pro-target-grna表达盒，利用同源重组的方法连接到ptx双元载体上，并转化到农杆菌中，侵染番茄子叶外植体，进一步分化出芽、诱导生根，获得转基因植株，通过对靶点编辑情况及突变体植株的表型统计，发现与
对照植株相比，突变体植株开花时间提早了约6天，说明该基因在调控番茄开花通路中发挥着重要作用，在一定程度上可以缩短植株生长发育周期，创制了番茄早花新种质，为番茄开花期改良提供了基因资源。
附图说明
15.图1为crispr-cas9靶向slcsn5b基因靶点及slcsn5b突变体靶点突变类型示意图；
16.图2为ac和slcsn5b突变体植株表型；
17.图3为ac和slcsn5b突变体植株开花时间统计图。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
19.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
20.实施例1
21.本实施例提供一种与番茄开花时间相关的slcsn5b基因，该基因起始密码子上游5000bp的序列如seq id no:1所示，终止密码子下游1000bp的序列如seq id no:2所示，slcsn5b基因的基因组序列如seq id no:3所示，编码序列如seq id no:4所示，编码的蛋白质序列如seq id no:5所示。
22.seq id no:1：gctgctgctcagttacctccctttgacgatgaagg catttttgatccggatgacctgttcacagaccagatgttctgatttgatggaggtgaagctgtcaatgttgatattagttggtcacaaccagatagtctgatactgcactttttgtttttctttttttgaagacttgtgccattttgttagacagtattgctcttattcatctatttttaatctgctttaaggagccagattttctgtatcttcaaactcttttgagagagtaagtggattttagttgaaatttttcaaaataaaatggtagcagtttgagttcttgcaagttctttgtttatgtagtttgttggtttttctttttgccaaaacctcttgcaagctaatggttcagactagaatcaaatgctactaaggtaagtgtttatttttttttttgtattcttattgctatcaatgtcaaaggatcacttttctgtacatcaaggactatttctatttgaacacctcttataacatattacgtgaactctctgtcttgtgaaagtaatagccaagagagtgtctccatgagcattcttccgccatcttaaacaagtaaagtgcgtatggctaccactagttctatgatttcaactgaatttattgtcttcgactcaaaactataatatgtgcaaaaacaaaagaaagaaaatgtatgcatacatataataagatcacgttcactctgaactcaataaattggttattattgtctaactttgagatatatgtatctaagttatctcaaatcttatcatcagcctcatcttcaattggagctgctacatttacataaagcttctggccattgatgcaatttgtattgttgctggatttgaaataataatctccaggtaccaacatgaatgctattgctggactatctttgtattgccttgaaagagtgttggaattgcatgcataatagttgtattttccaatctctagcaaatcctctggcttttggaatctaaactctacaaataaaatggtacatgaatacataatattatgtacacggaaaattaactttctaaaagataaataaagttatgaattatattcaaagtatgtagtttagatgttagggttagaggtgtagagctatccttgtgcaaagagagtgaatggcactccttcaccacaaaatcaaacacttttattgatttgatttggtttatgaagttataaaactgatatagctagtttgattaggtaaatgaaaaaaactaacacccctaaaattagttggtacctttaatccttccaaacacggctaaagaaagacttcaagccaaattatatatgaggaatggttgaaatgacaagaaaagtaactggtgaggagacaaacacctgaggaaggaaattctcacaaataaga
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25.seq id no:4：atggacgctctgaattcttacgcatcgtcggcggcgatggcgcaacaaacatgggagttagaaaacaacatcgtgacgacggacgcgccatcggggtcggcaccggaaaactctgcgtcggatgcaatattccactatgacgatgcggcacagactaagttccagcgggagaagccgtggacgagtgaccctcactacttcaagcgcgtgaagatctctgctcttgctcttctaaagatggttgttcacgcgcgttctggaggtacaattgaggtaatgggactaatgcaaggtaagacggatggagatgctattattgttatggacgcttttgcccttccagttgaaggaactgaaactagggttaatgctcaagctgatgcgtatgaatacatggttgaatattcacagaccaacaagcaggctggtcggctggagaatgtggtcggatggtatcattctcatcctggctatggatgctggctctctggcattgatgtaactacacaaatgcttaaccagcagtatcaggagccctttcttgcagttgttattgatccaacaagaactgtttctgctggaaaagttgagattggtgcctttcgaacatatcctgaaggatataagcctccagatgaccctatctcagagtaccagaccattcctttgaacaaaattgaagacttcggagtacattgcaagcagtattattcattggatattacctatttcaagtcctctctcgattgccatctcttggacctactatggaacaagtattgggtgaacacactttcttcttctcctttgcttggaaatggagactatgttgctggacagatatctgatcttgctgaaaagttggagcaagctgaaaatcagctgtcccattcacgttttgggcacttagtggcagcccctcaaaggaagaaggaggaagaatctcagcttgctaagattacacgtgatagtgctaagattactgtcgagcaagttcatggcttaatgtcgcaggttattaaagacattcttttcaatagcgtttgtaagtcaggcaagtcgcagactgaaccctctgatccagagccgatggtcgaaacctga；
26.seq id no:5：mdalnsyassaamaqqtwelennivttdapsgsap ensasdaifhyddaaqtkfqrekpwtsdphyfkrvkisalallkmvvharsggtievmglmqgktdgdaiivmdafalpvegtetrvnaqadayeymveysqtnkqagrlenvvgwyhshpgygcwlsgidvttqmlnqqyqepflavvidptrtvsagkveigafrtypegykppddpiseyqtiplnkiedfgvhckqyysldityfkssldchlldllwnkywvntlssspllgngdyvagqisdlaekleqaenqlshsrfghlvaapqrkkeeesqlakitrdsakitveqvhglmsqvikdilfnsvcksgksqtepsdpepmvet*。
27.实施例2slcsn5b基因功能的验证
28.本实施例提供一种slcsn5b基因功能的验证方法，其中涉及开花时间的统计所用的统计方法为：从播种至第一花花芽分化出现的时间。番茄遗传转化所使用的背景材料ac为ailsa craig，种质来源于tgrc。具体方法主要包括构建slcsn5b基因编辑载体，番茄遗传转化，slcsn5b基因编辑植株的检测，编辑植株的表型观察统计，详细步骤如下：
29.(1)构建slcsn5b基因编辑载体
30.利用crispr direct网站(http://crispr.dbcls.jp/)设计slcsn5b基因双靶点，两个靶点选择在第一外显子上，靶点的片段长度为19bp，两个靶点之间的间隔不超过
800bp，在靶点引物的5’端加同源重组序列，在3’端加中间载体引物，靶点引物slcsn5b-g1-f和slcsn5b-g2-r序列如下：
31.slcsn5b-g1-f：gaatctaacagtgtagtttgggcgatggcgcaaca aacatgttttagagctagaaatag(seq id no.6)；
32.slcsn5b-g2-r：gctatttctagctctaaaacgtgccgaccccgatg gcgcgcaaactacactgttagatt(seq id no.7)。
33.以中间载体ptx043质粒(deng l,wang h,sun c,li q,jiang h,du m,li c-b,li c(2018)efficient generation of pink-fruited tomatoes using crispr/cas9 system.journal of genetics and genomics 45(1):51-54.doi:10.1016/j.jgg.2017.10.002)为扩增模板，slcsn5b-g1-f和slcsn5b-g2-r为扩增引物，扩增包含slcsn5b基因双靶点的grna序列。其中扩增体系为：pcr体系(50μl)：100-200ng/μl dna模板1μl，2
×
phanta max buffer25μl，10mm dntp mix 1μl，10um引物各2μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，ddh2o 18μl。扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸5min，12℃5min。扩增后的序列如seq id no:8所示。
34.seq id no:8：gaatctaacagtgtagtttgggcgatggcgcaac aaacatgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttttgcaaaattttccagatcgatttcttcttcctctgttcttcggcgttcaatttctggggttttctcttcgttttctgtaactgaaacctaaaatttgacctaaaaaaaatctcaaataatatgattcagtggttttgtacttttcagttagttgagttttgcagttccgatgagataaaccaataataaatctttttaatttatagtatatttatgtaagttttcacgttgagtaaatagcgaagaagttgggcccaaccaagtaaaataagaaggccgggccattacaattaagtcgtcacacaactgggcttcattgaaaaaagcgcaaaaccgattccaggcccgtgttagcatgaagactcaactcaaccagagatttctccctcatcgcttacagaaaaaagctatatgctgtttatattgcgaatctaacagtgtagtttgcgcgccatcggggtcggcacgttttagagctagaaatagc。
35.扩增后切胶回收目的片段，使用bsal1限制性内切酶对双元表达载体ptx041(deng l,wang h,sun c,li q,jiang h,du m,li c-b,li c(2018)efficient generation of pink-fruited tomatoes using crispr/cas9 system.journal of genetics and genomics 45(1):51-54.doi:10.1016/j.jgg.2017.10.002)进行单酶切，酶切条件为：37℃酶切3h以上，切胶回收线性化载体，对回收的目的片段和线性化载体进行同源重组。将两段grna序列连接到酶切后的双元表达载体ptx041中。
36.将重组表达载体热激转化至大肠杆菌trans-t1(购自北京全式金生物技术有限公司)中，检测正确的单克隆后摇菌并抽提质粒，通过电激法或液氮法将重组质粒转化至农杆菌gv3101(购自上海唯地生物技术有限公司)中，检测正确后，可用于后续番茄遗传转化中。
37.(2)番茄遗传转化
38.a、种子准备：选择干净、无霉菌、较饱满、发芽率高且一致的种子，将种子粒粒分开后，在蒸馏水中浸泡1h左右；
39.b、种子消毒、接种：将蒸馏水倒掉，用75％无水乙醇对种子进行消毒45s左右，把消毒后的种子转移至无菌三角瓶中，再用次氯酸钠和蒸馏水等比例配制的溶液震荡消毒15min，之后用无菌水清洗种子3-4次，接种于1/2ms培养基中；
40.c、外植体制备：接种后6-7天，子叶完全展开，真叶未冒出时，将子叶切成小段，叶背面向上平放于kcms培养基(购自北京酷来博生物科技有限公司)中，暗培养12h左右；
41.d、农杆菌侵染：将活化好的农杆菌离心保留菌体，用悬浮液重悬菌体，把外植体放入配制好的侵染悬浮液中，并加入用悬浮液重悬的农杆菌，轻柔震荡侵染4min，倒掉侵染液，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液后，重新将外植体放于kcms培养基上，暗培养2天；
42.e、筛选培养：将外植体放置于筛选培养基(购自北京酷来博生物科技有限公司)中，在25℃恒温，16h光照、8h黑暗的环境中培养15-20天后，挑选出在愈伤冒绿的外植体材料继续继代培养至出现新芽；
43.f、生根：新芽生长至适当大小后即可转至生根培养基(购自北京酷来博生物科技有限公司)中，诱导生根，获得转基因苗；
44.g、移栽：转基因苗生长至合适大小后即可移栽到营养土和蛭石等比例的钵子中种植。
45.(3)基因编辑植株的检测
46.取转基因植株的叶片样品提取dna，dna提取方法采用ctab法进行。详细操作步骤为：取番茄幼嫩组织50-100mg于装有钢珠的2ml离心管中，加入750μl提取液，置于研磨机60hz，90s研磨。研磨后的样品置于65℃水浴锅中，水浴45-90min，每20min左右将离心管上下颠倒混匀一次。在离心管中加入750μl体积比为24:1的氯仿和异戊醇混合溶剂，上下颠倒100次左右。充分混匀后，10000rpm离心10min。将离心后约500μl的上清液转移至新的1.5ml离心管中，并加入与上清液等体积的异丙醇。上下混匀后，放置-20℃环境中10min。12000rpm离心10min，将上清液倒出，乳白色胶状沉淀物即为dna样品。用500-700μl的75％无水乙醇洗涤沉淀，充分洗涤后瞬时离心，弃上清液，再次瞬时离心，用移液器将上清液吸出。离心管开盖放置通风厨内，风干乳白色胶状dna样品至透明状后，加入约400μl ddh2o溶解dna，充分溶解后放置-20℃保存备用。
47.以dna样品为模板，用ptx-f和ptx-r引物(seq id no:9～10)进行载体插入情况检测。确定载体插入后，在slcsn5b基因双靶点前后设计靶点编辑检测引物slcsn5b-cr-f和slcsn5b-cr-r(seq id no:11～12)，检测基因靶点编辑情况。其中，
48.ptx-f：agcggataacaatttcacacagga(seq id no:9)；
49.ptx-r：gcaggcatgcaagcttattgg(seq id no:10)；
50.slcsn5b-cr-f：atggacgctctgaattcttac(seq id no:11)；
51.slcsn5b-cr-r：gccaggatgagaatgatacca(seq id no:12)。
52.(4)观察统计slcsn5b基因编辑植株的表型。
53.对slcsn5b突变植株进行表型观察统计，以ac材料作对照。种子催芽后挑选发芽一致的种子播种于穴盘中，待生长至2-3片真叶时，进行分苗，采用统一常规的栽培管理模式，观察记录植株生长情况，记录真叶叶片数，以及第一次花芽分化的时间。
54.结果见图1-3，图1为crispr-cas9靶向slcsn5b基因靶点及slcsn5b突变体靶点突变类型示意图，对slcsn5b的三个突变系csn5b-cr(csn5b-cr-11、csn5b-cr-13、csn5b-cr-26)进行靶点编辑情况检测，与对照wt(ac)相比，突变系csn5b-cr-11有2个碱基的插入，突变系csn5b-cr-13有539个碱基的缺失，突变系csn5b-cr-26有2个碱基的缺失；图2为ac和slcsn5b突变体植株表型，箭头表示第一花序位置，与对照ac相比，slcsn5b突变植株花芽分
化开始的时间提前；图3为ac和slcsn5b突变体植株开花时间统计图，图中横坐标表示播种的天数，纵坐标表示真叶叶片数目，箭头表示花芽分化出现。所有数据均为平均值
±
标准误差值。
55.由图1-3可知，与对照植株ac相比，三个突变株csn5b-cr-11、csn5b-cr-13、csn5b-cr-26的开花时间均提前了约6天。
56.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.slcsn5b基因编码的蛋白质在调控番茄开花时间中的应用，所述slcsn5b基因编码的蛋白质的序列如seq id no:5所示。2.slcsn5b基因在调控番茄开花时间中的应用，其特征在于，所述slcsn5b基因编码的蛋白质的序列如seq id no:5所示。3.根据权利要求2所述的slcsn5b基因在调控番茄开花时间中的应用，其特征在于，所述slcsn5b基因选自下述(1)～(3)中的任一种：(1)核苷酸序列如seq id no:3所示的序列或与其互补的序列；(2)核苷酸序列如seq id no:4所示的序列或与其互补的序列；(3)包含(1)或(2)中核苷酸序列的序列。4.slcsn5b基因起始密码子上游序列或终止密码子下游序列在调控番茄开花时间中的应用，其中上游序列的核苷酸序列如seq id no:1所示，下游序列的核苷酸序列如seq id no:2所示。5.含有权利要求2或4所述序列的重组载体、表达盒或工程菌在调控番茄开花时间中的应用。6.一种使番茄开花时间提前的方法，其特征在于，敲除权利要求2中所述的基因，所述番茄开花时间是指从播种至第一花花芽分化出现的时间。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体涉及SlCSN5B基因在调控番茄开花时间中的应用。SlCSN5B基因的编码序列如SEQ ID NO:4所示，通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术，对该基因进行突变使其功能丧失，突变型植株的开花时间比对照植株普遍提前约6天，通过对该基因进行编辑可以控制番茄开花时间，缩短植株生长周期，实现不同花期的品种培育工作。实现不同花期的品种培育工作。


技术研发人员：张俊红 张得迪 艾国 叶志彪 吉康娜 杨子萱 黄蓉
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/7/20