差异序列双扩增富集和检测方法与流程

1.本发明属于核酸富集领域，具体涉及利用核酸的杂交和延伸富集和检测差异序列的方法。


背景技术：

2.kras是实体瘤的常见癌基因，大约30％的肿瘤都存在kras突变，包括90％的胰腺癌和25％的肺癌。胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤之一。90％以上的胰腺癌为导管腺癌(pdac)，其中86％的pdac存在kras突变，在pdac中91％的突变是第12号密码子突变，其中最主要的是g12d、g12v和g12r，分别占比45％，35％，17％，其他4种突变为g12a、g12c、g12s和第13号密码子突变g13d；大量临床研究表明，当肿瘤患者存在kras突变时，针对肿瘤的靶向药治疗效果通常不太好，检测kras基因的突变可以让患者从相应的肿瘤靶向药治疗中获益。
3.目前市面上绝大多数的检测试剂盒是基于组织样本dna进行检测，有创的样本获取方式对患者而言，存在肿瘤进展等风险，且耗时长、操作复杂。相较于传统的穿刺组织检测，基于血浆cfdna的液体活检是一种理想的无创性工具，可以随着时间推移进行多次检测，以提供肿瘤变化的实时数据，甚至可作为辅助早筛的技术手段之一。但是，cfdna中肿瘤细胞dna含量低，难以精确检测微小碱基差异。


技术实现要素：

4.本发明针对基因突变类型检测难，检出率低等问题，提供一种基于分子生物学检测方法，设计了预扩增富集突变和突变阻滞扩增系统进行突变检测的方法。
5.本发明第一方面提供一种从核酸分子混合物中富集或检测第一核酸序列的方法，所述核酸分子混合物中的核酸分子具有第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列具有1-3个不同碱基，所述方法包括：
6.任选的1)在第二核酸序列扩增受到抑制的条件下扩增具有第一核酸序列的分子，获得预富集产物，
7.2)使用阻滞引物和反向引物扩增步骤1)的预富集产物，获得富集的第一核酸序列分子，其中，
8.阻滞引物与第一核酸序列互补，识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基，并且阻滞引物还具有1-3个错配碱基。
9.在一个或多个实施方案中，阻滞引物在其识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域中具有1-3个错配碱基。
10.在一个或多个实施方案中，阻滞引物的识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基位于其3’端，优选3’端第1-3个碱基中任意一个、两个或三个。
11.在一个或多个实施方案中，所述核酸分子混合物含有基因组dna或cfdna的样品。优选地，所述核酸分子混合物含有cfdna。所述样品优选源自组织的样品或源自血液的样
品。
12.在一个或多个实施方案中，步骤1)的预富集产物长度为至少10bp，优选至少50bp。
13.在一个或多个实施方案中，第一核酸序列长度为至少10bp，优选至少20bp，更优选至少50bp，例如79-91bp。
14.在一个或多个实施方案中，步骤1)的扩增包括使用识别第二核酸序列中与第一核酸序列不同的碱基的封闭序列，所述封闭序列具有抑制或阻断核酸延伸的修饰。
15.在一个或多个实施方案中，所述封闭序列是封闭引物或封闭探针。
16.在一个或多个实施方案中，所述修饰包括：磷酸化(例如3’末端)、双脱氧修饰(例如3’末端)、甲基化。
17.在一个或多个实施方案中，使用能扩增第一核酸序列的引物对和所述封闭序列进行步骤1)的扩增。
18.在一个或多个实施方案中，所述引物对之一或二者连接有便于纯化的接头。
19.在一个或多个实施方案中，所述引物对和封闭序列的浓度比为至少1:20，例如至少1:50，至少1:100，或至少1:200。
20.在一个或多个实施方案中，阻滞引物的识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域是所述阻滞引物的3’端区域。即，所述阻滞引物在其3’端区域具有1-3个错配碱基。在一个或多个实施方案中，3’端区域是3’端第1-8个碱基中任意一个或多个，第1-6个碱基中任意一个或多个，优选第1-5个碱基中任意一个或多个，更有选第1-3个碱基中任意一个或多个。
21.在一个或多个实施方案中，所述错配碱基包括：碱基插入、碱基取代、碱基缺失或碱基修饰。
22.在一个或多个实施方案中，所述扩增的体系还包括dntp、二价离子、dna聚合酶。
23.在一个或多个实施方案中，第一核酸序列和第二核酸序列的不同碱基包括：碱基插入、碱基取代、碱基缺失或碱基修饰。
24.在一个或多个实施方案中，第一核酸序列是具有kras基因突变的序列。在一个或多个实施方案中，kras基因突变包括选自以下的一个或多个：g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13d。
25.在一个或多个实施方案中，第二核酸序列是野生型序列或具有与第一核酸序列的突变不同的kras基因突变的序列。
26.在一个或多个实施方案中，步骤2)的扩增还包括使用荧光探针。
27.在一个或多个实施方案中，步骤2)的扩增是能够检测核酸相对或绝对含量的pcr扩增，例如荧光定量pcr。
28.在一个或多个实施方案中，阻滞引物如seq id no:4-10中任一或多个所示。
29.在一个或多个实施方案中，步骤1)的扩增引物对如seq id no:1、2所示。
30.在一个或多个实施方案中，封闭序列如seq id no:3所示。
31.在一个或多个实施方案中，反向引物如seq id no:12所示。
32.在一个或多个实施方案中，探针如seq id no:13所示。
33.本发明还提供引物分子，其具有seq id no:4-10中任一或多个所示序列。
34.本发明还提供一种试剂盒，用于实施本文第一方面所述方法。
35.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含本发明任一实施方案所述的引物分
子，任选还包含其他实施本文第一方面所述方法所需的试剂，包括选自以下的一种或多种：所述引物对、所述封闭序列、所述反向引物。
36.在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含dntp、二价离子、dna聚合酶。
37.本发明的检测方法利用血浆cfdna样本，起始投入量低，检测特异性和灵敏度高，检测结果重复性好，操作简便快捷，为临床基因突变的检测提供一种快速可靠的方法。该方法可以实现pcr平台一次性检测多种突变类型，能够在最短的时间、最便捷的方式、最少的样本、最低的成本获得突变类型结果。
附图说明
38.图1，检测7种kras基因突变的线性回归图。
39.图2，kras，p.g12a扩增曲线。
40.图3，kras，p.g12c扩增曲线。
41.图4，kras，p.g12d扩增曲线。
42.图5，kras，p.g12r扩增曲线。
43.图6，kras，p.g12s扩增曲线。
44.图7，kras，p.g12v扩增曲线。
45.图8，kras，p.g13d扩增曲线。
具体实施方式
46.除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如lackie，dictionary of celland molecμlar biology(《细胞分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(elsevier)(第4版2007)；green等，molecμlar cloning,a laboratory manual(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约2012)。
47.本发明提供从核酸分子混合物中富集或检测第一核酸序列的方法，所述核酸分子混合物中的核酸分子具有第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列具有1-3个不同碱基，所述方法包括：1)在第二核酸序列扩增受到抑制的条件下扩增具有第一核酸序列的分子，获得预富集产物，2)使用阻滞引物和反向引物扩增步骤1)的预富集产物，获得富集的第一核酸序列分子，其中，阻滞引物与第一核酸序列互补，识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基，并且阻滞引物在其识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域中具有1-3个错配碱基。本文所述方法是非诊断或治疗方法。
48.本文所述富集通常通过扩增例如pcr扩增实现。本文中，“扩增”的产物是指在引物定向扩增反应过程中产生的核酸片段。引物定向扩增的一般方法包括聚合酶链反应(pcr)，连接酶链反应(lcr)或链置换扩增(sda)。如果选择pcr方法，则复制组合物可包含用于核酸复制的组分，例如：核苷酸三磷酸，具有适当序列的两种(或更多种)引物，热稳定聚合酶，缓冲液，溶质和蛋白质。
49.如本文所用的术语“样品”是指来自对象的任何组织或流体，其适于富集核酸。对象可以是任何活体或非活体生物，包括但不限于人、非人动物、植物、细菌、真菌或原生生物。对象可为男性或女性(例如妇女、妊娠妇女)。对象可为任何年龄(如胚胎、胎儿、婴儿、儿
童、成人)。
50.本文所述样品可以是疾病患者、疑似疾病患者或健康人群的样品。所述疾病包括kras突变(例如kras第12位突变)疾病，例如癌症，包括但不限于胰腺癌、结肠癌、肺癌。核酸可以从任何类型的合适生物试样或样品中分离。样品或测试样品可为分离或获自对象或其部分的任何试样，只要其包含基因组dna即可。试样的非限制性示例包括对象的液体或组织，包括但不限于血液或血液制品、脐带血、绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、洗液、活检样品、膜间液样品、细胞或其部分、女性生殖道清洗物、尿、粪便、痰、唾液、鼻黏膜、前列腺液、灌洗液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳腺体液、病灶组织等或其组合。在一些实施方式中，生物样品可以是血液，而有时是血浆或血清。在一个或多个实施方案中，样品是kras突变(例如kras第12位突变)相关癌症组织，例如胰腺癌组织、结肠癌组织或肺癌组织。其他合适的生物样品对于相关领域的普通技术人员来说是熟悉的。可以使用完全在临床实践者的普通知识范围内的技术获得生物样品。本文所公开的方法可用于富集和检测任何类型样品中的核酸，例如包含基因组dna(例如组织样品)的样品或包含cfdna(例如人外周血游离dna)的样品。本领域知晓这些样品的分离方法。
51.术语“分离的”是指材料，例如核酸分子和/或蛋白质，其基本上不含天然存在的环境中通常伴随或与材料相互作用的组分或从其中移出。分离多核苷酸可以从它们天然存在的宿主细胞中纯化。本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。
52.术语“核酸”、“核酸分子”“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文中可互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，及其互补物。核酸的示例包括单链和双链dna，单链和双链rna(包括sirna)，以及具有单链和双链dna和rna的混合物的杂合分子，其任选地含有合成的，非天然的或改变的核苷酸碱基。dna聚合物形式的多核苷酸可包含一条或多条cdna链，基因组dna，合成dna或其混合物。本发明的核酸可包含碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。本发明的核酸可经合成以包含非天然氨基酸修饰。本发明的核酸可通过化学合成方法或通过重组方法来获得。
53.在一些实施方式中，本发明方法之前、期间或之后对核酸进行片段化或切割。本文所用的“片段化”或“切割”指使核酸分子(如核酸模板基因分子或其扩增产物)可以分成两个或更多较小核酸分子的方法或条件。核酸片段可含有重叠的核苷酸序列，这样的重叠序列可促进构建未片段化的对应核酸或其区段的核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸可以是部分片段化的(例如，来自未完全的或中止的特异性剪切反应)或完全片段化的。这种片段化或剪切可以是序列特异性、碱基特异性或非特异性的，并且能通过任意不同方法、试剂或条件(包括例如化学、酶、物理片段化)来完成。
54.术语“延伸”指从与模板(rna或dna)结合的引物3’端开始，在核酸聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则，逐个连上核苷酸，由5
’→3’
方向合成与模板互补链的过程。术语“延伸产物”是指在延伸反应过程中产生的核酸片段。延伸组合物可包含用于核酸延伸的组分，例如：核苷酸三磷酸(ntp或dntp)，具有适当序列的一种或多种引物或探针，聚合酶，缓冲液，溶质和蛋白质。ntp或dntp包括具有富集标记物的ntp或dntp。
55.术语“聚合酶链式反应”(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学
技术。pcr技术的基本原理类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。常见pcr由变性
‑‑
退火
‑‑
延伸三个基本反应步骤构成。一些pcr扩增能够检测核酸相对或绝对含量，例如荧光pcr。
56.在一个或多个实施方式中，步骤1)的扩增产物至少10bp，至少30bp，至少50bp，或至少100bp。在一个或多个实施方式中，步骤2)的扩增产物至少10bp，至少15bp，至少20bp，至少50bp，或至少70bp。
57.术语“引物”是指合成的寡核苷酸，当其置于互补链的合成被聚合酶催化的条件下时，能够起到核酸合成或沿互补链复制的起始点的作用。引物还可含有富集标记物。
58.术语“探针”是指与感兴趣多核苷酸互补(但不一定完全互补)并通过与感兴趣多核苷酸的至少一条链杂交形成双链体结构的合成寡核苷酸。本发明的探针可包含单链核酸，其在严谨杂交条件下杂交至核酸中的靶序列。"靶序列"是限定结合分子例如探针将杂交例如结合的核酸部分的核酸序列，前提是存在杂交的充分条件。探针还可含有富集标记物。探针可基于本发明熟知的方法进行设计。例如，可按以下原则进行探针设计：1.探针的3’端包含与第一核酸序列和第二核酸序列相异碱基互补的碱基，该互补的碱基可以是3’端最后一个碱基或倒数第二个碱基，2.gc含量30-70％，3.tm值在50-58℃内，4.无发卡，无自连结构，无4个连续的g或c碱基。优选地，本发明探针长度为15-22nt。
59.在一个实施方式中，步骤1)的扩增包括使用使用能扩增第一核酸序列的引物对和识别第二核酸序列中与第一核酸序列不同的碱基的封闭序列，所述封闭序列具有抑制或阻断核酸延伸的修饰。因此，封闭序列选择性靶向第二核酸序列(例如野生型模板)，从而抑制或阻断以该序列为模板的聚合反应，即将其封闭。使引物能特异性扩增第一核酸序列(例如突变模板)，从而增强整个反应中第一核酸序列的拷贝数目，以达到放大低含量第一核酸序列的目的。在一些实施方式中，本发明方法包括未标记的封闭序列和经标记的封闭序列，用于富集核酸。
60.为了增强封闭效果，扩增所用的引物对和封闭序列的浓度比为至少1:20，例如至少1:50，至少1:100，或至少1:200。扩增体系中的组分含量可由本领域技术人员根据需要常规设定。示例性地，扩增体系中，dna聚合酶(例如phusion热启动酶)的浓度为0.002～0.016u/ul，dntp终浓度为0.2～1.6um，氯化镁的终浓度为0.5～4mm，引物终浓度为0.4～3.2um，封闭引物终浓度为1～8um，模板10ng～80ng；pcr反应体系为25～200ul；富集突变的pcr扩增反应条件例如：98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃～69℃退火约30s；72℃延伸约5min；共进行15～20个循环，10℃终止反应。
61.如本文全文所用的术语"修饰"意在表示该序列被以任何方式而改变。感兴趣核酸序列的修饰(及其缺失)可以是全部所需形式。本发明所述修饰没有限制，只要修饰能抑制或阻断核苷酸延伸即可。对核酸的修饰包括使碱基加上某一基团，如甲基化、3’磷酸化，也包括催化稀有碱基进入rna或dna中的作用。修饰还可以是碱基的双脱氧修饰，其能终止核酸的延伸，例如多核苷酸3’末端碱基的双脱氧修饰。其他示例性引物修饰包括地高新(digoxigenin)修饰、内部氨基修饰、5’氨基修饰、3’氨基修饰、巯基(thiol)修饰、间臂(spacer)、硫代(phosphorthioate)、脱氧脲嘧啶(deoxyuridine，du)修饰和脱氧次黄嘌呤(deoxyinosine，di)修饰等。在3’端引入磷酸化修饰可用于阻止3’外切酶消化，也可以用于阻断dna聚合酶催化的dna链延伸反应。在一个实施方式中，本发明封闭序列(例如封闭探
针)包含能抑制或阻断该封闭序列延伸的修饰。在一个实施方式中，靶向等位基因对中一条等位基因的封闭序列包含能抑制或阻断该封闭序列延伸的修饰。在一个实施方式中，靶向等位基因对中两条等位基因的封闭序列都包含所述修饰。在一个实施方式中，对核酸的修饰是磷酸化修饰。在一个实施方式中，磷酸化修饰位于3’末端。
62.本发明通过序列特异性寡核苷酸分离、选择和/或富集样品中的核酸亚组用于进一步加工。如本文所用，术语“标记”，“标记物”，“富集标记物”等是指能够用于富集核酸的分子，包括但不限于酶，金属离子，金属溶胶，半导体纳米晶体和配体(例如，生物素，亲和素，链霉亲和素或半抗原)。富集标记物的示例可为生物素，此时可使用带有例如链酶亲和素的固相进行核酸富集。
63.关于核酸的术语“选择性地”或“选择性”是指在靶核酸序列(例如，等位基因的靶序列)与非靶核酸序列(例如，等位基因的非靶序列)之间的区分。如果引物或探针与非靶序列发生很少或没有杂交，则靶向对序列是选择性的。
64.发明人发现，使用封闭序列可以一定程度上富集第一核酸序列，但由于封闭序列难以实现完全封闭，并不能完全排除体系中的第二核酸序列，造成后续测序或检测核酸序列的结果不准确，特别是在第一和第二核酸序列数量差异较大的情况中。因此，发明人对步骤1)的扩增产物进一步进行步骤2)，通过使用阻滞引物以进一步放大第一核酸序列的数量。此外，发明人发现，在阻滞引物中引入错配碱基，可以进一步降低第二核酸序列的扩增数量，并且不会显著影响第一核酸序列的扩增效率。具体地，阻滞引物与第一核酸序列互补，识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基，并且阻滞引物在其识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域中具有1-3个错配碱基。
65.阻滞引物中，用于识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基位于其3’端，优选3’端第1-3个碱基中任意一个、两个或三个。优选地，该差异碱基的识别核苷酸位于阻滞引物的3’端第一个碱基。
66.阻滞引物中所述错配碱基可以位于阻滞引物的任何位置。通常，所述错配碱基位于识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域，例如位于所述阻滞引物的3’端区域，即，所述阻滞引物在其3’端区域具有1-3个错配碱基。本文中，3’端区域是指引物3’端占总长度三分之一的碱基区域。因此，根据引物长度不同，错配碱基可以位于引物的3’端第1-8个碱基中任意一个或多个，例如第1-6个碱基中任意一个或多个，优选第1-5个碱基中任意一个或多个，更优选第1-3个碱基中任意一个或多个。所述错配碱基可以是任何导致其与模板无法互补的碱基或突变形式，包括但不限于：插入、取代、缺失、碱基修饰(例如甲基化)。
67.步骤2)的扩增通常是能够检测核酸相对或绝对含量的pcr扩增，例如荧光定量pcr。示例性的实时荧光定量pcr反应体系为10～25ul的ssoadvanced universal探针超混合液，其中引物终浓度为0.4～1um；探针终浓度为0.2～0.5um；稀释的富集产物投入4ul～10ul；qpcr反应程序用2步法：95℃预变性约2min，98℃变性约5s，58℃～63℃退火约30～40s；72℃延伸约5min；共进行40～50个循环，10℃终止反应。
68.如本文示例性实施例中所示，使用本文所述的fenbie使用封闭序列和阻滞引物的双扩增方法，可以区分出频率低至0.01％的突变。
69.本文所用“富集”、“浓缩”、“分离”和“纯化”可互换使用，指利用较多组分中一种或多种组分在物理性质或化学性质上的差异，使一种或多种组分相对地分配至不同的空间区
域或在不同的时间依次分配至同一空间区域的过程。富集可从较多组分中汇集其中一种或多种组分，从而提高该组分浓度、将该组分与其他组分分开、或去除该组分中的其他组分等。本文中，富集可表示使多种差异序列中的一种或多种与其他序列分开从而浓度提高的过程。本文的富集方法可以使扩增未受抑制的核酸序列与扩增受到抑制的核酸序列在空间上分开。在一个实施方式中，当多组差异序列对中的每组中都有一条差异序列被延伸受到抑制的封闭序列所靶向，则本文的富集方法可以使多组差异序列中的每组都有一条差异序列与其他差异序列在空间上分开。例如，本文方法得到的富集产物可以包含多组差异序列对中的每组的一条差异序列。有利地，使多核苷酸附连至固相支持物，以促进所述富集。例如，多核苷酸可存在于丙烯酰胺或琼脂糖凝胶基质中，或者更优选地，固定于膜表面、颗粒表面或处于微滴定板的孔中。所述附连至固相支持物可通过具有富集标记物的ntp或dntp和固体支持物上与富集标记物关联的分子来实现。例如，在富集标记物是生物素的实施方式中，多核苷酸可附连至带有链酶亲和素的固相支持物(例如颗粒)，从而实现富集。固相支持物可为磁性颗粒或响应磁性吸附的颗粒，从而利用磁性吸附而方便地富集附连有多核苷酸的固相支持物。
70.本发明提供的方法可用于检测关于受试者或患者肿瘤的临床信息。本发明方法可用于检测和描述血液或血浆样本中血液癌细胞dna的突变和/或改变，该样本含有大量“正常”体细胞dna。本发明的方法还可用于监测癌症缓解或治疗方案，例如剂量方案或免疫治疗。本发明方法可用于胎儿dna检测，例如，遗传疾病的突变特征。本发明方法可用于检测和描述血液或血浆样本中循环肿瘤dna的突变和/或改变，该血液或血浆样本也含有大量“正常”体细胞dna。因此，受试者dna可包括患者血液或血浆中的循环肿瘤dna，或母体血液或血浆中的胎儿dna。
71.例如，本发明的方法用于鉴别肿瘤患者是否具有kras基因突变，包括：g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13d。其中，肿瘤患者所具有的kras突变序列即为本文所述的第一核酸序列，而野生型序列或具有与第一核酸序列的突变不同的kras基因突变的序列即本文方法所述的第二核酸序列。示例性地，使用本文所述方法检测kras基因突变的步骤1)的扩增引物如seq id no:1或2所示，封闭序列如seq id no:3所示；步骤1)的正向引物如seq id no:11所示，反向引物如seq id no:12所示，阻滞引物如seq id no:4-10中任一或多个所示；探针如seq id no:13所示。
72.本发明还提供一种试剂盒，用于实施本文所述方法。所述试剂盒包含本发明所述的引物分子，任选还包含其他实施本文所述方法所需的试剂，包括选自以下的一种或多种：所述引物对、封闭序列、反向引物。所述试剂盒还包含dntp、二价离子、dna聚合酶(例如phusion热启动酶)和任选的使用说明。扩增体系中各组分的含量可由本领域技术人员确定。
73.本发明的试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验检测指标等因素对检测结果进行综合判断
74.在具体实施方案中，本发明首先将能够富集突变基因dna的正向和反向引物，能够特异性结合野生型dna基因序列(例如，无kras突变序列)的封闭阻断延伸的blocker，待测cfdna样品进行混合，pcr扩增，得到包含突变基因的富集产物。在能够阻断延伸的blocker
序列3’端进行磷酸化修饰，该blocker序列可以特异性结合野生型模板，同时能够有效抑制野生型片段的扩增，进而使引物能特异性扩增带有突变的模板，最终增强整个反应中突变模板(例如，kras突变序列)的拷贝数目，以达到放大低突变检测的目的。然后，设计3’端引入一个错配碱基的突变阻滞引物，因此每种突变类型的引物在3’端与野生型模板存在两个碱基的错配，其中一个为突变型错配，一个为人为引入错配，会大大降低其扩增野生型模板的效率，因此可以将大背景中的突变模板扩增出来，提高整体检测的灵敏度。通过统计各kras突变在不同频率下扩增的ct值，计算出δct作为纵坐标，以模板中突变频率为横坐标，计算各突变对应的突变阻滞引物的线性回归方程(equation)和线性相关系数(r2)
75.术语“约”或“大约”表示在本领域普遍技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，“约”可表示在1个或多个标准偏差范围内。或者，“约”可表示给定值的多至20％，或多至10％，或多至5％，或多至1％的范围。或者，尤其对于生物系统或过程而言，该术语可表示某值的一定数量级内，优选5倍内，更优选2倍内。本技术和权利要求书中描述具体值时，除非另有说明，假定术语“约”表示该具体值的可接受的误差范围内。
76.除非有明确的另外说明，所有的百分数和比例/比率都是以重量计。
77.除非另有说明，所有百分比和比例是基于组合物总量计算的。
78.贯穿本公开内容给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同这些较低的数值限制在本文中明确写出一样。本公开全文中给出的每个最小数值限定包括每个较高的数值限定，如同这些较高的数值限定清楚写在这里。本公开全文中给出的每个数值范围包括落入所述较宽数值范围的每个较窄数值范围，如同本文中明确写明这些较窄数值范围。
79.本文所述的值不应理解为严格限定为所述的精确的数值。相反，除非另有具体说明，所述值各自用于指所述的值和该值周围的功能等同的范围。例如，公开为“20μl”的值意在表示“约20μl”。
80.除非明确排除或者其他方式限制，否则本文所引述的每篇文献，包括任何交叉引用和相关的专利或申请，通过引用结合入本文。任何文献的引用不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或者其单独地或者与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本文中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文中赋予该术语的含义或定义。
81.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中的数据代表本发明较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同方式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
82.虽然已经图示和描述了本公开的特定实施例，但是在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行各种其他改变和修改。所附权利要求的范围包括在本公开范围内的所有这些改变和修改。
83.除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文在本发明的说明书中说使用的术语只是为了描述具体的
实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所以用的属于“和/或”包括一个或者多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
84.实施例
85.实施例1
86.为评估出本发明能够检测出的最低突变频率，选择kras野生型的标准品分别与7种突变的标准品混合出不同梯度，在10ng的dna总量中，含有kras突变的频率分别为2.5％，1％，0.5％，0.25％，0％；每个突变梯度均用本实施例的反应液，且每个突变梯度设置10个平行实验。这7种突变分别在不同突变频率下进行预扩增富集突变反应，然后稀释200倍，取用3.2ul用于实时荧光定量pcr的模板。
87.分别统计kras各自突变在这五种频率下扩增的ct值，计算出δct作为纵坐标，以模板中突变频率为横坐标，计算7种突变对应的突变阻滞引物的线性回归方程(equation)和线性相关系数(r2)
88.实验试剂
89.富集反应的pcr缓冲液，购自new england biolabs，neb公司；实时荧光定量pcr反应缓冲液购自bio-rad公司；kras基因突变的标准品和野生型基因标准品购自菁良基因科技(深圳)有限公司。
90.实验方法
91.1)将能够富集突变基因dna的正向和反向引物，能够特异性结合野生型dna基因序列的封闭阻断延伸的blocker，待测cfdna样品进行混合，pcr扩增，得到包含突变基因的富集产物。
92.2)富集反应相关引物特征如下：
93.突变基因dna富集的正向引物序列(上游特异性引物)：5
’‑
ggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtgg
‑‑3’
(seq id no:1)
94.突变基因dna富集的反向引物序列：5
’‑
tcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctg
‑‑3’
(seq id no:2)
95.引物终浓度为1um；
96.封闭阻断延伸的blocker序列：5
’‑
ataaacttgtggtagttggagctggtggcg-3’磷酸化修饰(seq id no:3)；
97.封闭引物终浓度为1um；
98.待测基因cfdna样品取自于人类外周血游离dna，模板投入量10ng。
99.pcr反应体系中dntp终浓度为200nm，氯化镁的终浓度为0.5mm，热启动酶是phusion hot start flex dna polymerase，终浓度是0.002u/ul。
100.pcr反应体系为25ul；
101.pcr产物大小110bp；
102.pcr扩增反应条件：
103.98℃预变性30s；98℃变性10s，69℃退火30s；72℃延伸5min；共进行20个循环，10℃终止反应。温度变化速率设置为1℃/s。
104.3)富集的产物进行稀释200倍后作为下一轮实时荧光定量pcr的底物，同时将针对突变设计的突变阻滞引物、荧光探针和通用反向引物混合，进行实时荧光定量pcr，根据ct
值判断突变是否存在以及突变类型。
105.针对突变设计的突变阻滞引物序列如下：
106.区分g12a型突变的正向引物序列：5
’‑
acttgtggtagttggagcagc-3’(seq id no:4)
107.区分g12c型突变的正向引物序列：5
’‑
aacttgtggtagttggagttt-3’(seq id no:5)
108.区分g12d型突变的正向引物序列：5
’‑
acttgtggtagttggagcgga-3’(seq id no:6)
109.区分g12r型突变的正向引物序列：5
’‑
aatataaacttgtggtagttggagatc-3’(seq id no:7)
110.区分g12s型突变的正向引物序列：5
’‑
aacttgtggtagttggaggta-3’(seq id no:8)
111.区分g12v型突变的正向引物序列：5
’‑
aacttgtggtagttggagatgt-3’(seq id no:9)
112.区分g13d型突变的正向引物序列：5
’‑
gtggtagttggagctggaga-3’(seq id no:10)
113.通用正向引物序列：5
’‑
gaatataaacttgtggtagttggagc-3’(seq id no:11)；
114.通用反向引物序列：5
’‑
catattcgtccacaaaatgattctg-3’；(seq id no:12)
115.以上引物序列中，下划线标注碱基为与突变碱基配对的核苷酸，小写标注的碱基为引入的错配碱基。通用正向和反向引物用于阳性对照实验，通用反向引物与突变阻滞引物用于检测实验。
116.引物终浓度为400nm；
117.探针序列：5
’‑
fam-ctgtatcgtcaaggcact-mgb-3’(seq id no:13)
118.探针终浓度为200nm；
119.本发明的qpcr反应液为ssoadvanced universal探针超混合液配制10ul反应体系；
120.稀释的富集产物投入4ul；
121.qpcr反应程序用2步法：95℃预变性2min，98℃变性5s，63℃退火40s；72℃延伸5min；共进行50个循环，10℃终止反应。温度变化速率设置为1℃/s。
122.实验结果
123.表1为7种kras突变在不同突变频率下扩增的cq值，其中0.00％为kras野生型基因底物，结果表明随着突变频率的升高，扩增的cq值逐步减小，如针对p.g12a突变设计的突变阻滞引物扩增10次的平均cq值分别为：31.1，24.4，23.7，22.2，21.0；对应的突变频率分别为：0.00％，0.25％，0.50％，1.00％，2.50％；计算出扩增野生型底物和包含0.25％突变的cq差值为6.7，以此类推，计算出针对p.g12c，p.g12d，p.g12r，p.g12s，p.g12v，p.g13d突变在0.25％比例下扩增的cq差值分别为：9.2，6.6，4.2，1.6，5.5，6.4；表明7种突变阻滞引物能够有效地将含有0.25％的kras突变与野生型区分开。
124.表1，kras的7种突变扩增的cq值
[0125][0126][0127]
表2为7种kras基因突变在不同突变频率下扩增的δcq值，其中0.00％为kras野生型基因底物，用wt表示，包含突变的不同梯度用m表示，δcq＝cq
wt-cqm，结果表明随着突变频率的升高，扩增的δcq值逐步增大，如针对p.g12a突变设计的突变阻滞引物扩增10次的平均δcq值分别为：0.0，6.7，7.4，8.9，10.1；对应的突变频率分别为：0.00％，0.25％，0.50％，1.00％，2.50％；以此类推，可以计算出其他突变的δcq值；为评估每种突变阻滞引物的效能，选择以δcq值为纵坐标，以突变频率的对数值为横坐标，计算7种突变对应的突变阻滞引物的线性回归方程(equation)和线性相关系数(r squared)。
[0128]
表2，kras的7种突变扩增的δcq值
[0129][0130][0131]
表3为7种检测kras基因突变的阻滞引物的线性相关系数和线性回归方程，所有r squared大于0.95，表明7种突变阻滞引物在能够有效区分出不同梯度的突变。
[0132]
图1为检测7种kras基因突变的阻滞引物的线性回归图，结果表明所有突变阻滞引物具有很好的线性，且能够将含有0.25％突变的kras基因与野生型区分开。
[0133]
图2到8依次为p.g12a，p.g12c，p.g12d，p.g12r，p.g12s，p.g12v，p.g13d的扩增曲线。扩增曲线中从最左侧到最右侧对应的突变频率依次为：2.50％，1.00％，0.50％，0.25％，0.00％，其中kras，p.g12a右起第二条的扩增曲线对应的为0.01％突变频率。扩增曲线表明，7种突变阻滞引物能够有效将突变和野生型区分开，其中p.g12a阻滞引物甚至可以区分出0.01％的突变。
[0134]
表格3，线性回归方程(equation)和线性相关系数(r squared)
[0135]
突变类型r squaredequationp.g12a0.984y＝1.06*x+8.7p.g12c0.978y＝0.95*x+10.9p.g12d0.989y＝1.13*x+6.7p.g12r0.997y＝1.08*x+6.5p.g12s0.992y＝0.93*x+3.3p.g12v0.999y＝1.01*x+7.5p.g13d0.856y＝0.98*x+8.8
[0136]
实施例2
[0137]
为评估本发明对胰腺癌相关的临床样本检测能力，从健康人的血细胞中随机挑选20例，从正常组织中随机挑选20例，从胰腺癌组织中随机挑选30例，及其匹配的癌旁组织7例，共计77例临床样本进行本发明方法的检测。
[0138]
胰腺癌组织样本、癌旁组织样本、正常组织样本的dna使用reliaprep
tm ffpe gdna miniprep system试剂盒进行提取，货号a2352；健康人的血细胞样本使用qiaamp dna mini kit(50)试剂盒进行提取，货号51304。
[0139]
本实施例所有样本的dna使用thermo life qubit 3.0荧光定量仪，货号q33216，对提取的dna浓度进行定量，dna完整性采用琼脂糖凝胶电泳系统进行检测，本实施例检测的所有临床样本的dna电泳条带完整且总量不低于100ng，均为质检合格样本。
[0140]
本发明对每个样本取10ng进行kras-pcr检测，检测方式与实施例1相同，检测结果如表4，表中“wbc-01到wbc-20”代表健康人血细胞的20个样本，“normal-01到normal-20”代表正常组织的20个样本，“para-01到para-07”代表癌旁组织的7个样本，“pdac-01到pdac-30”代表胰腺癌组织的30个样本，表中“+”表示为阳性，
“‑”
表示为阴性。
[0141]
表4，77例临床样本的kras-pcr检测结果
[0142]
[0143]
[0144][0145]
在本实施例的检测结果中20例健康人血细胞、20例正常组织、7例癌旁组织，全部检测为阴性。
[0146]
在本实施例检测的30例胰腺癌组织中，11例被检测为p.g12d突变，7例被检测为p.g12v突变，在胰腺癌组织占比分别为37％(11/30)和23％(7/30)，与文献报道的比例一致。
[0147]
实施例3
[0148]
为评估本发明对其他癌症的临床组织样本的检测能力，从肺癌组织中随机挑选40例进行本发明方法的检测。
[0149]
肺癌组织样本的dna是使用reliaprep
tm ffpe gdna miniprep system试剂盒进行提取，货号a2352。
[0150]
本实施例样本的dna使用thermo life qubit 3.0荧光定量仪，货号q33216，对提取的dna浓度进行定量，dna完整性采用琼脂糖凝胶电泳系统进行检测，本实施例检测的所有临床样本的dna电泳条带完整且总量不低于100ng，均为质检合格样本。
[0151]
本发明对每个样本取10ng进行kras-pcr检测，检测方式与实施例1相同，检测结果如表5，表中“+”表示为阳性，
“‑”
表示为阴性。
[0152]
同时，利用肺癌靶向基因检测(13基因)试剂盒(上海鹍远生物科技有限公司)对样本进行测序验证。基于二代测序设计包含13种肺癌相关基因的panel通过测序检测包括但不限于基因的突变和频率。利用对40例组织样本的dna进行包含但不限于kras突变检测，可以检出样本包含的kras突变类型和突变频率，检测结果如表5，表中“突变类型”一栏标注样本对应的突变类型，“na”表示为阴性；“突变频率”一栏标注对应样本突变的频率，“/”表示突变频率为零。
[0153]
对比本发明的检测结果与检测结果，发现本发明对kras的p.g12a、p.g12d、p.g12s、p.g12v、p.g13d五种突变的检测结果与完全一致，表明本发明检测这五种突变的准确率为100％；对kras的p.g12c、p.g12r两种突变检测的准确率分别为97.5％(39/40)、92.5％(37/40)。
[0154]
本发明对kras常见的七种突变检测的灵敏度和特异性如表6，表中“/”表示该值为空。
[0155]
表5，40例肺癌组织样本的检测结果
[0156]
[0157][0158]
表6，kras-pcr组织检测的灵敏度和特异性
[0159][0160]
实施例4
[0161]
为评估本发明对其他癌症的临床血浆cfdna样本的检测能力，从肺癌血浆中随机挑选30例进行本发明方法的检测。
[0162]
肺癌血浆样本的cfdna是使用hipure circulating dna midi kit c(5ml)5ml游离dna抽滤试剂盒进行提取，货号ivd3182。
[0163]
本实施例样本的cfdna使用thermo life qubit 3.0荧光定量仪，货号q33216，对提取的cfdna浓度进行定量，cfdna完整性利用perkinelmergx touch进行检测，本实施例检测的所有临床血浆样本的cfdna丰度完整、无基因组dna污染、且总量不低于50ng，均为质检合格样本。
[0164]
本发明对每个样本取10ng进行kras-pcr检测，检测方式与实施例1完全相同，检测结果如表7，表中“+”表示为阳性，
“‑”
表示为阴性。
[0165]
同时，利用肺癌靶向基因检测(13基因)试剂盒(上海鹍远生物科技有限公司)对样本进行测序验证。，基于二代测序设计包含13种肺癌相关基因的panel通过测序检测包括但不限于基因的突变和频率。利用对30例血浆样本的cfdna进行包含但不限于kras突变检测，可以检出样本包含的kras突变类型和突变频率，检测结果如表7，表中“突变类型”一栏标注样本对应的突变类型，“na”表示为阴性；“突变频率”一栏标注对应样本突变的频率，“/”表示突变频率为零。
[0166]
对比本发明的检测结果与检测结果，发现本发明对kras的p.g12a、
p.g12c、p.g12r、p.g12s、p.g13d五种突变的检测结果与完全一致，表明本发明检测这五种突变的准确率为100％；对kras的p.g12d、p.g12v两种突变检测的准确率均为为96.7％(29/30)。
[0167]
本发明对kras常见的七种突变检测的灵敏度和特异性如表8，表中“/”表示该值为空。
[0168]
表7，30例肺癌血浆cfdna样本的检测结果
[0169][0170]
[0171]
表8，kras-pcr血浆cfdna检测的灵敏度和特异性
[0172]

技术特征：
1.一种从核酸分子混合物中富集或检测第一核酸序列的方法，所述核酸分子混合物中的核酸分子具有第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列具有1-3个不同碱基，所述方法包括：任选的1)在第二核酸序列扩增受到抑制的条件下扩增具有第一核酸序列的分子，获得预富集产物，2)使用阻滞引物和反向引物扩增步骤1)的预富集产物，获得富集的第一核酸序列分子，其中，阻滞引物与第一核酸序列互补，识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基，并且阻滞引物还具有1-3个错配碱基。2.如权利要求1所述的方法，其特种在于，阻滞引物的识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基位于其3’端，优选3’端第1-3个碱基中任意一个、两个或三个，优选地，第一核酸序列和第二核酸序列的不同碱基包括选自以下的一种或多种：碱基插入、碱基取代、碱基缺失和碱基修饰。3.如权利要求1所述的方法，其特种在于，所述核酸分子混合物是含有基因组dna的样品，优选含有cfdna的样品。4.如权利要求1所述的方法，其特种在于，步骤1)的扩增包括使用识别第二核酸序列中与第一核酸序列不同的碱基的封闭序列，所述封闭序列具有抑制或阻断核酸延伸的修饰，优选地，使用能扩增第一核酸序列的引物对和所述封闭序列进行步骤1)的扩增。5.如权利要求4所述的方法，其特种在于，所述修饰包括选自以下的一种或多种：磷酸化、双脱氧修饰和甲基化，和/或，所述引物对和封闭序列的浓度比为至少1:20。6.如权利要求1所述的方法，其特种在于，所述阻滞引物在其识别所述不同碱基的核苷酸之外的区域中具有1-3个错配碱基，优选地，所述阻滞引物在其3’端区域具有所述1-3个错配碱基，所述3’端区域是3’端第1-8个碱基中任意一个或多个，更优选地，所述错配碱基包括选自以下的一种或多种：碱基插入、碱基取代、碱基缺失和碱基修饰。7.如权利要求1所述的方法，其特种在于，第一核酸序列是具有kras基因突变的序列，第二核酸序列是野生型序列或具有与第一核酸序列的突变不同的kras基因突变的序列。8.如权利要求1所述的方法，其特种在于，所述阻滞引物如seq id no:4-10中任一或多个所示，和/或步骤1)的扩增引物对如seq id no:1、2所示，和/或所述封闭序列如seq id no:3所示，和/或所述反向引物如seq id no:12所示。9.引物分子，其具有seq id no:4-10中任一或多个所示序列。10.一种试剂盒，包含权利要求9所述的引物分子，任选还包含其他实施权利要求1-8中任一项所述方法所需的试剂，包括选自以下的一种或多种：所述引物对、所述封闭序列、所述反向引物，优选滴，所述试剂盒还包含dntp、二价离子、dna聚合酶。

技术总结
本发明涉及差异序列双扩增富集和检测方法，具体提供一种从核酸分子混合物中富集或检测第一核酸序列的方法，所述核酸分子混合物中的核酸分子具有第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列和第二核酸序列具有1-3个不同碱基，所述方法包括：使用阻滞引物和反向引物扩增预富集产物，获得富集的第一核酸序列分子，其中阻滞引物与第一核酸序列互补，识别第一核酸序列中与第二核酸序列不同的碱基，并且阻滞引物还具有1-3个错配碱基。3个错配碱基。


技术研发人员：巩成相 纪航 陈飞凡 何其晔 苏志熙 刘蕊
受保护的技术使用者：江苏鹍远生物技术有限公司
技术研发日：2022.01.05
技术公布日：2023/7/20