通过检测尿液外泌体DNA拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒的制作方法

通过检测尿液外泌体dna拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种通过检测尿液外泌体dna拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒。


背景技术：

2.膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。膀胱恶性肿瘤细胞之间是存在异质性的，并表现出不同的生物学特性，拷贝数变异(cnv)是膀胱癌中最重要的体细胞畸变之一，因为致癌基因的激活往往归因于染色体拷贝数扩增，而抑癌基因的失活往往是由突变相关的杂合缺失或纯合缺失引起的，其中包括特定dna片段的增殖和缺失。
3.膀胱镜，影像学检查(超声，ct泌尿道成像，mri检查，静脉尿路造影检查，全身骨显像，pet-ct检查)，脱落细胞学，尿液膀胱肿瘤标志物或者fish检查是膀胱癌最常用的检测方法。然而，膀胱镜是有创检测，医从性不佳，同时容易引起出血、感染等并发症。影像学多数早期灵敏度不佳，不能作为早期肿瘤的检测。脱落细胞学需要专业的病理医生人工判断，且在低级别肿瘤中，漏诊率高。尿液膀胱肿瘤标志物(nmp22)和fish，分别存在灵敏度偏低，稳定性差和成本高等问题。因此，亟需一种更加灵敏高效且无创的膀胱癌辅助诊断方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是，提供一种通过检测尿液外泌体dna拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒。旨在解决现有技术中膀胱癌检测操作复杂、医从性不佳、灵敏度不高的问题。
5.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
6.通过检测尿液外泌体dna拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒，该试剂盒通过检测尿液外泌体cox10基因和/或mtbp基因拷贝数变异的异常对膀胱癌进行诊断。
7.作为优选实施方案，所述试剂盒采用的内参基因为nrdc基因。
8.作为优选实施方案，检测所述cox10基因的引物如seq id no.1和seq id no.2所示，探针如seq id no.3所示。
9.作为优选实施方案，检测所述mtbp基因的引物如seq id no.4和seq id no.5所示，探针如seq id no.6所示。
10.作为优选实施方案，检测所述nrdc基因的引物如seq id no.7和seq id no.8所示，探针如seq id no.9所示。
11.所述采用的引物和探针序列如表1所示。
12.表1
13.引物名称序列信息序列号cox10-ftcaggaatgtcaataagcagtggseq id no.1cox10-rgcagaaagtaacagagtaagaatggtseq id no.2cox10-ptagcttcctcaaacgcatggseq id no.3
mtbp-ftgattcgcttaatctacgttcttgseq id no.4mtbp-rctgtttgtggctttctggatgtcseq id no.5mtbp-pcagagtctcttctttctcagacaacseq id no.6nrdc-fctagaacgcggaggaggtggseq id no.7nrdc-rgcagcaacagtgactctcctcaseq id no.8nrdc-pgatgtccatcgctccagcttgseq id no.9
14.所述用于检测基因的探针5’端带有荧光基团，所述荧光基团可以是vic、fam、rox或hex任意一种或几种；所述用于检测基因的探针3’端带有淬灭基团，所述淬灭基团可以是mgb，也可以是bhq1。
15.作为优选实施方案，所述试剂盒包括阳性质控品、阴性质控品、pcr反应液a，pcr反应液b和pcr反应液c，所述pcr反应液c包括检测cox10基因、mtbp基因和nrdc基因的引物探针序列。
16.作为优选实施方案，所述cox10基因、mtbp基因和nrdc基因的引物在pcr反应液c中的浓度在1～100um之间，探针浓度在1～50um之间。
17.作为优选实施方案，所述反应液a的组成为：0.1～20u的热启动dna聚合酶，0.1～10u的udg酶，0.1-1g/ml的bsa，溶剂为水。
18.作为优选实施方案，所述反应液b的组成为：1～20um datp，1～20um dctp，1～20um dgtp，1～50um dutp，1～100um mgcl2，100～1000mm tris，100～1000mm(nh4)2so4，ph7～9，溶剂为水。
19.作为优选实施方案，所述阳性质控品为0.1ng/ul的膀胱癌细胞系t24的dna的水溶液；所述阴性质控品为水。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
21.1，本发明通过检测尿液外泌体cox10基因和mtbp基因拷贝数变异的异常对膀胱癌进行诊断，采用本发明试剂盒对膀胱癌的阳性检出率为80％。
22.2，本发明提供的试剂盒是基于pcr的方法检测外泌体dna拷贝数的变异，该试剂盒的优点有：无创检测；检测成本低，检测时间短；灵敏度、特异性高。
附图说明
23.图1为本发明实施例2中cox10基因引物筛选结果。
24.图2为本发明实施例2中mtbp基因引物筛选结果。
25.图3为本发明实施例2中nrdc基因引物筛选结果。
具体实施方式
26.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
27.实施例1膀胱癌患者拷贝数变异基因以及内参基因筛选
28.1.1尿液外泌体制备及外泌体dna提取
29.1)尿液样本准备，需求量30ml，膀胱癌患者尿液样本18例，编号依次为s1-s18。
30.2)取准备好的尿液样本，4℃，4000g，离心30min，转移上清液至新的离心管中，加
入15ml peg8000(sigma，聚乙二醇peg800089510-250g-f)的水溶液(浓度30％)，震荡混匀，4℃静置过夜，之后，3000g，离心10min，所得沉淀用qiagen dna micro kit(qiagen，56304)进行外泌体的dna提取，详细的操作流程见试剂盒说明书。
31.1.2尿液外泌体dna文库构建
32.尿液外泌体dna建库采用dna-seq kit试剂盒(clontech，货号：r400676)进行建库，其操作方法参见试剂盒说明书。
33.1.3将尿液外泌体dna文库送明码生物nova平台测序，使用pe150测序技术，每个样本数据需求量3g。
34.1.4测序数据分析以及内参基因筛选
35.使用fastp质控过滤原始测序文件，使用sentieon分别比对hg19，hg38基因组，使用qdnaseq进行tumor only的cnv鉴定，使用ichorcna进行tumor only的cnv鉴定和tumor fraction的估计。
36.差异基因筛选：对所有样本的基因检测情况进行统计，log2的ratio值绝对值小于等于0.2的记为na。统计结果发现：cox10基因与mtbp基因在18例检测的样本中有12例检测到了异常，两者组合在18例中可以检测到15例异常，检测结果汇总如表2所示，患者的阳性检出率可达到83.33％。
37.表2 cox10基因与mtbp基因的测序结果
38.log2 ratio值s1s2s3s4s5s6s7s8s9cox101.0910.3640.5340.3210.2380.2200.4340.459namtbp0.6870.3640.5340.4220.238na0.434nanalog2 ratio值s10s11s12s13s14s15s16s17s18cox10nana0.236na0.229na0.3831.024namtbpna0.3130.236na0.2290.774na1.0240.751
39.管家基因筛选：检测结果显示，nrdc基因在所有的样本中均可检测到，具体的reads数的检测结果分别如表3所示，经计算该基因在所有样本中的reads数的变异系数(cv)等于0.26，变异系数小于5，说明在不同的样本间的差异较小，因此选择nrdc作为后续pcr检测的内参基因。
40.表3 nrdc基因的测序结果
41.reads数s1s2s3s4s5s6s7s8s9nrdc452665538446809993514755452reads数s10s11s12s13s14s15s16s17s18nrdc622452551400612550807729864
42.实施例2差异基因与内参基因引物探针筛选
43.2.1pcr模板准备
44.取一定量的膀胱癌细胞系t24的dna，稀释至0.1ng/ul。
45.2.2pcr反应液a的配制
46.每个反应(5ul)包含：5u的phusion green hot start ii high-fidelity dna聚合酶(thermo，f537l)，1u的udg酶(thermo，en0362)，0.1g/ml的bsa(proliant，#68700)的水溶液。
47.2.3pcr反应液b的配制
48.每个反应(20ul)：5um datp(thermo，r0141)，5um dctp(thermo，r0151)，5um dgtp(thermo，r0161)，10um dutp(thermo，r0133)，30um mgcl2(thermo，r0971)，450mm tris(merck，741883)，500mm(nh4)2so4(merck，7783-20-2)的ph7.8的水溶液。
49.2.4引物探针的配制
50.引物对及探针均在百力格生物技术有限公司合成，具体的序列信息如表4所示。
51.表4
52.引物名称序列信息cox10-f1tcaggaatgtcaataagcagtggcox10-p1tagcttcctcaaacgcatggcox10-r1gcagaaagtaacagagtaagaatggtcox10-f2tgttggtaacagtgtgtctgccox10-p2tctgtatcgcagctctggttgcox10-r2gagccaatgcaaatccagctmtbp-f1ctctggcttctctctggattgmtbp-p1ttcccagaactggttcattacctcmtbp-r1gtggcccagcaactgttcagmtbp-2ftgattcgcttaatctacgttcttgmtbp-2pcagagtctcttctttctcagacaacmtbp-2rctgtttgtggctttctggatgtcnrdc-f1ggctgtccagtccctcttccnrdc-p1tgttcagcatttggcaggatggnrdc-r1gtttcaccctgctgctcctcnrdc-f2ctagaacgcggaggaggtggnrdc-p2gatgtccatcgctccagcttgnrdc-r2gcagcaacagtgactctcctcanrdc-r2gcagcaacagtgactctcctca
53.引物对及探针体系的配制：cox10 f1r1p1、cox10 f2r2p2、mtbp f1r1p1、mtbp f2r2p2、nrdc f1r1p1以及nrdc f2r2p2的引物探针混合于水溶液中，引物的浓度均为20um，探针的浓度均为5um，每个pcr反应加入引物探针混合液1ul。
54.pcr反应液的配置如表5所示，反应总体积为50ul。
55.表5
56.组份上样体积(ul)质粒(10copies)/gdna(10ng)1引物探针混合液1反应液a5反应液b20h2o23
57.配置好的pcr反应液置于abi7500上，按照如下程序运行：
[0058][0059]
检测结果分别如图1、图2、图3所示，其中图1为cox10基因引物筛选结果；图2为mtbp基因引物筛选结果；图3为nrdc基因引物筛选结果。检测结果显示：cox10基因中的引物探针组合f1r1p1检测的信号值明显优于f2r2p2；mtbp基因中的引物探针组合f2r2p2检测的ct值与f1r1p1相比明显提前；nrdc基因中的引物探针组合f2r2p2检测的有信号检出，f1r1p1无明显信号值明检出。所以筛选cox10基因的f1r1p1、mtbp基因的f2r2p2、nrdc基因的f2r2p2用于后续实验。
[0060]
实施例3使用临床样本验证本发明试剂盒
[0061]
3.1临床尿液样本dna准备
[0062]
取膀胱癌初诊患者10例，编号依次为t1-t10；膀胱良性病变患者3例，各收集尿液样本30ml。尿液外泌体的制备以及尿液外泌体dna的提取如实施例1所示。
[0063]
3.2阳性质控品准备：0.1ng/ul的t24 dna的水溶液100ul。
[0064]
3.3阴性质控品准备：无菌水100ul。
[0065]
3.4pcr反应液的配制
[0066]
pcr反应液a、pcr反应液b的配制如实施例2所示，pcr反应液c的配制为：取cox10基因的优选引物探针组合f1r1p1(p1为fam标记)、mtbp基因的优选引物探针组合f2r2p2(p2为vc标记)、nrdc基因的优选引物探针组合f2r2p2(p2为cy5标记)配置于一管内，其中引物浓度均为20um，探针的浓度均为5um。
[0067]
阳性质控品及阴性质控品pcr反应液配置如下：
[0068]
组份上样体积(ul)阳性质控品/阴性质控品1pcr反应液c1反应液a5反应液b20h2o23
[0069]
样本孔pcr反应液配置：
[0070][0071][0072]
pcr反应程序运行：
[0073][0074]
试剂盒的判定标准如表6所示。
[0075]
表6
[0076][0077]
pcr检测结果如表7所示，阳性质控品的三个荧光通道检测的ct值均小于36，阴性质控品的三荧光通道均无阳性信号值检出。根据判定标准可知，膀胱癌患者t1，t2，t3，t4，t7，t8，t9，t10均判定为阳性，样本t5、t6判定为阴性，膀胱良性病变患者n1、n2、n3均判定为阴性。该检测试剂盒在膀胱癌患者中有80％的阳性检出率，对于膀胱良性病变患者均为阴性检出。说明该试剂盒对于膀胱癌患者的诊断有较高的灵敏度和特异性，为膀胱癌的诊断提供了一种快速、无创的方法。
[0078]
表7
[0079][0080][0081]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.通过检测尿液外泌体dna拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒通过检测尿液外泌体cox10基因和/或mtbp基因拷贝数变异的异常对膀胱癌进行诊断。2.如权利要求1所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用的内参基因为nrdc基因。3.如权利要求1所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：检测所述cox10基因的引物如seq id no.1和seq id no.2所示，探针如seq id no.3所示。4.如权利要求1所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：检测所述mtbp基因的引物如seq id no.4和seq id no.5所示，探针如seq id no.6所示。5.如权利要求2所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：检测所述nrdc基因的引物如seq id no.7和seq id no.8所示，探针如seq id no.9所示。6.如权利要求1所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性质控品、阴性质控品、pcr反应液a，pcr反应液b和pcr反应液c，所述pcr反应液c包括检测cox10基因、mtbp基因和nrdc基因的引物探针序列。7.如权利要求6所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：所述cox10基因、mtbp基因和nrdc基因的引物在pcr反应液c中的浓度在1～100um之间，探针浓度在1～50um之间。8.如权利要求6所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述反应液a的组成为：0.1～20u的热启动dna聚合酶，0.1～10u的udg酶，0.1-1g/ml的bsa，溶剂为水。9.如权利要求6所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于，所述反应液b的组成为：1～20um datp，1～20um dctp，1～20um dgtp，1～50um dutp，1～100um mgcl2，100～1000mm tris，100～1000mm(nh4)2so4，ph7～9，溶剂为水。10.如权利要求6所述的诊断膀胱癌的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为0.1ng/ul的膀胱癌细胞系t24的dna的水溶液；所述阴性质控品为水。

技术总结
本发明公开了一种通过检测尿液外泌体DNA拷贝数变异诊断膀胱癌的试剂盒。该试剂盒通过检测尿液外泌体COX10基因和/或MTBP基因拷贝数变异的异常对膀胱癌进行诊断。所述试剂盒采用的内参基因为NRDC基因。本发明提供的试剂盒是基于PCR的方法检测外泌体DNA拷贝数的变异，该试剂盒用于膀胱癌诊断主要有以下优点：无创检测；检测成本低，检测时间短；灵敏度、特异性高。高。高。


技术研发人员：王晓楠 钱祺 张亚楠
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：2022.01.06
技术公布日：2023/7/20