用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用的制作方法

用于检测新型冠状病毒及omicron变异株分型的试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒及omicron变异株分型的试剂盒及应用。


背景技术：

2.自2019年12月新冠疫情暴发以来，世界卫生组织(world health organization,who)公布需要关注(voc)和需要留意(voi)的sars-cov2病毒变异株的相关信息，受到全球广泛关注。当前sars-cov-2变体的全球流行病学特点是omicron变体在全球占主导地位，delta是另一种重要的流行变体。
3.2021年11月，who将南非报告的一种快速传播的sars-cov2病毒新变异株，列为需要关注的新冠变种，并命名为omicron。与alpha、beta、gamma、delta相比，omicron的刺突蛋白(spike protein，s蛋白)部分有超过30个变异点，全基因组则有大约50个变异位点。相比之下，beta变异株在rbd区域有3个突变(k417n、e484k、n501y)，而delta变异株在同一区域只有2个(l452r、t478k)。奥密克戎变异株同时具有前4个voc变异株alpha(阿尔法)、beta(贝塔)、gamma(伽玛)和delta(德尔塔)刺突蛋白的重要氨基酸突变位点，包括增强细胞受体亲和力、病毒复制能力和免疫逃逸能力的突变位点，导致其具有极强的传播能力和降低部分抗体药物的保护效力。
4.新冠病毒变异株omicron在其早期阶段的传染性比德尔塔变异株强4.2倍。研究表明，omicron变异株在支气管中的感染和繁殖速度比德尔塔变异株以及新冠原始毒株快70倍。传播能力更强，症状不典型，传播过程更为隐蔽。omicron变异株在人肺部的感染显著低于新冠原始毒株，而肺部感染是导致疾病严重程度的关键，因此感染omicron变异株的患者，主要以轻型和普通型为主，症状包括肌肉酸疼、疲倦，并伴有轻微咳嗽。
5.美国莫德纳(moderna)，在其官网发布了改良版二价新冠候选疫苗mrna-1273.214加强针对奥密克戎有着优异的中和效果，作为加强针可提供相比正常2针疫苗8倍的中和抗体。它的抗原混合了原始sars-cov-2毒株、奥密克戎毒株制成的，覆盖新冠病毒s蛋白的32个突变。
6.5月10日，腾盛博药官方微信号公布了旗下新冠特效药的最新进展。新的研究数据表明，腾盛博药的长效新冠中和抗体安巴韦单抗和罗米司韦单抗联合疗法对新冠病毒奥密克戎ba.2亚型变异株保持中和活性。一对抗体联合疗法紧急使用授权(eua)申请正在由美国食品和药品管理局(简称“美国fda”)进行审核。
7.现有的新冠病毒核酸检测试剂不能做到对omicron进行分型检测，可能存在漏检风险，开发一种能够准确检测omicron变异株分型的试剂盒，对于疫情防控和治疗措施具有非常重要的意义。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒及omicron变异株分型的试剂盒及应用。
9.本发明的目的在于提供一种基于多重荧光定量pcr法用于新型冠状病毒检测，并结合末端阻滞扩增技术(arms-pcr)用于omicron变异株分型检测的试剂盒和方法。
10.本发明根据人基因组内标片段(seq id no.25)、新冠病毒orf1ab基因(seq id no.26)和或n基因保守区域(seq id no.27)、新型冠状病毒omicron变异株s蛋白突变位点e484a(seq id no.28)、n679k(seq id no.29)、s704l(seq id no.30)、l452r(seq id no.31)和n基因的特异性突变位点p151s(seq id no.32)，分别设计特异性扩增引物和taqman探针。通过新冠病毒orf1ab基因和或n基因的阴阳性来判断是否检测到新型冠状病毒，并利用突变位点与orf1ab基因之间的δct值的差值来实现对新型冠状病毒omicron变异株的分型。同时，本发明设置了内标，内标为人核糖核酸酶p(rnasep)，可有效避免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。
11.本发明提供一种基于多重pcr检测新型冠状病毒及omicron变异株分型的引物探针组，包括检测新型冠状病毒omicron变异株s蛋白特异性突变位点和n基因特异性突变位点的引物和探针组；
12.所述新型冠状病毒omicron变异株s蛋白特异性突变位点包括e484a突变位点、n679k突变位点、s704l突变位点、l452r突变位点和n基因特异性突变位点p151s中的至少两种；
13.用于检测e484a突变位点的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；
14.用于检测n679k突变位点的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；
15.用于检测s704l突变位点的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；
16.用于检测l452r突变位点的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；
17.用于检测p151s突变位点的引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示；
18.用于检测e484a突变位点的探针序列如seq id no.17所示；
19.用于检测n679k突变位点的探针序列如seq id no.18所示；
20.用于检测s704l突变位点的探针序列如seq id no.19所示；
21.用于检测l452r突变位点的探针序列如seq id no.20所示；
22.用于检测p151s突变位点的探针序列如seq id no.21所示。
23.所述引物探针组还包括检测orf1ab基因保守序列seq id no.26所示的序列的引物探针组：
24.用于检测新冠病毒orf1ab基因的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；
25.用于检测新冠病毒orf1ab基因的探针序列如seq id no.22所示。
26.所述引物探针组还包括检测人内参性基因rnasep的引物探针组：
27.用于检测rnasep的引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示；
28.用于检测rnasep的探针序列如seq id no.23所示。
29.所述引物探针组还包括检测n基因保守序列的引物探针组：
30.用于检测n基因保守序列的引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示；
31.用于检测n基因保守序列的探针序列如seq id no.24所示。
id no.28所示、n679k如seq id no.29所示、s704l如seq id no.30所示、l452r如seq id no.31所示、p151s如seq id no.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示的基因。
60.本发明所述特异性探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5或cy5中的任意一种或几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl和mgb中的任意一种或几种。
61.arms法(扩增受阻突变系统)是将特异性突变位点置于引物的3’端，利用耐热taq dna聚合酶缺乏3’至5’核酸外切酶活性，在引物与模板互补配对过程中，若3’端碱基对形成错配，链延伸会受阻，其扩增结果为：野生型模板扩增受阻，对突变型模板有效扩增。引物的3’端倒数第二或三位碱基可以人为进行序列突变，以保证引物与野生型序列在3’端具有两个碱基不匹配，以提高靶标扩增的特异性。
62.所述酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶、udg酶。
63.所述阳性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示、orf1ab基因如seq id no.26所示和/或n基因保守区域部分片段如seq id no.27所示、以及e484a如seq id no.28所示、n679k如seq id no.29所示、s704l如seq id no.30所示、缺乏l452r如seq id no.31所示、p151s如seq id no.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示的基因。
64.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
65.1)本发明用于新型冠状病毒检测及omicron变异株分型的引物及探针组合物，采用多重荧光定量pcr法结合末端阻滞扩增技术(arms-pcr)，能够同时检测多个位点的突变情况，实现快速精准的目标。
66.2)本发明设置了人基因组内标片段、新冠病毒orf1ab基因和或n基因保守区域，以及s基因突变位点与n基因突变位点，一次性测试完成新冠病毒检测及变异位点分析，同时，采用突变位点与orf1ab基因之间的δct值的差值来判断位点阴阳性，避免因病毒浓度差异导致的判断错误。
67.3)本发明采用的2个突变位点e484a,n679k均为omicron特有，进一步提高了检测特异性；omicron变异株的两个亚型ba.4和ba.5同时拥有s基因l452r突变位点，可与omicron其它亚型进行区分。n基因p151s位点为ba.4亚型所特有，可与ba.5进行区分。s基因s704l位点为ba.2.12.1亚型所特有，可与其它亚型进行鉴别。
68.4)本发明的关键之处在于所开发的试剂盒能够检测新型冠状病毒同时对omicron变异株进行分型检测，而现有技术只能检测新型冠状病毒和omicron变异株，不能对omicron变异株进行分型检测，因而无法对疫情防控工作起到风险提示的作用，而本技术通过新型冠状病毒s基因l452r、s704l突变位点和n基因p151s突变位点，解决了对omicron变异株ba.4、ba.5、ba.2.12.1亚型分型的问题。
附图说明
69.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
70.图1为新型冠状病毒omicron ba.4变异株的扩增曲线示意；
71.图2为新型冠状病毒omicron ba.5变异株的扩增曲线示意图；
72.图3为新型冠状病毒omicron ba.2.12.1变异株的扩增曲线示意图；
73.图4为新型冠状病毒omicron变异株其它亚型的扩增曲线示意图；
74.图5为新型冠状病毒omicron变异株ba.2亚型、ba.2.12.1亚型、ba.4亚型、ba.5亚型、alpha变异株、beta变异株、gamma变异株、delta变异株、zeta变异株、kappa变异株、mu变异株、lambda变异株s基因上突变频率90％以上的突变位点汇总；
75.图6为新型冠状病毒omicron变异株ba.2亚型、ba.2.12.1亚型、ba.4亚型、ba.5亚型、alpha变异株、beta变异株、gamma变异株、delta变异株、zeta变异株、kappa变异株、mu变异株、lambda变异株n基因上突变频率90％以上的突变位点汇总。
具体实施方式
76.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
77.本发明提供一种对新型冠状病毒检测及omicron变异株分型的检测方法，具体包括如下步骤：
78.(1)待测样本dna的提取：样本核酸提取采用qiagen公司的viral rna mini kit试剂盒，制备样本核酸rna体积60μl。
79.(2)配制试剂反应体系为50μl，反应体系组成如表1所示：
80.表1反应体系
[0081][0082][0083]
(3)设置荧光pcr扩增程序
[0084]
rt-pcr扩增程序的设定如表2
[0085]
表2 rt-pcr扩增程序的设置
[0086][0087]
(4)结果判读：
[0088]
阴阳性判定：
[0089]
扩增曲线呈s形且ct值≤40.0，判定为阳性；ct＞40.0或者未检出，判定为阴性。
[0090]
突变位点判定：
[0091]
某样品x突变位点的δct，等于它的突变位点检测反应(mx)的ct值减去同一管内orf1ab反应的ct值：δct(x)＝ct(mx)-ct(orf1ab)，δct可以为负数。本试剂盒e484a、n679k、s704l、l452r、p151s突变位点的参考值(cut-offδct)如表3：
[0092]
表3各突变位点的参考值
[0093]
突变类型e484an679kl452rs704lp151scut-offδct8.08.08.08.06.0
[0094]
当阴性对照检测结果为阴性且阳性对照检测结果为阳性时，样本检测结果的分析如下表4：
[0095]
表4各突变位点的判读
[0096][0097][0098]
样本检测结果的判定：
[0099]
根据以下位点判读结果，进行新型冠状病毒omicron变异株分型。
[0100]
表5新型冠状病毒omicron变异株分型
[0101][0102]
实施例1新型冠状病毒omicron变异株检测的特异性引物和探针的设计
[0103]
针对omicron变异株分型的特异性突变位点进行分析并且筛选。针对voc(alpha、beta、gamma、delta、omicron)变异株、voi(lambda、mu)变异株和omicron变异株的3个亚型ba.2.12.1、ba.4、ba.5的序列进行生物信息学比对分析，分析结果为e484a、n679k位点为omicron所特有的突变，突变频率分别在92.7％、99.4％，可与其它voc/voi变异株进行有效区分。omicron变异株的两个亚型ba.4和ba.5同时拥有s基因l452r突变位点，突变频率可达95％以上，可与omicron其它亚型进行区分。n基因p151s位点为ba.4亚型所特有，突变频率为100％，可与ba.5进行区分。s基因s704l位点为ba.2.12.1亚型所特有，突变频率为97.9％，可与其它亚型进行鉴别。
[0104]
表6 e484a、n679k、s704l、l452r、p151s突变位点在各变异株中的突变频率
[0105][0106][0107]
针对新型冠状病毒omicron变异株s蛋白突变位点e484a、n679k、s704l、l452r和n基因上的p151s突变位点、orf1ab基因以及rnasep基因，利用primer 5软件，分别设计上述突变位点的特异性扩增引物和taqman探针，由上海硕颖生物科技有限公司合成。
[0108]
各突变位点与orf1ab基因、n基因以及rnasep基因的扩增序列如下：
[0109]
rnasep基因片段seq id no.25
[0110]
gaattcggcacgaggtgggacttcagcatggcggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttgttgctatcaatcatatcgttgactttaaggaaaagaaacaggaaattgaaaaaccagtagctgtttctgaactcttcacaactttgccaattgtacagggaaaatcaagaccaattaaaattttaactagattaacaattattgtctcggatccatctcactgcaatgttttgaga
[0111]
orf1ab基因片段seq id no.26
[0112]
atcgtgttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaatcctaaaggattttgtgacttaaaaggtaagtatgtacaaatacctacaacttgtgctaatgaccctgtgggttttacacttaaaaacacagtctgtaccgtctgcggtatgtggaaaggttatggctgtagttgtgatcaactccgcgaacccatgcttcagtcagctgatgcacaatcgtt
[0113]
tttaaacgggtttgcggtgtaagtgcagcccgtcttacaccgtgcggcacaggca
[0114]
ctagtactgatgtcgtatacagggcttttgacatctacaatgataaagtagctggtt
[0115]
ttgctaaattcctaaaaactaattgttgtcgcttccaagaaaaggacgaagatgac
[0116]
aatttaattgattcttactttgtagttaagagacacactttctctaactaccaacat
[0117]
gaagaaacaatttataatttacttaaggattgtccagctgttgctaaacatn基因片段seq id no.27
[0118]
caacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagc
[0119]
ctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcag
[0120]
acgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagaca
[0121]
aggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcag
[0122]
cgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttg
[0123]
acctacacaggtgccatcaaattge484a特异性片段seq id no.28
[0124]
aggctgcgttatagcttggaattctaacaagcttgattctaaggttggtggtaatta
[0125]
taattaccagtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatat
[0126]
ttcaactgaaatctatcaggccggtaacaaaccttgtaatggtgttgcaggtttta
[0127]
attgttactttcctttacgatcatatggtttccgacccacttatggtgttggtcacca
[0128]
accatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttg
[0129]
tggacctaaaaagtcn679k特异性片段seq id no.29
[0130]
actcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggc
[0131]
tgtttaataggggctgaatatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggt
[0132]
gcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaagtctcatcggcgggcacgtag
[0133]
tgtagctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaatttagt
[0134]
tgcttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccaca
[0135]
gaaattctaccagtgs704l特异性片段seq id no.30
[0136]
ttaataggggctgaatatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgca
[0137]
ggtatatgcgctagttatcagactcagactaagtctcatcggcgggcacgtagtgt
[0138]
agctagtcaatccatcattgcctacactatgtcacttggtgcagaaaatttagttgc
[0139]
ttactctaataactctattgccatacccacaaattttactattagtgttaccacagaa
[0140]
attctaccagtgtctatgaccaagacatcagtagattgtacaatgtacatttgtggt
[0141]
gattcaactgaatgcl452r特异性片段seq id no.31
[0142]
ttgtaattagaggtaatgaagtcagccaaatcgctccagggcaaactggaaatatt
[0143]
gctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaatt
[0144]
ctaacaancttgattctaaggttggtggtaattataattaccggtatagattgtttag
[0145]
gaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccg
[0146]
gtaacaaaccttgtaatggtgttgcaggtgttaattgttactttcctttacaatcata
[0147]
tggtttccgacccap151s特异性片段seq id no.32
[0148]
aaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccaga
[0149]
agctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagg
[0150]
gagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaattctgctaacaatgct
[0151]
gcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcag
[0152]
aagggagcagagncggnagncaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaa
[0153]
cagttcaagaaattcaactcca
[0154]
用于检测突变位点e484a、n679k、s704l、l452r和n基因上的p151s突变位点、orf1ab基因、n基因以及rnasep基因的引物及探针序列如表7所示：
[0155]
表7引物及探针序列信息
[0156]
[0157][0158]
实施例2检测新型冠状病毒(2019-ncov)并进行omicron变异株分型的方法
[0159]
(1)临床样本采集、保存及运输：适用于咽拭子、鼻咽拭子、痰液样本类型。
[0160]
咽拭子：将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
[0161]
鼻咽拭子：将1根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子轻轻插入鼻道鼻咽腔后壁时，停留片刻后缓慢转动退出。取另一根聚丙烯纤维头拭子以同样的方法采集另一侧鼻孔。上述两根拭子浸入同一含3ml病毒保存液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。痰液：将咳出的痰液收集于含病毒保存液的50ml螺口塑料管或者痰盒中。痰液样本加入等体积的痰消化液(含1g/l蛋白酶k的磷酸盐缓冲液)，振荡混匀，静置5分钟消化后进行核酸提取。经消化后的痰液样本可以当做常规拭子样本进行后续处理。用于病毒分离和核酸检测的样本应尽快进行检测，能在24小时内检测的样本可置于4℃保存；24小时内无法检测的样本则应置于-70℃或以下保
存(如无-70℃保存条件，则于-20℃冰箱暂存)。样本冻融不可超过5次，否则影响检测结果。
[0162]
(2)核酸提取：样本核酸提取采用qiagen公司的viral rna mini kit试剂盒，按照说明书进行核酸提取。阳性质控品、阴性质控品均需要进行提取。
[0163]
(3)反应体系配制：计算需准备反应试剂反应数(n＝样本数+2管对照)，分别使用检测液a和检测液b各配制n份反应液，即每个样本2管检测。每测试反应体系配制如下：
[0164]
表8反应体系配制
[0165]
反应体系加量(μl)/人份检测液a/检测液b27酶混合液3样本核酸20总体积50
[0166]
所述检测液a包括pcr缓冲液、3.3mm mgcl2、0.1-0.4mm dntps(datp：dttp：dctp：dgtp：dutp＝1:1:1:1:1)、引物探针(seq id no.1、seq id no.3、seq id no.11、seq id no.13的浓度为0.4μm；seq id no.2、seq id no.4、seq id no.12、seq id no.14的浓度为0.04μm；seq id no.17、seq id no.18、seq id no.22、seq id no.23的浓度均为0.2μm)及去rna酶水。
[0167]
所述检测液b包括pcr缓冲液、3.3mm mgcl2、0.1-0.4mm dntps(datp：dttp：dctp：dgtp：dutp＝1:1:1:1:1)、引物探针(seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11的浓度为0.4μm；seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12的浓度为0.04μm；seq id no.19、seq id no.20、seq id no.21、seq id no.22的浓度均为0.2μm)及去rna酶水。
[0168]
酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶、udg酶。
[0169]
阳性对照为人工合成含rnasep基因片段、orf1ab基因和或n基因保守区域部分片断以及e484a、n679k、s704l、l452r、p151s突变位点的基因片段，阴性对照为含rnasep基因片段的人工合成的基因。
[0170]
(4)加样：向已分装有试剂的pcr反应管中分别加入提取好的待测样本、阳性对照、阴性对照各20μl，终体积为50μl/管，盖紧管盖，瞬时低速离心。
[0171]
(5)扩增：按照以下程序进行rt-pcr扩增：50℃10min；97℃1min；97℃5s，58℃30s，共进行45个循环。
[0172]
(6)结果分析：根据各荧光通道的扩增曲线图和ct值情况，确定各突变位点的检出情况，各突变位点的判读标准如表9所示。再根据5个突变位点e484a、n679k、s704l、l452r、p151s的突变情况来判断样本中是否存在待检的新型冠状病毒及对omicron变异株进行分型。
[0173]
表9突变位点的结果判读
[0174][0175]
根据以下位点判读结果，进行新型冠状病毒omicron变异株分型。
[0176]
表10新型冠状病毒omicron变异株分型
[0177][0178]
图1为新型冠状病毒omicron ba.4变异株的检测结果；
[0179]
图2为新型冠状病毒omicron ba.5变异株的检测结果；
[0180]
图3为新型冠状病毒omicron ba.2.12.1变异株的检测结果；
[0181]
图4为新型冠状病毒omicron变异株其它亚型的检测结果；
[0182]
图5为新型冠状病毒omicron变异株ba.2亚型、ba.2.12.1亚型、ba.4亚型、ba.5亚型、alpha变异株、beta变异株、gamma变异株、delta变异株、zeta变异株、kappa变异株、mu变异株、lambda变异株s基因上突变频率90％以上的突变位点汇总；
[0183]
图6为新型冠状病毒omicron变异株ba.2亚型、ba.2.12.1亚型、ba.4亚型、ba.5亚型、alpha变异株、beta变异株、gamma变异株、delta变异株、zeta变异株、kappa变异株、mu变异株、lambda变异株n基因上突变频率90％以上的突变位点汇总。
[0184]
实施例3灵敏度分析
[0185]
将含有新型冠状病毒omicron变异株5个突变位点e484a、n679k、s704l、l452r、p151s目的片段的人工合成基因按照2倍倍比梯度稀释，进行20复孔的多重荧光定量pcr扩增分析其检测的最低检测限，检测下限为5
×
102copies/ml。
[0186]
表11检测体系的lod验证
[0187]
检测样本浓度检出情况检出率2000copies/ml20/20100％1000copies/ml20/20100％500copies/ml19/2095％250copies/ml13/2065％
[0188]
实施例4特异性分析
[0189]
采用本发明方法对冠状病毒229e型、冠状病毒oc43型、冠状病毒hku1型、冠状病毒nl63型、sars冠状病毒、mers冠状病毒、甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h3n2、含新型冠状病毒2019-ncov核酸的咽拭子以及人类基因组进行多重荧光定量pcr扩增分析。
[0190]
表12特异性检测结果
[0191]
各类病原体及人基因组检测结果冠状病毒229e型阴性冠状病毒oc43型阴性冠状病毒hku1型阴性冠状病毒nl63型阴性sars冠状病毒阴性mers冠状病毒阴性甲型流感病毒h1n1阴性甲型流感病毒h3n2阴性含新型冠状病毒2019-ncov核酸的咽拭子阴性人类基因组阴性
[0192]
实施例5鉴别检测
[0193]
采用本发明方法对含新型冠状病毒alpha变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒beta变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒gamma变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒delta变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒lambda变异株核酸的咽拭子、含新型冠状病毒mu变异株核酸的咽拭子进行多重荧光定量pcr扩增分析。
[0194]
表13新型冠状病毒各变异株检测结果
[0195][0196][0197]
本发明的试剂盒包括人基因组内标片段、新冠病毒orf1ab基因和n基因保守区域
和5对新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与n基因特异性突变位点的引物和探针，具有较高的识别能力，可以实现对新型冠状病毒进行检测与omicron变异株的准确分型。通过同一反应管内突变位点与orf1ab基因之间的δct值的差值来判断突变位点的阴阳性，避免因病毒浓度差异导致的判断错误。e484a、n679k位点为omicron所特有的突变，突变频率分别在92.7％、99.4％，可与其它voc/voi变异株进行有效区分。omicron变异株的两个亚型ba.4和ba.5同时拥有s基因l452r突变位点，可与omicron其它亚型进行区分。n基因p151s位点为ba.4亚型所特有，可与ba.5进行区分。s基因s704l位点为ba.2.12.1亚型所特有，可与其它亚型进行鉴别。
[0198]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

技术特征：
1.一种基于多重pcr检测新型冠状病毒及omicron变异株分型的引物探针组，其特征在于，包括检测新型冠状病毒omicron变异株s蛋白特异性突变位点和n基因特异性突变位点的引物和探针组；所述新型冠状病毒omicron变异株s蛋白特异性突变位点包括e484a突变位点、n679k突变位点、s704l突变位点、l452r突变位点和n基因特异性突变位点p151s中的至少两种；用于检测e484a突变位点的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；用于检测n679k突变位点的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；用于检测s704l突变位点的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；用于检测l452r突变位点的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；用于检测p151s突变位点的引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示；用于检测e484a突变位点的探针序列如seq id no.17所示；用于检测n679k突变位点的探针序列如seq id no.18所示；用于检测s704l突变位点的探针序列如seq id no.19所示；用于检测l452r突变位点的探针序列如seq id no.20所示；用于检测p151s突变位点的探针序列如seq id no.21所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测orf1ab基因保守序列seq id no.26所示的序列的引物探针组：用于检测新冠病毒orf1ab基因的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；用于检测新冠病毒orf1ab基因的探针序列如seq id no.22所示。3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测人内参性基因rnasep的引物探针组：用于检测rnasep的引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示；用于检测rnasep的探针序列如seq id no.23所示。4.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括检测n基因保守序列的引物探针组：用于检测n基因保守序列的引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示；用于检测n基因保守序列的探针序列如seq id no.24所示。5.一种包括如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组的试剂盒。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测液和酶混合液；所述检测液包括pcr缓冲液、mgcl2、dntps、去rna酶水、以及所述的引物探针组；所述酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶、udg酶。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行检测时采用的新型冠状病毒的样本来源于人鼻咽拭子、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本或粪便样本。8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示、orf1ab基因如seq id no.26所示和/或n基因保守区域部分片段如seq id no.27所示、以及e484a如seq id no.28所示、n679k如seq id no.29所示、s704l如seq id no.30所示、l452r如seq id no.31所示、p151s如seq id no.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示的基因。
9.如权利要求1-4中任意一项所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用。10.一种用于omicron变异株分型的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括检测液a、检测液b、酶混合液、阳性对照、阴性对照；所述检测液a包括pcr缓冲液mgcl2、dntps、去rna酶水以及如下所述的引物和探针组：用于检测e484a突变位点的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；用于检测n679k突变位点的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；用于检测新冠病毒orf1ab基因的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；用于检测rnasep的引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示；用于检测e484a突变位点的探针序列如seq id no.17所示；用于检测n679k突变位点的探针序列如seq id no.18所示；用于检测新冠病毒orf1ab基因的探针序列如seq id no.22所示。用于检测rnasep的探针序列如seq id no.23所示；所述检测液b包括mgcl2、dntps、去rna酶水以及如下所述的引物和探针组：用于检测s704l突变位点的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；用于检测l452r突变位点的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；用于检测p151s突变位点的引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示；用于检测新冠病毒orf1ab基因的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；用于检测s704l突变位点的探针序列如seq id no.19所示；用于检测l452r突变位点的探针序列如seq id no.20所示；用于检测p151s突变位点的探针序列如seq id no.21所示；用于检测新冠病毒orf1ab基因的探针序列如seq id no.22所示；酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶、udg酶；所述阳性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示、orf1ab基因如seq id no.26所示和/或n基因保守区域部分片段如seq id no.27所示、以及e484a如seq id no.28所示、n679k如seq id no.29所示、s704l如seq id no.30所示、l452r如seq id no.31所示、p151s如seq id no.32所示突变位点的基因片段；阴性对照为人工合成含rnasep基因片段如seq id no.25所示的基因。

技术总结
本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用；通过检测新冠病毒ORF1ab基因对新型冠状病毒进行定性检测，对S基因的4个特异性突变位点E484A、N679K、S704L、L452R和N基因特异性突变位点P151S进行检测，从而对Omicron变异株BA.2.12.1、BA.4、BA.5这三种亚型进行鉴别，实现了同时对新型冠状病毒和Omicron变异株分型的检测。的检测。的检测。


技术研发人员：王珊 张蓉 郭玉婉 贺华 黄青红 张少铎 刘中华 王国强
受保护的技术使用者：江苏硕世生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.02.08
技术公布日：2023/7/20