测定血清、血浆及全血中白介素-6的试纸条、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及生物医学检测领域，尤其涉及一种测定血清、血浆及全血中白介素-6的试纸条、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.白介素6(il-6)主要由巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、淋巴细胞以及t细胞等细胞产生，是一种属于白细胞介素中的细胞因子，生理功能较为复杂多样，是人体内细胞因子中的重要成员之一。il-6在体内的作用比较广泛，对免疫炎症反应、肝脏急性蛋白合成、造血功能、骨代谢都有调节作用，其主要作用是促进b细胞分泌抗体和增生分化，对体内的神经阻滞、造血系统、肝细胞和t细胞也都具有较为广泛的作用。il-6的急剧产生会引起急性炎症反应，也与损伤、感染、压力、脑死亡和其他情况相关。
3.白介素6作为一种多功能细胞因子以及炎症标志物，参与了体内多种反应，在人体的健康中扮演着重要的角色，是应用于感染性疾病早期诊断筛查的一个重要手段。目前有多种白介素6的检测方法研究，根据检测的原理以及方法的不同主要采用免疫学方法。免疫学方法又包括酶联免疫方法、免疫胶体金方法、放射免疫法、化学发光免疫分析法；各自优劣势如下。
4.1)酶联免疫方法(elisa)是较为常用的一种技术，是通过固相的抗原或者抗体和酶标后的抗原和抗体结合，常见的结合方式有双抗夹心法和间接法。酶联免疫法主要原理是采用双抗夹心的方法进行检测，包被抗体吸附于固相的载体表面，用来和特异抗原结合，当待测物中含有特异抗原时，与其形成抗原-抗体的复合物。再加入另一种用酶标记的抗体作为检测抗体，这种方式可以保留酶的活性和抗体的免疫学活性，用来提高elisa方法的灵敏度。酶标记后的抗体会和待测物中抗原的不同表位结合形成抗体-抗原-抗体的双抗夹心复合物，形成的复合物也被结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物会被酶催化成有色产物，有色产物颜色的深浅则可以判断待测物中抗原的浓度，从而进行定性或者定量的实验。该方法检测时间较长，检测范围窄。
5.2)免疫胶体金方法(ica)是将高电子密度的胶体金作为标记物标记在抗体或者抗原上，当其在相应的配体处发生聚集时会产生肉眼可见的颜色，因而可以用以定性或者半定量的检测研究中。随着胶体金研究的发展，在金核的表面可以进行一定的修饰，主要为含硫的配体、含磷化物、磷氧化物、氨基和羧基的配体。该方法灵敏度较低，不能进行定量的检测达不到临床诊断的要求。
6.3)放射免疫法(ria)是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法。该方法会有交叉反应、操作时长较长、仪器价格高、并且有一定的辐射对操作员有一定的损伤。
7.4)化学发光免疫分析法(clia)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检
测分析技术。该方法检测精度不高，仪器设备的成本较高。


技术实现要素：

8.基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种成本低、操作简单、且又能快速测定血清、血浆及全血中白介素-6的试纸条、试剂盒及检测方法。
9.本发明设计三方面的技术方案。
10.本发明的技术方案一如下：
11.一种测定血清、血浆以及全血样本中白介素-6的试纸条，包括pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，所述pvc底板为长条状构造，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸沿所述pvc底板长度方向依次排布设置在pvc底板的一个表面，且所述硝酸纤维素膜的两端分别与结合垫及吸水纸的一端层叠搭接，所述结合垫的另一端与样品垫的一端层叠搭接；在所述结合垫上设有荧光标记的il-6抗体和荧光标记的羊抗鸡igy抗体；在所述硝酸纤维素膜上设有相互平行的检测线和质控线，所述检测线il-6单克隆包被抗体，所述质控线包被鸡igy抗体。
12.一实施例，所述试纸条中，所述il-6抗体的生物源性为鼠源单克隆igg。
13.一实施例，所述试纸条中，所述il-6单克隆抗体的生物源性为鼠源单克隆igg。
14.一实施例，所述试纸条中，所述羊抗鸡igy抗体的生物源性为羊源抗体。
15.一实施例，所述试纸条中，包被鸡igy抗体的生物源性为鸡源抗体。
16.一实施例，所述试纸条中，所述il-6抗体和羊抗鸡igy抗体上标记有荧光微球。
17.本发明的技术方案二如下：
18.一种测定血清、血浆以及全血样本中白介素-6的试剂盒，包括样本稀释液、id卡以及检测卡；所述id卡存储有试剂标准信息；所述检测卡包括卡壳和上述任一所述的试纸条；所述卡壳的外形构造与试纸条相一致，在所述卡壳上设有加样孔和检测结果观察区；所述试纸条适配纳置在卡壳中后，所述试纸条的样品垫与加样孔的位置相对应设置，所述检测结果观察区的位置与所述硝酸纤维素膜的位置相对应设置。
19.一实施例，所述试剂盒，所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
20.本发明的技术方案三如下：
21.一种白介素-6的检测方法，该检测方法使用上述试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：
22.分别准备全血、血浆、血清样本；
23.分别取全血、血浆、血清样本加入到三份稀释液中，各自混匀，分别获得全血、血浆、血清样本溶液；
24.分别取全血、血浆、血清样本溶液加入到三个试剂盒的检测卡上的加样孔中；
25.将三个检测卡插入荧光定量检测仪上，选择样本类型“血浆、血清或全血进行检测，分别获取血清、血浆或全血样本中白介素-6的检测结果。
26.一实施例，所述检测方法中，所述稀释液包括0.01m pb、1％pvp、1％氯化钠及1％吐温。
27.本发明基于免疫学和层析技术的原理，用免疫荧光微球作为标记物，使用荧光检测仪检测荧光信号强度，定量测定人体血清、血浆以及全血样本中白介素-6(il-6)的试剂
盒；与传统快速检测技术性能比较，该试剂盒检测灵敏度更高、检测范围更宽、价格低廉，且具有快速、操作简便的特点，应用前景广。
附图说明
28.图1为本发明提供的试纸条结构示意图；
29.图2为本发明提供的卡壳结构示意图；
30.图3为实施例5中，试剂盒与临床全血样本值的相关性曲线图；
31.图4为实施例5中，试剂盒与临床血浆样本值的相关性曲线图。
具体实施方式
32.下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
33.如图1所示，一种测定人体血清、血浆以及全血样本中白介素-6的试纸条10，包括pvc底板5、样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水纸4，pvc底板5为长条状构造，所述样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水纸4沿所述pvc底板5长度方向依次排布设置在pvc底板5的一个表面，且所述硝酸纤维素膜3的两端分别与结合垫2及吸水纸4的一端层叠搭接，所述结合垫2的另一端与样品垫1的一端层叠搭接；在所述结合垫2上设有荧光标记的il-6抗体和荧光标记的羊抗鸡igy抗体；在所述硝酸纤维素膜3上设有相互平行的检测线6(t线)和质控线7(c线)，所述检测线6il-6单克隆包被抗体，所述质控线7包被鸡igy抗体。试纸条的组件及组分如表1所示。
34.表1白介素-6的试纸条的组件及所含主要成分
35.编号组分组分中的主要成分1样品垫——2结合垫荧光标记的il-6抗体和荧光标记的羊抗鸡igy3硝酸纤维素膜il-6单克隆包被抗体，质控线包被鸡igy抗体4吸水纸——5pvc底板——-36.一实施例中，结合垫2的il-6抗体的标记抗体，也就是荧光标记的il-6抗体生物源性如ab1所示，结合垫的羊抗鸡igy抗体，也就是羊抗鸡igy标记抗体生物源性如ab3所示，用于t线的检测的包被抗体，也就是il-6单克隆包被抗体生物源性如ab2所示，用于c线质控的包被抗体，也就是包被鸡igy抗体生物源性如ab4所示。
37.进一步，所述ab1抗体标记有荧光微球，所述ab3抗体标记有荧光微球；荧光微球便于与缓冲液结合，获得时间分辨荧光-抗体复合物。
38.优选地，所述il-6标记抗体在试纸条上的终浓度为0.5mg/ml，所述il-6的包被抗体在试纸条上的终浓度为1mg/ml，所述用于c线质控的标记抗体在试纸条上的终浓度为0.5mg/ml，所述用于c线质控的包被抗体在试纸条上的终浓度为1mg/ml。所述定量测定白介素-6(il-6)的抗体的生物源性如表2所示。
39.表2检测白介素-6(il-6)的抗体和抗原的生物源性
40.主要原材料生物源性抗il-6标记抗体ab1鼠源单克隆igg
抗il-6包被抗体ab2鼠源单克隆igg羊抗鸡igy标记抗体ab3羊源抗体鸡igy包被抗体ab4鸡源抗体
41.在毛细效应下进行层析，结合垫样本中的il-6抗原与荧光标记il-6抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的il-6单克隆抗体捕获，并形成“抗体-抗原-荧光抗体”复合物；样本中的il-6浓度与复合物荧光强度成正比，根据设定的标准曲线，免疫荧光检测仪将荧光信号值转换成样本中il-6浓度。
42.试纸条的制备工艺如下：
43.步骤一、结合垫的制备
44.il-6免疫荧光活化：取100ul荧光微球加入800ul mes(2-吗啉乙磺酸)的离心管中，超声3min。量取30ul的edc(1-乙基-碳酰二亚胺盐盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)(1：1)活化液与离心管中的混合，超声至分散均匀，在室温下平衡一定时间。12000r/min，4℃，离心15min，去上清。
45.抗体偶联：向上述离心管加入1ml mes，旋涡后，超声3min，加入0.5mg的il-6抗体和羊抗鸡igy抗体，旋转反应2h。
46.封闭与保存：向上述离心管中加入100ul10％bsa(牛血清蛋白)溶液封闭30min，12000r/min，4℃，离心15min。去上清，加入1ml tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)，超声3min，随后12000r/min，4℃，离心15min，重复一次此步骤。去上清加入1ml微球复溶液，超声3min，2000r/min离心3min，去沉淀4℃避光保持。
47.结合垫：将制备的荧光微粒溶液以6ul/cm的速度均匀喷在1.5-1.8cm的玻纤上，在55℃烘干3-4h，即可。
48.步骤二、样品垫的制备及处理
49.处理液的配制：0.1m bb，1％蔗糖，1％海藻糖，1％pvpk3o(聚乙烯吡咯烷酮)，0.1mg/mlrbc(人抗红细胞抗体)。
50.样品垫处理：将上述处理液按3-4ml/条(宽：17-18，长：30cm)均匀涂抹在0.8-1.0cm的样品垫上，在在55℃烘干6-8h，即可。
51.步骤三、硝酸纤维素膜(又称免疫层析试纸条)的制备
52.包被液配制：0.05m tris(三羟甲基氨基甲烷)，1％蔗糖。
53.喷垫：将硝酸纤维素膜(即nc膜)贴在pvc底板上，用上述包被液包被抗体使得nc膜检测线上il-6抗体包被浓度为1mg/ml，质控线上鸡igy的包被浓度为1mg/ml，包被膜干燥时间选择48h。
54.步骤四、试纸条组装
55.将处理好的样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在pvc板上，经切条机将组装好的pvc板切割成3.85-4.00mm宽度的免疫层析试纸条。
56.步骤五、样品检验及结果判定
57.样品稀释液配制：0.01m pb，1％pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，1％氯化钠，1％吐温。
58.样品检验：取待检测的血清、血浆或全血样品20-30ul加入到100ul的上述样品稀释液中，待混合均匀后滴加至免疫层析试剂卡上进行免疫层析反应；随后在荧光检测器下采用与荧光微粒相对应的发射光波长进行荧光检测。荧光检测器下荧光检测时，仅在质检
线上检测到信号，才能证明检测结果是有效的。
59.本发明还提供一种测定人体血清、血浆以及全血样本中白介素-6的试剂盒，包括样本稀释液、id卡以及检测卡；所述id卡存储有试剂标准信息，检测卡包括卡壳20和试纸条10。如图2所示，卡壳20的外形构造与试纸条10相一致，在卡壳20上设有加样孔21和检测结果观察区22；试纸条适配纳置在卡壳20中后，所述试纸条10的样品垫1与加样孔21的位置相对应设置，所述检测结果观察区22的位置与所述硝酸纤维素膜3的位置相对应设置；使用时，通过检测结果观察区22观察c线和t线出现荧光条带来判断检测是否有效。
60.优选地，为了防止检测卡受污染和受潮，制备检测卡时还需要将检测卡用锡箔或铝箔密封包装且锡箔或铝箔中还装有干燥剂。
61.一实施例中，试剂盒的样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
62.本发明还提供一种使用上述试剂盒测定人体血清、血浆以及全血样本中白介素-6的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
63.1、分别准备全血、血浆、血清样本；
64.2、用移液器分别吸取100ul全血、血浆、血清样本加入到三份稀释液中，各自混匀，分别获得全血、血浆、血清样本溶液；
65.3、打开铝箔袋，取出三支检测卡，分别水平放置于桌面上；
66.4、用移液器分别吸取100ul全血、血浆、血清样本溶液加入到三个检测卡上的加样孔中；
67.5、打开荧光定量检测仪，插入与试剂批号相同的id芯片；
68.6、在荧光定量检测仪上选择样本类型“血浆、血清或全血”；
69.7、即时测试：待室温反应15min后，将检测卡放入仪器卡槽中，选择“即时测试”模式，点击“测试”；标准测试：将检测卡放入仪器卡槽中，选择“标准测试”模式，点击“测试”，仪器自动计时，计时结束后，自动测试并显示检测结果；
70.8、点击“打印”，分别打印血清、血浆或全血样本中白介素-6的检测结果报告。
71.全血、血浆、血清样本准备工作如下：
72.本发明使用样本采集方法，其是全血采集用含有肝素锂、edta-k2或柠檬酸钠抗凝剂的抗凝管采集受检者静脉血，将采集血样摇匀备用；血浆采集用含有肝素锂、edta-k2或柠檬酸钠抗凝剂的抗凝管采集受检者静脉血，采血后应尽快分离血浆，以免溶血；血清采集用血清管或含有促凝剂的快速血清管采集受检者静脉血，采血后应尽快分离血清，以免溶血。
73.所述样本类型包括：全血、血浆、血清。
74.优选地，所述不同样本采集后应尽可能立即使用。若不能及时检测，血清/血浆/全血室温放置可保存3小时；血清/血浆2℃～8℃放置可保存7天，全血2℃～8℃放置可保存3天；血清/血浆-20
±
5℃放置可保存90天，全血样本不能冷冻保存。冷藏、冷冻样本检测前要充分溶解混匀，并恢复至室温后方可进行测试，请勿反复冻融，备用。
75.上述检测方法中，所述稀释液包括0.01m pb、1％pvp、1％氯化钠及1％吐温。
76.本发明所述试剂盒适用样本为人体血清、血浆以及全血样本。
77.本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测c线出现荧光条带，且试纸卡未出现损坏，仪器未出现故障，表明实验结果有效。
78.下面通过具体实施例来进一步详细说明。
79.实施例1一种人体血清、血浆以及全血样本中白介素-6(il-6)快速检测试剂盒的组成成分、包装及数量(25人份/盒)，如表3所示：
80.表3试剂盒的组成成分、包装及数量
[0081][0082]
实施例2试剂盒的空白限性能评估实验
[0083]
取阴性牛血清100ul加入100ul样品稀释液，混匀后取100ul加入到加样孔中，15min后采用荧光检测器检测，重复20次。其相对t/c平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd所对的数值，将其带入标准曲线方程中，得出相应浓度值，即为空白限，如表4所示。结果表明，本试剂盒的空白限为不大于3.00pg/ml。
[0084]
表4空白限测试结果
[0085]
[0086][0087]
实施例3试剂盒的线性性能评估实验
[0088]
采用阴性牛血清作为稀释液，将白介素-6标准品(nibsc 89/548)配制成浓度为3pg/ml、30pg/ml、200pg/ml、1000pg/ml、4000pg/ml的标准品溶液，取标准品100ul加入100ul样品稀释液，混匀后取100ul加入到加样孔中，15min后采用荧光检测器检测。结果表明，线性的相关系数r2大于0.9900，检测限3.00pg/ml，各浓度的检测变异系数均小于10％，如表5所示。
[0089]
表5不同浓度标准品检测实验结果
[0090][0091]
实施例4试剂盒的准确度性能评估实验
[0092]
试取一定量的白介素-6标准品添加到阴性小牛血清中，使血清中白介素-6终浓度分别为7pg/ml、1000pg/ml，各重复6个。将100ul待测样本与100ul试剂盒中的样本稀释液充分混合1min，然后取100ul混合液加入试剂卡的加样孔中，将试剂卡水平放置15min后插入荧光定量检测仪中，读取荧光信号t/c值，根据标准曲线计算出相应的样本浓度，如表6所示。通过表6试验数据可看出，6个样本的相对偏差均不超过
±
15％。
[0093]
表6准确度测试实验结果
[0094][0095]
实施例5临床应用实验
[0096]
从医院采集20例全血、血浆样本，取100μl的样本稀释液于小离心管中，然后用移液枪吸取100μl的临床样本于小离心管中，混合液用漩涡振荡器摇匀反应1min后，用移液枪吸取100μl混合液于试剂卡的加样孔中加样(加样过程中注意不要将气泡打入加样孔中，以防气泡进入层析系统影响测定结果)。每个样本平行检测两次。将试剂卡水平放置15min层析反应后插入荧光定量检测仪中进行读取t/c值。采用附图3和4标曲图，反求出待测值，与临床样本值进行比对，结果如表7所示。
[0097]
表7 20例全血、血浆样本检测结果
[0098][0099][0100]
由表7可知，20份临床样本有5个阴性，25个阳性，经本试剂盒检测时结果与之一致，此外，通过分析本试剂盒测试值与临床样本值的相关性可知，两者测试结果相关性良好。以上结果说明本试剂盒定量检测人体全血和血浆样本白介素6的含量较为可靠。
[0101]
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种测定血清、血浆以及全血样本中白介素－6的试纸条，其特征在于，包括pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，所述pvc底板为长条状构造，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸沿所述pvc底板长度方向依次排布设置在pvc底板的一个表面，且所述硝酸纤维素膜的两端分别与结合垫及吸水纸的一端层叠搭接，所述结合垫的另一端与样品垫的一端层叠搭接；在所述结合垫上设有荧光标记的il－6抗体和荧光标记的羊抗鸡igy抗体；在所述硝酸纤维素膜上设有相互平行的检测线和质控线，所述检测线il－6单克隆包被抗体，所述质控线包被鸡igy抗体。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述il－6抗体的生物源性为鼠源单克隆igg。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述il－6单克隆包被抗体的生物源性为鼠源单克隆igg。4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述羊抗鸡igy抗体的生物源性为羊源抗体。5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，包被鸡igy抗体的生物源性为鸡源抗体。6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述il－6抗体和羊抗鸡igy抗体上标记有荧光微球。7.一种测定血清、血浆以及全血样本中白介素－6的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本稀释液、id卡以及检测卡；所述id卡存储有试剂标准信息；所述检测卡包括卡壳和如权利要求1至5任一所述的试纸条；所述卡壳的外形构造与试纸条相一致，在所述卡壳上设有加样孔和检测结果观察区；所述试纸条适配纳置在卡壳中后，所述试纸条的样品垫与加样孔的位置相对应设置，所述检测结果观察区的位置与所述硝酸纤维素膜的位置相对应设置。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液。9.一种白介素－6的检测方法，其特征在于，该检测方法使用权利要求7或8所述的试剂盒，所述检测方法包括如下步骤：分别准备全血、血浆、血清样本；分别取全血、血浆、血清样本加入到三份稀释液中，各自混匀，分别获得全血、血浆、血清样本溶液；分别取全血、血浆、血清样本溶液加入到三个试剂盒的检测卡上的加样孔中；将三个检测卡插入荧光定量检测仪上，选择样本类型“血浆、血清或全血进行检测，分别获取血清、血浆或全血样本中白介素－6的检测结果。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述稀释液包括0.01m pb、1％pvp、1％氯化钠及1％吐温。

技术总结
本发明公开了一种测定人体血清、血浆以及全血样本中白介素－6的试纸条、试剂盒及其检测方法，试剂盒包括试纸条，试纸条包括PVC底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，所述PVC底板为长条状构造，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸沿所述PVC底板长度方向依次排布设置在PVC底板的一个表面，且所述硝酸纤维素膜的两端分别与结合垫及吸水纸的一端层叠搭接，所述结合垫的另一端与样品垫的一端层叠搭接。该试剂盒检测灵敏度更高、检测范围更宽、价格低廉，且具有快速、操作简便的特点，应用前景广。应用前景广。应用前景广。


技术研发人员：杨勇 蒋析文 齐文闯 刘双 潘秀华 徐鸿 刁雪
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：2022.01.07
技术公布日：2023/7/20