一种检测非洲猪瘟病毒的四重qPCR引物探针组及其应用

一种检测非洲猪瘟病毒的四重qpcr引物探针组及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，致死率可高达100％。世界动物卫生组织(woah)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。自1921年肯尼亚首次爆发asf后，一直到20世纪中期，asfv仅在非洲地区流行传播，但1957年传播到了葡萄牙，并进一步在欧洲其他国家扩散开来，2007年格鲁吉亚发生非洲猪瘟并向周围扩散开来，2018年8月，中国沈阳首次发生非洲猪瘟病例，随后在我国各省市蔓延开来，对我国养猪业造成巨大损失。
3.非洲猪瘟病毒属于dna病毒目，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是可以由虫媒传播的dna病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径为约为200nm，外包囊膜，内部含有数个共同轴心的同心圆结构，基因组全长170～196kb，含有150～167个个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，根据asfv的b646l基因c末端序列的差异可分为24个基因型。目前我国已出现基因ⅰ型和ⅱ型，不同基因型毒株的b646l基因序列差异小，只能通过测序区分，本发明中通过比对基因ⅰ型和ⅱ型毒株的ep402r基因，发现存在序列差异，所以设计了针对基因ⅰ型和ⅱ型毒株的ep402r基因的引物探针。
4.目前，临床中检测非洲猪瘟的方法主要为荧光定量pcr方法，敏感度高，检测时间短，但是由于非洲猪瘟病毒已在我国出现三年多的时间，有研究证明已经出现了自然变异毒株，只检测b646l基因无法区分毒株是否存在基因缺失和毒株的基因型，因此，本发明结合荧光定量pcr方法的敏感性高和多通道的优点，建立一种能够同时区分asfv野毒株的基因型和基因缺失株的多重荧光定量pcr方法，实现了asfv的鉴别诊断，对临床的防控有很强的指导意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种能够同时区分基因ⅰ/ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qpcr检测引物探针组和试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、成本低等特点，在鉴别asfv野毒株的基因型的同时区分野毒株与基因缺失株，为有效防控asf提供了新的途径。
6.本发明是通过以下的技术方案实现的：
7.能够同时区分基因ⅰ/ⅱ型非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的四重qpcr检测引物探针组包括4组引物探针组合，具体序列如下：
8.组合1包括以下引物：
9.b646l-f:ttactactgcgaataccccg(seq id no:1)
10.b646l-r:ttccctccaccgatacctc(seq id no:2)
11.探针b646l-p：cy5-acgactttatgaaaacgtaagattcgatgt-bhq3(seq id no:9)
12.扩增产物的核苷酸序列：
13.ttactactgcgaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattccctagacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaaatgactggatataagcacttggttggccaggaggtatcggtggagggaa
14.组合2包括以下引物：
[0015]ⅰ型-ep402r-f:ttgtgagtggattaataataggt(seq id no:3)
[0016]ⅰ型-ep402r-r:agtggtgtcatcgtgagaaa(seq id no:4)
[0017]
探针ⅰ型-ep402r-p：fam-caatcatatctgtattatctatacgaag-mgb(seq id no:10)
[0018]
扩增产物的核苷酸序列：
[0019]
ttgtgagtggattaataataggtatttttatttcaatcatatctgtattatctatacgaagaaaaagaaaaaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccaccctctgaatctaatgaagaagatatttctcacgatgacaccact
[0020]
组合3包括以下引物：
[0021]ⅱ型-ep402r-f:gaaaagcaggtaacttttgtg(seq id no:5)
[0022]ⅱ型-ep402r-r:tatatgtgatatttgggggag(seq id no:6)
[0023]
探针ⅱ型-ep402r-p：vic-atttgatacaacatatcaagtagtatgg-mgb(seq id no:11)
[0024]
扩增产物的核苷酸序列：
[0025]
gaaaagcaggtaacttttgtgaatgttctaattatagtacatcaatatataatataacaaataattgtagcttaactatttttcctcataatgatgtatttgatacaacatatcaagtagtatggaatcaaataattaattatacaataaaattattaacacctgctactcccccaaatatcacatata
[0026]
组合4包括以下引物：
[0027]
mgf_360-13l-f:gcaacatcaaccaagctatgc(seq id no:7)
[0028]
mgf_360-13l-r:tggcaaggaagcatctga(seq id no:8)
[0029]
探针mgf_360-13l-p：cy5-5-atgcctttgaagagggtcgtgcc-bhq3(seq id no:12)
[0030]
扩增产物的核苷酸序列：
[0031]
gcaacatcaaccaagctatgcttacttcagtacaatattataacatcggtaatatatttttctgtatagatttgggtggtaatgcctttgaagagggtcgtgccatagcggaacaaaaaggttataattttctgagccatagtttggctttggatatttacagctcagatgcttccttgcca
[0032]
所述组合1、2、3、4的引物探针分别是用于检测asfv的b646l基因、基因ⅰ型asfv的ep402r基因、基因ⅱ型asfv的ep402r基因和mgf_360-13l基因。
[0033]
所述的引物探针组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，用于区分基因ⅰ型和ⅱ型非洲猪瘟病毒并对野毒株和ep402r基因、mgf_360-13l基因缺失毒株进行鉴定，所述检测试剂盒是四重qpcr试剂盒。
[0034]
本发明进一步提供一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，所述试剂盒含有以上所述的引物探针组。
[0035]
进一步地，所述试剂盒还含有qpcr扩增反应试剂、阴性对照和阳性对照标准品。
[0036]
本发明还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：
[0037]
(1)样品处理：对血液、拭子、组织等样品进行预处理，通过dna提取试剂盒提取核酸；
[0038]
(2)用以上所述的引物探针组配置扩增反应液，用提取的核酸作为模板进行四重
qpcr反应；
[0039]
(3)收集四个通道的荧光信号并进行结果判定。
[0040]
优选地，所述反应体系总体积为25μl，包括模板5μl，反应试剂12.5μl，3对引物b646l-f/r(20μm)、ⅰ型-ep402r-f/r(20μm)、ⅱ型-ep402r-f/r(20μm)各0.5μl，1对引物mgf_360-13l-f/r(50μm)0.2μl，3条探针b646l-p(10μm)、ⅰ型-ep402r-p(10μm)、mgf_360-13l-p(10μm)各1μl，1条探针ⅱ型-ep402r-p(10μm)0.75μl，去离子水0.35μl。
[0041]
优选地，所述四重qpcr反应的程序为50℃2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火40s，40个循环。
[0042]
本发明通过荧光定量pcr仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的ct值并进行结果判定，当cy5、fam、cy5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因ⅰ型野毒株；当cy5、vic、cy5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因ⅱ型野毒株；当cy5、cy5-5两个通道均有扩增曲线时说明为缺失ep402r基因毒株；当cy5、fam两个通道均有扩增曲线时说明为缺失mgf_360-13l的基因ⅰ型毒株；当cy5、vic两个通道均有扩增曲线时说明为缺失mgf_360-13l的基因ⅱ型毒株；当只有cy5一个通道有扩增曲线时说明为缺失ep402r基因和mgf_360-13l的基因双缺毒株。
[0043]
该方法既可用于非洲猪瘟的疾病诊断，又能用于以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒实验室筛查鉴定。
[0044]
本发明的有益效果是：
[0045]
目前流行的asfv毒株中不仅有野生型和基因缺失型毒株，还存在基因ⅰ型和ⅱ型毒株，所以在检测时不仅需要鉴定出阴阳性，还需要同时对毒株进行鉴别是否存在基因缺失和基因型，以便进行溯源，并且基因缺失毒株一般对猪只的致病力较弱，在临床中不易被发现，对于野毒株和缺失毒株需要采取不同的防控措施。还需要同时对毒株进行鉴别，以采取不同的防控措施。所以本发明针对asfv的b646l基因、基因ⅰ型和ⅱ型的ep402r基因及mgf_360-13l基因设计了四组特异性引物和探针，建立了多重qpcr检测方法，能够一次qpcr扩增即可鉴别出asfv毒株是否存在基因缺失和野毒株的基因型，并且本发明检测方法的检测下限为b646l基因12copies/μl、基因i型ep402r基因39copies/μl、基因ii型ep402r基因110copies/μl和mgf_360-13l基因40copies/μl，与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种猪源无交叉反应，组内组间变异系数均小于5％。本发明具有快速、特异、准确的优点，可以为asfv不同毒株的鉴别提供技术手段。
附图说明
[0046]
图1：另一种引物探针组对混合质粒的扩增曲线。
[0047]
图2：ⅰ型-ep402r的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/l，探针终浓度为0.5μmol/l。
[0048]
图3：ⅱ型-ep402r的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/l，探针终浓度为0.3μmol/l。
[0049]
图4：b646l的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μmol/l，探针终浓度为0.4μmol/l。
[0050]
图5：mgf_360-13l的引物、探针浓度优化试验结果。优化后的引物终浓度为0.4μ
mol/l，探针终浓度为0.4μmol/l。
具体实施方式
[0051]
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0052]
实施例1引物和探针设计
[0053]
选取ncbi的genbank数据库中已公布的非洲猪瘟病毒(asfv)的b646l基因、ep402r基因、mgf_360-13l基因的高度保守且具有特异性的区域，并对基因ⅰ型和ⅱ型毒株的ep402r基因进行差异分析，最终设计了四组针对4个基因的引物探针组合。特别需要说明的是由于基因i型和ii型的ep402r基因存在差异的区域的gc含量较低，对于引物探针设计的要求较高，申请人筛选出扩增良好且能够区分基因i型和ii型的引物，相互无交叉反应，同时对探针的淬灭基团使用mgb基团，能够提高探针的溶解温度和识别模板的特异性。
[0054]
组合1包括以下引物：
[0055]
b646l-f:ttactactgcgaataccccg
[0056]
b646l-r:ttccctccaccgatacctc
[0057]
探针b646l-p：cy5-acgactttatgaaaacgtaagattcgatgt-bhq3
[0058]
组合2包括以下引物：
[0059]ⅰ型-ep402r-f:ttgtgagtggattaataataggt
[0060]ⅰ型-ep402r-r:agtggtgtcatcgtgagaaa
[0061]
探针ⅰ型-ep402r-p：fam-caatcatatctgtattatctatacgaag-mgb
[0062]
组合3包括以下引物：
[0063]ⅱ型-ep402r-f:gaaaagcaggtaacttttgtg
[0064]ⅱ型-ep402r-r:tatatgtgatatttgggggag
[0065]
探针ⅱ型-ep402r-p：vic-atttgatacaacatatcaagtagtatgg-mgb
[0066]
组合4包括以下引物：
[0067]
mgf_360-13l-f:gcaacatcaaccaagctatgc
[0068]
mgf_360-13l-r:tggcaaggaagcatctga
[0069]
探针mgf_360-13l-p：cy5-5-atgcctttgaagagggtcgtgcc-bhq3
[0070]
另外，在设计第4组引物时，申请人还参考了cn 113122654a的mgf360-13l基因qpcr引物和探针，即
[0071]
mgf_360-13l-f：tcctctagtttctttgg
[0072]
mgf_360-13l-r：tcgtgtggcattaataatag
[0073]
探针mgf_360-13l-p：cy5-5-caactctcggatgtgcttcgtattg-bhq3
[0074]
扩增曲线见图1，结果发现该引物会与另外三组引物探针发生非特异性反应。
[0075]
实施例2检测条件优化
[0076]
1.标准质粒的制备：
[0077]
针对asfv的b646l基因、基因i型的ep402r基因、基因ii型的ep402r基因和mgf_360-13l基因设计引物，以asfv的dna为模板进行扩增，回收扩增产物，将纯化的扩增产物克隆至pmd18-t载体中，转化到dh5α感受态细胞，阳性克隆体在37℃下培养18～20h，提取质粒
后进行pcr和测序鉴定。鉴定成功后将它们作为阳性标准品，并且分别命名为pasfv-b646l、pasfv-i型-ep402r、pasfv
‑ⅱ
型-ep402r和pasfv-mgf_360-13l，用仪器测定质粒浓度并换算为拷贝数(copies/μl)，pasfv-b646l、pasfv-i型-ep402r、pasfv
‑ⅱ
型-ep402r和pasfv-mgf_360-13l标准质粒的拷贝数分别为1.23
×
10
10
copies/μl、3.89
×
10
10
copies/μl、4.42
×
10
10
copies/μl和3.96
×
10
10
copies/μl。
[0078]
2.引物探针的浓度和退火温度的优化：
[0079]
利用矩阵法对引物浓度和探针浓度进行优化，使引物终浓度为0.2/0.3/0.4/0.5/0.6/0.7μmol/l、探针终浓度为0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/0.6μmol/l，摸索最佳浓度；退火温度采用55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃；循环数采用40次；反应总体系采用25μl，确定后得到所述的反应液和反应程序。
[0080]
试验结果：4对引物的终浓度为0.4μmol/l；探针b646l-p的终浓度为0.4μmol/l、探针ⅰ型-ep402r-p的终浓度为0.5μmol/l、探针ⅱ型-ep402r-p的终浓度为0.3μmol/l、探针mgf_360-13l-p的终浓度为0.4μmol/l(图2-5)。退火温度优选57℃。
[0081]
实施例3检测效果验证
[0082]
1.敏感性试验：
[0083]
将制备的四个标准质粒按照107、106、105、104、103、102、50、25、10、1copies/μl进行梯度稀释，作为模板，使用优化好的反应液和反应程序进行扩增，得到四个标准质粒的扩增曲线，结果显示为b646l基因的检测下限为12copies/μl、基因i型ep402r基因的检测下限为39copies/μl、基因ii型ep402r基因的检测下限为110copies/μl、mgf_360-13l基因的检测下限为40copies/μl。
[0084]
2.特异性实验：
[0085]
使用该方法同时扩增实验室保存的csfv(猪瘟病毒)、prrsv(猪蓝耳病毒)、prv(猪伪狂犬病毒)、pcv2(圆环病毒ⅱ型)、pcv3(猪圆环病毒3型)、ped(猪流行性腹泻病毒)共6种常见猪源病毒阳性核酸，结果为均无扩增曲线和ct值，具有较强的特异性。
[0086]
3.标准质粒的标准曲线的绘制：
[0087]
将制备的四个标准质粒按照107、106、105、104、103、102、10copies/μl进行梯度稀释，作为模板，使用优化好的反应液和反应程序进行扩增，得到四个基因的标准曲线，其中b646l基因的标准曲线为y＝-3.306x+38.421,e＝100.7％,r2＝0.999；基因i型ep402r基因的标准曲线为y＝-3.472x+40.292,e＝94.1％，r2＝0.998；基因ii型ep402r基因的标准曲线为y＝-3.281x+38.575,e＝101.7％，r2＝1.000；mgf_360-13l基因的标准曲线为y＝-3.355x+38.856,e＝98.6％，r2＝0.999。
[0088]
4.重复性实验：
[0089]
将106、105、104copies/μl的质粒作为标准模板进行组内、组间重复实验，计算组内、组间变异系数。得出组内组间的变异系数均小于5％，说明重复性良好。
[0090]
表1重复性实验结果
[0091][0092]

技术特征：
1.一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，其特征在于：包括用于检测非洲猪瘟病毒b646l基因的特异性引物对和探针、用于检测ⅰ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性引物对和探针、用于检测ⅱ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性引物对和探针、用于检测非洲猪瘟病毒mgf_360-13l基因的特异性引物对和探针，其中，用于检测非洲猪瘟病毒b646l基因的特异性引物对的核苷酸序列如seq id no:1-2所示；用于检测ⅰ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性引物对的核苷酸序列如seq idno:3-4所示；用于检测ⅱ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性引物对的核苷酸序列如seq idno:5-6所示；用于检测非洲猪瘟病毒mgf_360-13l基因的特异性引物对的核苷酸序列如seq idno:7-8所示。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：用于检测非洲猪瘟病毒b646l基因的特异性探针的核苷酸序列如seq id no:9所示；用于检测ⅰ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性探针的核苷酸序列如seq id no:10所示；用于检测ⅱ型非洲猪瘟病毒ep402r基因的特异性探针的核苷酸序列如seq id no:11所示、用于检测非洲猪瘟病毒mgf_360-13l基因的特异性探针的核苷酸序列如seq id no:12所示。3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于：所述探针的5
′
端修饰有报告基团，所述报告基团为cy5、fam、vic或cy5-5；所述探针的3
′
端修饰有淬灭基团，所述淬灭基团为bhq3或mgb。4.权利要求1-3任一项所述的引物探针组在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，用于区分基因ⅰ型和ⅱ型非洲猪瘟病毒并对野毒株和ep402r基因、mgf_360-13l基因缺失毒株进行鉴定，所述检测试剂盒是四重qpcr试剂盒。5.一种非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任意一项所述的引物探针组。6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有qpcr扩增反应试剂、阴性对照和阳性对照标准品。7.一种非诊断目的检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)对样品进行预处理，通过dna提取试剂盒提取核酸；(2)用权利要求1-3任一项所述的引物探针组配制扩增反应液，用提取的核酸作为模板进行四重qpcr反应；(3)收集四个通道的荧光信号并进行结果判定。8.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述反应体系总体积为25μl，包括模板5μl，反应试剂12.5μl，3对引物b646l-f/r(20μm)、ⅰ型-ep402r-f/r(20μm)、ⅱ型-ep402r-f/r(20μm)各0.5μl，1对引物mgf_360-13l-f/r(50μm)0.2μl，3条探针b646l-p(10μm)、ⅰ型-ep402r-p(10μm)、mgf_360-13l-p(10μm)各1μl，1条探针ⅱ型-ep402r-p(10μm)0.75μl，去离子水0.35μl。9.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：所述四重qpcr反应的程序为50℃2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，57℃退火40s，40个循环。
10.如权利要求7所述检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于：通过荧光定量pcr仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的ct值并进行结果判定，当cy5、fam、cy5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因ⅰ型野毒株；当cy5、vic、cy5-5三个通道均有扩增曲线时说明为无基因缺失的基因ⅱ型野毒株；当cy5、cy5-5两个通道均有扩增曲线时说明为缺失ep402r基因毒株；当cy5、fam两个通道均有扩增曲线时说明为缺失mgf_360-13l的基因ⅰ型毒株；当cy5、vic两个通道均有扩增曲线时说明为缺失mgf_360-13l的基因ⅱ型毒株；当只有cy5一个通道有扩增曲线时说明为缺失ep402r基因和mgf_360-13l的基因双缺毒株。

技术总结
本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的引物探针组，包括用于检测非洲猪瘟病毒B646L基因、Ⅰ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、Ⅱ型非洲猪瘟病毒EP402R基因、非洲猪瘟病毒MGF_360-13L基因的特异性引物对和探针，所述引物和探针核苷酸序列如SEQ IDNO：1-12所示。本发明仅需一次qPCR扩增即可鉴别出ASFV毒株是否存在基因缺失和野毒株的基因型，具有效率高、成本低和检测时间短等优点，对于临床样品的检测及临床防控有较大的指导意义。控有较大的指导意义。控有较大的指导意义。


技术研发人员：何启盖 李栋凡 于学祥
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.02.15
技术公布日：2023/7/20