一种降血脂多元益生菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种降血脂多元益生菌及其应用。


背景技术：

2.高脂血症是指由于体内对脂类物质如胆固醇和/或甘油三酯的代谢或转运异常，进而使血浆中脂质含量异常升高至超过正常范围的一种病症，可引起一系列危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病和非酒精性脂肪肝等。
3.益生菌降血脂被广泛研究，已报道的降血脂功能菌株主要有乳杆菌、双歧杆菌以及二代益生菌等。在近来的现有技术中，也逐渐有在单菌株的基础上，通过多菌株的复合来提高降血脂的效果的报道。例如，专利cn202110624178.3中公开了将副干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌共培养后，在体外的胆固醇降解和胆盐水解活性上表现出比单个菌株更佳的效果，但是缺少进一步的体内试验评价；专利cn202010066436.6中公开了将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和两岐双歧杆菌组合后，在高脂饲料饲喂的sd大鼠中，具有降胆固醇和甘油三酯的效果，但是缺少4种菌株组合与单一菌株比较的科学依据。并且包括上述专利在内的诸多降血脂多菌株组合物报道中，不同菌株之间的协同效果不够明显，甚至同一组合物中的不同菌株还存在竞争关系，导致组合物的降血脂效果不佳。因此，如何增强不同菌株之间的降血脂协同效果以及改善不同菌株之间的兼容性是一个难题。
4.另一方面，我们通过对高血脂患者的人体代谢表现发现，通常这些患者的尿酸异常会先于糖脂异常。基于此，若将具有调节尿酸代谢功能的菌株与具有调节血脂代谢功能的菌株进行复配，可能会产生意料不到降血脂效果。然而，在现有技术中，尚未发现有相关报道。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种降血脂多元益生菌及其应用。首先，本发明通过研究发现将特定的三株菌株复配后，在降血脂方面可产生协同作用，可显著强化降血脂功效。其次，本发明益生菌组合物中的各菌株之间不存在竞争抑制作用，反而具有互相促进生长的增殖效果，此外，本发明选用的各菌株无毒副作用，可安全食用，不存在安全性风险。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种降血脂多元益生菌，包括动物双歧杆菌whh2276、鼠李糖乳杆菌whh1155和发酵乳杆菌whh3906。其中：动物双歧杆菌whh2276的保藏号为gdmcc no：62901，保藏日为2022年10月18日，微生物分类命名为动物双歧杆菌乳亚种bifidobacterium animalis subsp.lactis，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号。
7.鼠李糖乳杆菌whh1155的保藏号为cgmcc no：11955，保藏日为2016年1月4日，微生物分类命名为lacticaseibacillus rhannosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.发酵乳杆菌whh3906的保藏号为cgmcc no：19472，保藏日为2020年3月13日，微生物分类命名为limosilactobacillus fermentum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
9.基于本发明的前期研究，本发明通过对高血脂患者的人体代谢表现发现，通常这些患者的尿酸异常会先于糖脂异常。基于此发现，若将具有调节尿酸代谢功能的菌株与具有调节血脂代谢功能的菌株进行复配，可能会产生意料不到降血脂效果。为此，本发明上述益生菌组合物是以具有降血脂功效的动物双歧杆菌whh2276(为未报道的新菌株)为核心菌，再围绕该菌株复配具有降尿酸功能的鼠李糖乳杆菌whh1155(为申请人先前报道的菌株)和发酵乳杆菌whh3906(为申请人先前报道的菌株)。最终本发明通过试验发现，上述多功能菌株可产生协同作用，可以提高降血脂的功能。
10.关于本发明复配后的益生菌协同作用：益生菌菌株间的相互作用是复杂的，可能表现为相互独立(功能叠加)、相互协同、相互竞争或功能抑制。在现有技术所报道的具有降血脂功效的多菌株复合制剂，菌株之间多表现为功能叠加，相互协同作用较弱，或存在菌株食用的安全性风险。而本发明通过体外及动物试验发现，将具有降血脂功能的动物双歧杆菌whh2276与另外2株功能菌株(减肥功能的发酵乳杆菌whh3906和降尿酸功能的鼠李糖乳杆菌whh1155)复配，不同于菌株的简单功能叠加，复配后菌株增殖及降血脂效果可得到协同增强；经过科学研究，确定本发明提供的益生菌组合物菌株之间可充分发挥协同作用，极其显著地强化了降血脂功效。另一方面，本发明选用的各菌株无毒副作用，可安全食用，不存在安全性风险。
11.此外，关于本发明新发现的动物双歧杆菌whh2276，该菌株具有以下特点：(1)本发明动物双歧杆菌乳亚种对于混合型高脂血症大鼠具有有效的降血脂作用。(2)本发明动物双歧杆菌乳亚种具有很强的胆固醇降解能力和高活性的胆盐水解酶。(3)本发明动物双歧杆菌乳亚种可以调节紊乱的肠道菌群，提高肠道中有益菌的丰度。(4)本发明动物双歧杆菌乳亚种来源于健康婴儿粪便，全基因组测序分析发现，该菌株无毒力基因，动物评价无毒副作用，对多种抗生素敏感，相对于目前用于治疗高血脂类的传统药物具有一定的优势。
12.作为优选，本发明多元益生菌中各菌株均以冻干粉形式存在。
13.进一步地，各冻干粉的重量份如下：动物双歧杆菌whh2276为10-15重量份，鼠李糖乳杆菌whh1155为1-4重量份，发酵乳杆菌为1-4重量份。
14.第二方面，本发明提供了上述降血脂多元益生菌在制备可预防或治疗高血脂相关疾病或症状的产品中的用途。
15.作为优选，所述产品为口服制剂。
16.进一步地，所述产品的制剂形式为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。
17.作为优选，所述产品为药品。
18.作为优选，所述产品还包括辅料。
19.与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：(1)本发明多元益生菌以具有降血脂功效的动物双歧杆菌whh2276为核心菌，再围绕该菌株复配具有降尿酸功能的鼠李糖乳杆菌whh1155和发酵乳杆菌whh3906。通过试验发现将上述特定的三株菌复配后，在降血脂方面可产生协同作用，可显著强化降血脂功效，而
若替换为其他同种的菌株，则不具备明显的协同作用。
20.(2)本发明益生菌组合物中的各菌株之间不存在竞争抑制作用，反而具有互相促进生长的增殖效果。
21.(3)本发明选用的各菌株无毒副作用，可安全食用，不存在安全性风险。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
23.总实施例一种降血脂多元益生菌，包括动物双歧杆菌whh2276、鼠李糖乳杆菌whh1155和发酵乳杆菌whh3906。其中：动物双歧杆菌whh2276的保藏号为gdmcc no：62901，保藏日为2022年10月18日，微生物分类命名为动物双歧杆菌乳亚种bifidobacterium animalis subsp.lactis，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号。
24.鼠李糖乳杆菌whh1155的保藏号为cgmcc no：11955，保藏日为2016年1月4日，微生物分类命名为lacticaseibacillus rhannosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
25.发酵乳杆菌whh3906的保藏号为cgmcc no：19472，保藏日为2020年3月13日，微生物分类命名为limosilactobacillus fermentum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
26.作为优选，本发明多元益生菌中各菌株均以冻干粉形式存在。各冻干粉的重量份如下：动物双歧杆菌whh2276为10-15重量份，鼠李糖乳杆菌whh1155为1-4重量份，发酵乳杆菌为1-4重量份。
27.一种含有上述降血脂多元益生菌的可预防或治疗高血脂相关疾病或症状的产品。作为优选，所述产品为口服制剂，进一步地，其制剂形式为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。可选地，该产品还包括辅料，最优选地，该产品为药品。
28.具体实施例以下实施例所涉及的培养基的配制方法如下：mrs-cys培养基(1l)：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，k hpo
2 42g，柠檬酸二铵2g，mgso
2-7ho
2 0.58g，mnso
2-4ho
2 0.25g，无水乙酸钠5g，吐温80 1ml，半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水定容至1l，调ph至6.5，121℃灭菌15min。
29.选取该培养基作为基础培养基，并以此作为空白对照组，实验组则在此基础上将葡萄糖替换为益生菌。
30.实施例1：菌株组合的体外研究益生菌菌株间的互作是复杂的，可能表现为相互协同，功能叠加；相互竞争，功能抑制；也可能相互独立。清晰解构不同菌株间的互作，可以为配方中菌株的组合提供依据。
31.1、将分别具有减肥、降血脂、降血尿酸功能的3株菌株，利用体外共培养系统测试各功能菌株间的生长互作，获得功能菌株的最佳组合。
32.(1)将3株益生菌(发酵乳杆菌whh3906、动物双歧杆菌whh2276，鼠李糖乳杆菌whh1155)以2％接种量，分别接种到10ml的mrs-cys培养基中，37℃，厌氧袋中培养14h。
33.(2)将3株菌根据不同的组合，以等比例接种，总接种量为2％，接种到10ml的培养
基中，37℃，厌氧培养14h。取各培养液，稀释5倍后，检测od
600
值。
34.(3)检测数据显示(表1)，whh2276与另2株菌两两混合培养，培养液的od
600
值均大于单一菌株的培养液，说明whh2276与另外2株益生菌存在生长协同。进一步地，whh2276与whh1155、whh3906的三株菌混合培养液，od
600
大于三株菌单独培养的培养液。结果表明，试验中的3株益生菌，组合在一起时，不存在竞争抑制，而是具有生长协同的效果。
35.表1不同菌株组合培养的培养液od
600
值组别od
600
值whh22760.204
±
0.003whh39060.316
±
0.001whh11550.309
±
0.006whh2276+whh39060.332
±
0.002whh2276+whh11550.326
±
0.003whh2276+whh3906+whh11550.352
±
0.0052、共培养菌株体外降解胆固醇能力，通过培养中添加胆固醇，与菌株共孵育后，检测培养基中胆固醇减少的量，评价菌株直接降解胆固醇的能力。
36.(1)配制含0.1g/l胆固醇的mrs培养基：称取胆固醇0.1g，蔗糖酯0.1g，吐温80 1g，添加5ml冰乙酸后煮沸溶解，添加至煮沸后的mrs培养基中，最终定容至1000ml。4mol/l的naoh调ph至6.2
±
0.2，121℃高温高压蒸汽灭菌15min。
37.(2)按2％(v/v)接种量进行待测菌株的活化，37℃厌氧培养18～24h，传代3次后备用。8,000rpm、4℃离心5min，收获菌体细胞，并重悬于无菌生理盐水中使浓度达到5
×
108cfu/ml(od＝0.5左右)。将菌悬液以2％(v/v)的接种量接种于胆固醇胶束-mrs培养基中，37℃培养48h，4,000rpm、4℃离心5min，获得菌株发酵上清液，备用。同时，以空白胆固醇胶束-mrs培养基作为阴性对照。
38.(3)按gb 5009.128-2016第二法测定上清液中的胆固醇含量，测得结果如表2所示，动物双岐杆菌乳亚种whh2276的胆固醇脱除率达到29.6％，具有很强的胆固醇降解能力；复配上whh3906和whh1155后，胆固醇脱除率进一步提高，达到36.0％。
39.表2.共培养菌株脱除胆固醇的能力组别胆固醇含量mg/l胆固醇脱除率％空白对照79.8/whh227656.229.6whh390669.013.5whh115571.011.0whh2276+whh3906+whh115551.136.03、共培养菌株体外胆盐水解能力，利用菌株的胆盐水解酶，水解结合态胆盐，将其转变为氨基酸和游离胆酸。游离胆酸与cacl2反应，生成白色沉淀。通过白色沉降圈的大小，评价酶活的高低。
40.(1)在mrs液体培养基中添加0.3％脱氧牛磺胆酸钠(tdca)、0.2％巯基乙酸钠(thio)、0.37g/l cacl2和1.6％琼脂。121℃灭菌15min后倾倒入无菌平皿中，厌氧袋中放置48h，备用。
41.(2)将直径9mm无菌滤纸片放在平板上，滴加10μl菌液，待菌液干后再次放入厌氧袋中，37℃培养72h。
42.(3)观察滤纸片周围白色沉淀物圈的大小。结果如表3所示，whh2276所产生的白色沉淀圈直径达到29.5mm，表明动物双岐杆菌乳亚种whh2276具有较强的产胆盐水解酶能力；复配上whh3906和whh1155后，胆盐水解能力进一步提高，产生的白色沉淀圈直径达到31.0mm。
43.表3.共培养菌株体外产胆盐水解酶能力组别沉淀直径/mm空白对照0.00whh227629.5whh390611.5whh115512.0whh2276+whh3906+whh115531.0实施例2：动物双歧杆菌whh2276制剂动物双歧杆菌whh2276制剂的活菌数为5
×
10
10
cfu/g，包括以下成分：动物双歧杆菌whh2276冻干粉和麦芽糊精。其中动物双歧杆菌whh2276冻干粉的质量百分比为10％，麦芽糊精的质量百分比为90％。
44.动物双歧杆菌whh2276制剂的制备方法如下：(1)动物双歧杆菌whh2276冻干粉的制备：(1.1)菌株活化：取动物双歧杆菌whh2276冻存管，2％接种量接种于液体mrs-cys培养基中，37℃厌氧培养过夜，得到1代活化种子液；(1.2)扩培：将1代活化种子液，2％接种量接种于液体mrs-cys培养基中，37℃厌氧培养过夜，得到2代活化种子液；(1.3)发酵：将2代活化种子液，5％接种量接种至mrs-cys培养基中，控制ph5.5，37℃，通co2发酵罐中培养16h，得到发酵物；(1.4)菌泥收集及乳化：将上述发酵物放置在8000rpm下离心10min，弃上清液，收集菌泥，按质量比1∶1将菌泥添加到冻干保护剂中，在180rpm下进行乳化15min，得到乳化液；冻干保护剂的制备如下：将甘油1.3wt％、脱脂乳粉24.2wt％、谷氨酸钠1.0wt％、乳糖16.1wt％，余量为去离子水混合均匀，105℃，10min灭菌；(1.5)冻干及粉碎：乳化液放在-80℃下冷冻，再置于真空温度为-50℃、真空度为0.2mbar下干燥出仓，粉碎，过20目筛，即得动物双歧杆菌whh2276冻干粉，活菌数为5
×
10
11
cfu/g。
45.(2)称量麦芽糊精和动物双歧杆菌whh2276冻干粉，将麦芽糊精与动物双歧杆菌whh2276冻干粉进行混合均匀，制成粉剂。
46.实施例3：发酵乳杆菌whh3906制剂发酵乳杆菌whh3906制剂的活菌数为5
×
10
10
cfu/g，包括以下成分：发酵乳杆菌whh3906冻干粉和麦芽糊精。其中发酵乳杆菌whh3906冻干粉的质量百分比为10％，麦芽糊精的质量百分比为90％。
47.发酵乳杆菌whh3906制剂的制备方法如下：
(1)发酵乳杆菌whh3906冻干粉的制备：(1.1)菌株活化：取发酵乳杆菌whh3906冻存管，2％接种量接种于液体mrs培养基中，37℃培养过夜，得到1代活化种子液；(1.2)扩培：将1代活化种子液，2％接种量接种于液体mrs培养基中，37℃培养过夜，得到2代活化种子液；(1.3)发酵：将2代活化种子液，5％接种量接种至mrs培养基中，控制ph5.5，37℃通n2培养16h，过夜得到发酵物；(1.4)菌泥收集及乳化：将上述发酵物放置在8000rpm下离心10min，弃上清液，收集菌泥，按质量比1∶1将菌泥添加到冻干保护剂中，在200rpm下进行乳化30min，得到乳化液a；冻干保护剂的制备如下：将甘油1.3wt％、脱脂乳粉24.2wt％、谷氨酸钠1.0wt％、乳糖16.1wt％，余量为去离子水混合均匀，105℃，10min灭菌；(1.5)冻干及粉碎：将乳化液放在-80℃下冷冻，再置于真空温度为-50℃、真空度为0.2mbar下干燥出仓，粉碎，过20目筛，即得发酵乳杆菌whh3906冻干粉，活菌数为5
×
10
11
cfu/g。
48.(2)称量麦芽糊精和发酵乳杆菌whh3906冻干粉，将麦芽糊精与发酵乳杆菌whh3906冻干粉进行混合均匀，制成粉剂。
49.实施例4：鼠李糖乳杆菌whh1155制剂鼠李糖乳杆菌whh1155制剂的活菌数为5
×
10
10
cfu/g，包括以下成分：鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉和麦芽糊精。其中鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉的质量百分比为50％，麦芽糊精的质量百分比为50％。
50.鼠李糖乳杆菌whh1155制剂的制备方法如下：(1)鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉的制备：(1.1)菌株活化：取鼠李糖乳杆菌whh1155冻存管，2％接种量接种于液体mrs培养基中，37℃培养过夜，得到1代活化种子液；(1.2)扩培：将1代活化种子液，2％接种量接种于液体mrs培养基中，37℃培养过夜，得到2代活化种子液；(1.3)发酵：将2代活化种子液，5％接种量接种至mrs培养基中，控制ph5.5，37℃通n2培养16h，过夜得到发酵物；(1.4)菌泥收集及乳化：将上述发酵物放置在8000rpm下离心10min，弃上清液，收集菌泥，按质量比1∶1将菌泥添加到冻干保护剂中，在200rpm下进行乳化30min，得到乳化液；冻干保护剂的制备如下：将甘油1.3wt％、脱脂乳粉24.2wt％、谷氨酸钠1.0wt％、乳糖16.1wt％，余量为去离子水混合均匀，105℃，10min灭菌；(1.5)冻干及粉碎：将乳化液放在-80℃下冷冻，再置于真空温度为-50℃、真空度为0.2mbar下干燥出仓，粉碎，过20目筛，即得鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉，活菌数为1
×
10
11
cfu/g。
51.(2)称量麦芽糊精和鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉，将麦芽糊精与鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉进行混合均匀，制成粉剂。
52.实施例5：益生菌组合物制剂a益生菌组合物制剂a，活菌数为5
×
10
10
cfu/g，由以下成分组成：动物双歧杆菌whh2276冻干粉、发酵乳杆菌whh3906冻干粉、鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉和麦芽糊精组
成。其中动物双歧杆菌whh2276冻干粉的质量百分比为15％，发酵乳杆菌whh3906冻干粉的质量百分比为3％，鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉的质量百分比为3％、麦芽糊精的质量百分比为79％。
53.益生菌组合物制剂a的制备方法如下：(1)称量麦芽糊精和动物双歧杆菌whh2276冻干粉、发酵乳杆菌whh3906冻干粉、鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉。
54.其中，动物双歧杆菌whh2276冻干粉的制备方法同实施例2，发酵乳杆菌whh3906冻干粉的制备方法同实施例3，发酵乳杆菌whh2644冻干粉的制备方法同实施例4，动物双歧杆菌whh2276冻干粉的活菌数1
×
10
11
cfu/g、发酵乳杆菌whh3906冻干粉的活菌数5
×
10
11
cfu/g、鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉的活菌数5
×
10
11
cfu/g。
55.(2)将麦芽糊精与上述3个益生菌冻干粉进行混合均匀，制成粉剂。
56.对比例1：益生菌组合物制剂b益生菌组合物制剂b，活菌数为5
×
10
10
cfu/g，与实施例5的区别是用其他商业动物双歧杆菌替换动物双歧杆菌whh2276，由以下成分组成：商业动物双歧杆菌冻干粉、发酵乳杆菌whh3906冻干粉、鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉和麦芽糊精组成。
57.益生菌组合物制剂b的制备方法同实施例5。
58.对比例2：益生菌组合物制剂c益生菌组合物制剂c，活菌数为5
×
10
10
cfu/g，与实施例5的区别是用其他商业发酵乳杆菌替换发酵乳杆菌whh3906，由以下成分组成：动物双歧杆菌whh2276冻干粉、商业发酵乳杆菌冻干粉、鼠李糖乳杆菌whh1155冻干粉和麦芽糊精组成。
59.益生菌组合物制剂c的制备方法同实施例5。
60.对比例3：益生菌组合物制剂d益生菌组合物制剂d，活菌数为5
×
10
10
cfu/g，与实施例5的区别是用其他商业鼠李糖乳杆菌替换鼠李糖乳杆菌whh1155，由以下成分组成：动物双歧杆菌whh2276冻干粉、发酵乳杆菌whh3906冻干粉、商业鼠李糖乳杆菌冻干粉和麦芽糊精组成。
61.益生菌组合物制剂d的制备方法同实施例5。
62.实施例6：制剂的降甘油三酯功效评价选取5dpf黑色素等位基因突变albino品系斑马鱼，分成10组：实施例2实验组、实施例3实验组、实施例4实验组、实施例5实验组、对比例1实验组、对比例2实验组、对比例3实验组、阳性对照盐酸吡格列酮20.0μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每组30尾斑马鱼。
63.分别水溶给予样品，浓度为2mg/ml。除正常对照组外，其余各实验组白天均水溶给予高脂饲料(蛋黄粉)，晚上均水溶给予高糖(葡萄糖)，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)，葡萄糖共处理33h(每天处理16.5h)，28℃处理48h，给与油红o进行整体脂肪染色。染色结束后，每个组别随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用image-pro plus高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管染色强度，以该指标的统计学分析结果评价样品降甘油三酯功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p＜0.05表明差异具有统计学意义。
64.实验结果见表4：
表4各组斑马鱼尾部血管甘油三酯测定结果与模型对照组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001。
65.由表4数据可知：实施例5的益生菌组合物制剂的降甘油三酯效果显著优于单一菌株制剂(实施例2-4)的降甘油三酯效果，这说明将动物双歧杆菌乳亚种whh2276与其他两株菌复配后，可进一步增强动物双歧杆菌whh2276的降甘油三酯能力。进一步地，将实施例5与对比例1-3的数据进行对比，实施例5的数据最优，分析其原因是在于：对比例1中用其他商业动物双歧杆菌替换动物双歧杆菌whh2276，说明其他商业动物双歧杆菌与其他两株菌的复配效果不如本发明的动物双歧杆菌whh2276。
66.对比例2，3分别用其他商业发酵乳杆菌替换发酵乳杆菌whh3906和其他商业鼠李糖乳杆菌替换鼠李糖乳杆菌whh1155，导致降甘油三酯能力不如实施例5，说明只有本发明特定的三株菌复配后效果最佳。
67.实施例7：制剂的降胆固醇功效评价选取5dpf野生型ab品系斑马鱼，分成10组：实施例2实验组、实施例3实验组、实施例4实验组、实施例5实验组、对比例1实验组、对比例2实验组、对比例3实验组、阳性对照盐酸吡格列酮20.0μg/ml，同时设置正常对照组和模型对照组，每组30尾斑马鱼。
68.分别水溶给予样品，浓度为2mg/ml。除正常对照组外，其余各实验组白天均水溶给予高脂饲料(蛋黄粉)，晚上均水溶给予高糖(葡萄糖)，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)，葡萄糖共处理33h(每天处理16.5h)，第32h注射胆固醇探针，28℃处理48h。每个组别随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品降胆固醇功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p＜0.05表明差异具有统计学意义。
69.实验结果见表5：表5各组斑马鱼胆固醇测定结果
组别斑马鱼胃部血管荧光强度(像素)正常对照组98700
±
5729
***
模型对照组302316
±
16595盐酸吡格列酮168976
±
14256
***
实施例2(动物双歧杆菌whh2276)235471
±
12213
**
实施例3(发酵乳杆菌whh3906)273864
±
19968
实施例4(鼠李糖乳杆菌whh1155)281860
±
18774实施例5(益生菌组合物制剂a)209449
±
12477
***
对比例1(益生菌组合物制剂b，用商业动物双歧杆菌替换whh2276)268013
±
14808对比例2(益生菌组合物制剂c，用商业发酵乳杆菌替换whh3906)235648
±
9174
**
对比例3(益生菌组合物制剂d，用商业鼠李糖乳杆菌替换whh1155)239651
±
8146
**
与模型对照组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001。
70.由表5数据可知：实施例5的益生菌组合物制剂的降胆固醇效果显著优于单一菌株制剂(实施例2-4)的降胆固醇效果，这说明将动物双歧杆菌whh2276与其他两株菌复配后，可进一步增强动物双歧杆菌whh2276的降胆固醇能力。进一步地，将实施例5与对比例1-3的数据进行对比，实施例5的数据最优，分析其原因是在于：对比例1中用其他商业动物双歧杆菌替换动物双歧杆菌whh2276，说明其他商业动物双歧杆菌与其他两株菌的复配效果不如本发明的动物双歧杆菌whh2276。
71.对比例2，3分别用商业发酵乳杆菌替换发酵乳杆菌whh3906和商业鼠李糖乳杆菌替换鼠李糖乳杆菌whh1155，导致降胆固醇能力不如实施例5，说明只有本发明特定的三株菌复配后效果最佳。
72.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
73.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种降血脂多元益生菌，其特征是：包括动物双歧杆菌whh2276、鼠李糖乳杆菌whh1155和发酵乳杆菌；其中：动物双歧杆菌whh2276的保藏号为gdmcc no:62901，保藏日为2022年10月18日，微生物分类命名为动物双歧杆菌乳亚种bifidobacterium animalis subsp. lactis，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心；鼠李糖乳杆菌whh1155的保藏号为cgmcc no:11955，保藏日为2016年1月4日，微生物分类命名为lacticaseibacillus rhannosus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。2.根据权利要求1所述的降血脂多元益生菌，其特征是：所述发酵乳杆菌的命名为发酵乳杆菌whh3906，保藏号为cgmcc no:19472，保藏日为2020年3月13日，微生物分类命名为limosilactobacillus fermentum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。3.根据权利要求1所述的降血脂多元益生菌，其特征是：将各菌株分别制备为冻干粉后复配为降血脂多元益生菌。4.根据权利要求3所述的降血脂多元益生菌，其特征是：各冻干粉的重量份如下：动物双歧杆菌whh2276为10-15重量份，鼠李糖乳杆菌whh1155为1-4重量份，发酵乳杆菌为1-4重量份。5.根据权利要求1或2或3或4所述的降血脂多元益生菌在制备可预防或治疗高血脂相关疾病或症状的产品中的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征是：所述产品为口服制剂。7.根据权利要求6所述的用途，其特征是：所述产品的制剂形式为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂或粉剂。8.根据权利要求5或6或7所述的用途，其特征是：所述产品为药品。9.根据权利要求5或6或7所述的用途，其特征是：所述产品还包括辅料。

技术总结
本发明涉及微生物领域，本发明公开了一种降血脂多元益生菌及其应用。本发明降血脂多元益生菌以降血脂的动物双歧杆菌WHH2276为核心，复配降尿酸的发酵乳杆菌WHH3906以及具有减肥功能的鼠李糖乳杆菌WHH1155。首先，本发明通过研究发现将特定的三株菌株复配后，在降血脂方面可产生协同作用，可显著强化降血脂功效。其次，本发明益生菌组合物中的各菌株之间不存在竞争抑制作用，反而具有互相促进生长的增殖效果，此外，本发明选用的各菌株无毒副作用，可安全食用，不存在安全性风险。不存在安全性风险。


技术研发人员：陈苏 郑志瑶 李言郡 柯雪琴 陈作国 高侃 陈彩玲
受保护的技术使用者：杭州娃哈哈集团有限公司
技术研发日：2023.01.19
技术公布日：2023/7/20