异位联合表达Atoh1和Tbx2基因促进内毛细胞再生及其应用

异位联合表达atoh1和tbx2基因促进内毛细胞再生及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物制剂和生物技术领域，尤其涉及atoh1和tbx2联合过表达促进耳蜗支持细胞转分化为内毛细胞及其应用。


背景技术：

2.耳蜗是听觉系统的声音感受器。耳蜗的听觉上皮细胞，又被称为柯蒂氏器(organ of corti)，包含一排内毛细胞(ihcs)和三排外毛细胞(ohcs)。内外毛细胞可以表达多种毛细胞共同基因，如myo7a，但内外毛细胞在许多方面存在各自的特点。如作为声音信号放大器的外毛细胞，特异性的表达由slc26a5编码的运动蛋白prestin，slc26a5-/-小鼠由于外毛细胞的功能损伤表现出严重的听力障碍。内毛细胞作为声音的主要感觉细胞，特异性表达slc17a8编码的vglut3。vglut3是内毛细胞和耳蜗螺旋神经节(sgns)之间特有的带状突触结构释放兴奋性神经递质谷氨酸的关键，slc17a8-/-小鼠的内毛细胞无法传递神经递质到神经节细胞，从而导致听力完全丧失。因此，内外毛细胞对声音传递至关重要，遗憾的是哺乳动物不具备毛细胞再生的能力，意味着毛细胞一旦损坏将导致不可逆的永久性耳聋。
3.支持细胞(scs)与毛细胞(hcs)相邻排列，它们存在多种不同亚型，沿耳蜗轴内侧到外侧依次排列内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)和deiters’细胞(dcs)。ibcs和iphs属于内侧支持细胞亚群，它们的基因谱和发育起源与外侧pcs和dcs不同。如在pcs和dcs中prox1是瞬时表达，fgfr3持续表达，plp1和slc1a3则在ibcs和iphs中富集表达。但目前内侧支持细胞群的ibcs与iphs无法通过某个特定的分子标记来区分，因此将它们合并定义为ibcs/iphs。
4.与哺乳动物不同，鸡和鱼等非哺乳动物能够在毛细胞损伤后，通过支持细胞的转分化可以再生形成新的毛细胞。atoh1是耳蜗毛细胞发育的重要基因，在atoh1-/-小鼠中，毛细胞完全消失。相反，异位表达atoh1可以诱导产生额外的新生毛细胞。外侧支持细胞群pcs和dcs被认为与ohcs具有相同的细胞发育起源。atoh1可以将幼年的pcs和dcs转化为表达早期毛细胞标记myo7a的新生毛细胞，但新生毛细胞不能表达prestin。最新的研究表明，在成年小鼠的pcs和dcs中，同时异位诱导atoh1和ikzf2，可以再生出表达prestin的新生ohc，即prestin+类外毛细胞。ikzf2在小鼠出生后的外毛细胞中特异性表达，对外毛细胞的成熟至关重要。这提示了我们，在毛细胞分化中发挥了重要功能的基因，可能对促进新生毛细胞的成熟同样起到非常重要的作用。
5.ibcs/iphs与内毛细胞在分布位置上彼此邻近，并且在发育过程中具有相同的细胞起源。已报道的研究表明，新生小鼠ibcs/iphs细胞中异位表达atoh1，可以使ibcs/iphs转化为未成熟毛细胞。新生毛细胞表达myo7a和内毛细胞早期特异性标记基因fgf8。但新生毛细胞不能表达vglut3，不具有内毛细胞功能。因此，vglut3+内毛细胞的再生对于修复内毛细胞导致的听力损伤具有重要意义。
6.因此，本领域仍需探究可以促进myo7a+/fgf8+/vglut3-新生毛细胞转变为成熟的vglut3+新生内毛细胞的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于一种能够促进vglut3+新生内毛细胞再生的活性成分组合，以及包含所述活性成分组合的制剂或药物的用途。
8.本发明的第一方面，提供了一种活性成分组合的用途，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：(i)再生耳蜗內毛细胞；和/或(ii)治疗或预防听力受损；
9.其中，所述的活性成分组合包括：
10.(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和
11.(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。
12.在另一优选例中，所述tbx2蛋白具有如seq id no:1或5所示的氨基酸序列。
13.在另一优选例中，所述atoh1蛋白具有如seq id no:2或6所示的氨基酸序列。
14.在另一优选例中，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。
15.在另一优选例中，所述的耳蜗内毛细胞为人或非人哺乳动物的耳蜗内毛细胞。
16.在另一优选例中，所述的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。
17.本发明的第二方面，提供了一种可用于再生耳蜗內毛细胞的活性成分组合，包括：
18.(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和
19.(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。
20.在另一优选例中，所述tbx2蛋白具有如seq id no:1或5所示的氨基酸序列。
21.在另一优选例中，所述atoh1蛋白具有如seq id no:2或6所示的氨基酸序列。
22.在另一优选例中，所述的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。
23.本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包括：
24.(z1)第一表达载体，所述第一表达载体含有用于表达tbx2蛋白的第一表达盒；
25.(z1)第二表达载体，所述第二表达载体含有用于表达atoh1蛋白的第二表达盒；
26.其中，所述的第一表达载体和第二表达载体是同一载体或不同的载体。
27.在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：质粒、病毒载体。
28.在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。
29.在另一优选例中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，具体地包括：aav7m8、aav-anc80、或aav-ie。
30.在另一优选例中，所述表达载体含有编码tbx2蛋白和/或atoh1蛋白的核苷酸序列。
31.在另一优选例中，所述编码tbx2蛋白的核苷酸序列如seq id no:3或7所示。
32.在另一优选例中，所述编码atoh1蛋白的核苷酸序列如seq id no:4或8所示。
33.在另一优选例中，所述的第一表达盒从从5’端-3’端具有式i结构：
34.z0-z1-z2
ꢀꢀꢀꢀ(i)35.式中，
36.各
“‑”
独立地为化学键或核苷酸连接序列；
37.z0为无、或5’utr序列；
38.z1为编码tbx2蛋白的核苷酸序列；和
39.z2为无、或3’utr序列。
40.在另一优选例中，所述的第二表达盒从从5’端-3’端具有式ii结构：
41.z0
’‑
z1
’‑
z2
’ꢀꢀꢀ
(ii)
42.式中，
43.各
“‑”
独立地为化学键或核苷酸连接序列；
44.z0’为无、或5’utr序列；
45.z1’为编码atoh1蛋白的核苷酸序列；和
46.z2’为无、或3’utr序列。
47.在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。
48.在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。
49.在另一优选例中，所述第一表达载体和第二表达载体是不同的载体，其中，所述第一载体为瞬时表达载体，所述第二表达载体是持续(或稳定)表达载体。
50.本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体。
51.在另一优选例中，所述宿主细胞为耳蜗支持细胞(sc)。
52.在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞选自下组：内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)、deiters’细胞(dcs)、或其组合。
53.在另一优选例中，所述宿主细胞为内侧边缘细胞(ibcs)和/或内指细胞(iphs)。
54.本发明的第五方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)如本发明第二方面所述的活性成分组合，或本发明第三方面所述的载体，或如本发明第四方面所述的细胞，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
55.在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。
56.在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防听力受损，较佳地治疗耳蜗內毛细胞变性和/或损伤。
57.本发明的第六方面，提供了一种如本发明第二方面所述的活性成分组合，如本发明第三方面所述的表达载体，如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的药物制剂在制备用于治疗或预防听力受损的药物中的用途。
58.在另一优选例中，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。
59.本发明的第七方面，提供了一种再生耳蜗內毛细胞的方法，包括将本发明第二方面所述的活性成分组合，或本发明第三方面所述的表达载体，转导进入耳蜗支持细胞。
60.在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞选自下组：内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)、deiters’细胞(dcs)、或其组合。
61.在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞为内侧边缘细胞(ibcs)和/或内指细胞(iphs)。
62.在另一优选例中，所述再生的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。
tat)小鼠构建策略简图。(b-b
”’
)plp1-creer+；rosa26-loxp-stop-loxp-tdtomato/+(plp-ai9)小鼠tdtomato+的红色细胞主要为ibcs/iphs细胞,所有被标记的细胞都表达支持细胞的标记基因sox2。(c-c
”’
)仅注射tmx的plp1-creer+；rosa26-lsl-tat/+(plp1-tat)小鼠的耳蜗ibcs/iphs额外表达tbx2，但不表达或者非常低水平表达atoh1。这些额外表达tbx2的ibcs/iphs也同时被标记为红色(tdtomato+)，它们不表达myo7a，仍表达支持细胞标记sox2，显示没有转分化为毛细胞。
84.图2.瞬时异位表达atoh1和持续性过表达tbx2可以将新生小鼠ibcs/iphs细胞转化为vglut3+的新生内毛细胞。(a)同时异位表达atoh1和tbx2实现新生小鼠ibcs/iphs转化为vglut3+新生内毛细胞示意图。(b-b
”’
)对照组plp1-ai9小鼠耳蜗的tdtomato+细胞不表达内毛细胞标记物vglut3和外毛细胞标记物prestin。(c-c
”’
)p42的实验组plp1-tat小鼠耳蜗tdtomato+细胞表达内毛细胞标记基因vglut3，不表达prestin。(d-d
”’
)plp1-tat小鼠新生内毛细胞的下面仍存在一部分既不表达vglut3也不表达prestin的tdtomato+细胞。(e)plp1-tat小鼠p7、p14、p42整个耳蜗vglut3+的新生内毛细胞的数量统计，其中p42新生内毛细胞的数量比p7显著增加，但和p14相比无显著性差异，提示p14大部分的新生内毛细胞已经产生。(f)p42时plp1-ai9和plp1-tat小鼠的听力阈值无统计学差异，即新生的内毛细胞不会影响内源性内毛细胞的功能。
85.图3.fgf8-dtr/+特异性损伤小鼠耳蜗内毛细胞的小鼠模型。(a)内毛细胞特定损伤模型fgf8-dtr/+小鼠构建策略。(b-c’)在fgf8-dtr/+小鼠模型中，注射白喉类毒素(dt)，可导致内毛细胞的数量缺失。(d)在p42时,dt处理的fgf8-dtr/+小鼠内毛细胞数量远低于未用dt处理的fgf8-dtr/+小鼠内毛细胞数量。(e)fgf8-dtr/+小鼠注射dt后所有耳蜗频段中均出现明显的内毛细胞损失，没有位置之间的差异。(f)听觉脑干反应(abr)显示，dt处理的fgf8-dtr/+小鼠的听力阈值显著高于未用dt处理的小鼠，因此听力也显著下降。
86.图4.在内源性内毛细胞损伤的环境下，atoh1和tbx2异位表达诱导产生vglut3+新生内毛细胞。(a)在内源性内毛细胞的损伤的环境下，atoh1和tbx2异位表达诱导产生vglut3+新生内毛细胞的示意图。(b-b”)单独dt处理的plp1-creer+；rosa26-lsl-tat/+；fgf8-dtr/+(plp1-tat-dtr)小鼠耳蜗内毛细胞丢失。(c-c”)tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠耳蜗内毛细胞数量显著恢复。(d)tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠模型新生内毛细胞的转化率显著高于没有内源性内毛细胞损伤的plp1-tat小鼠模型。(e-e’)扫描电子显微镜(sem)显示对照组plp-ai9小鼠的外毛细胞的纤毛呈现典型
‘v’
或
‘
w’形状(粉红色)，内毛细胞的纤毛呈“鸟翼”状(紫色)。(f-f’)在plp1-tat小鼠中，邻近内源性内毛细胞纤毛(紫色)出现额外的“鸟翼”状纤毛(蓝色)。(g-g’)dt处理的plp1-tat-dtr小鼠内毛细胞的纤毛缺失。(h-h’)在tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠耳蜗中，我们显著恢复了“鸟翼”状静纤毛(来自于新生的内毛细胞)。(i-j')在tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠中捕捉到了与对照组plp1-ai9小鼠相同的高清晰的带状突触(红色圆点)。(k)abr分析显示p42时tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠(红线，选取疗效好的5只小鼠)与dt处理的plp-tat-dtr小鼠(黑线)相比较，在32k hz听力阈值略微降低(代表听力略有改善)，但跟对照组plp1-ai9小鼠相比，听力阈值在各个频段均显著提高。
87.图5.新生内毛细胞表现出与内源性内毛细胞非常相似的电生理特征。(a-b)野生型内毛细胞(a)和新生内毛细胞(b)均具备电压依赖性的钙电流。(c)新生内毛细胞的电流
幅度变化比野生型内毛细胞大。(d)新生内毛细胞体积小于野生型内毛细胞，具有更小的膜电容。(e)当触发去极化时，野生型内毛细胞和新生内毛细胞均可以记录到膜电容发生了明显的变化，提示有突触囊泡释放。(f)当施加更长时间的去极化刺激时，野生型和新生内毛细胞的细胞表面积均增进一步加大。
88.图6.新生内毛细胞基因表达谱与野生型成年小鼠成熟内毛细胞相似。(a)我们将p42-新生内毛细胞与e16(胚胎期第16天)-内毛细胞、p1-内毛细胞、p7-内毛细胞及p30-内毛细胞混合。umap分析显示形成了4个细胞类型簇。(b)p42-新生内毛细胞与p30-内毛细胞彼此靠近(黑色虚线圈)。(c)所有细胞的拟合发育轨迹分析显示了两个明显的分化轨迹，内源性内毛细胞成熟轨迹(黑色箭头)，ibcs/iphs从p1到p42的成熟过程(灰色箭头)。其中新生内毛细胞的重编程轨迹，即从p1-ibcs/iphs到p42-新生内毛细胞(粉色虚线箭头)很大程度上与内源性内毛细胞分化轨迹重叠(黑色箭头)，并且p42的新生内毛细胞与p30野生型内毛细胞最终聚集在一起(虚线圈)。(d)拟合时序分析计算发现ibc/iph谱系的分化程度比内毛细胞谱系分化程度较低。
具体实施方式
89.本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现将atoh1基因与内毛细胞高表达的基因tbx2结合，可以促进耳蜗支持细胞转分化为成熟的vglut3+新生内毛细胞。具体地，通过在新生小鼠耳蜗ibcs/iphs中条件性地异位表达atoh1和tbx2(ihc富集基因)，模拟野生型内毛细胞atoh1和tbx2的表达模式，使atoh1基因瞬时表达，tbx2持续表达。同时构建fgf8-p2a-dtr/+内毛细胞特异性损伤的小鼠模型。实现在内源ihc损伤的前提下，成功地将ibcs/iphs转分化为vglut3+新生内毛细胞。更重要的是，转分化的新生内毛细胞与成熟的野生型ihcs形态相似。电生理实验证明vglut3+新生内毛细胞在单个细胞水平上具有功能，但遗憾的是未实现小鼠听力恢复。综上，本发明提供了一种在小鼠体内再生出vglut3+新生内毛细胞的有效方法，为治疗因ihcs受损而导致的听力损伤提供了新方向。
90.在此基础上，完成了本发明。
91.为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
92.术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
93.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
94.如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
95.如本文所用，术语“听力受损”、“听力障碍”和“听力损伤”是指由于内毛细胞变性和/或损伤导致的听力功能异常。
96.tbx2
97.tbx2(t-box transcription factor 2)是t-box家族转录因子。具体信息参见：
98.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6909(人类)；
99.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/21385(小鼠)；
100.在本发明中，所述tbx2蛋白的氨基酸序列如seq id no.：1(人类)和seq id no.：5(小鼠)所示；核苷酸编码序列如seq id no.：3(人类)和seq id no.：7(小鼠)所示。
101.tbx2是t-box转录因子家族的成员之一，主要参与细胞发育进程调控。在小鼠耳蜗中，tbx2在胚胎早期耳囊开始表达，主要功能是决定耳蜗听觉上皮内毛细胞的命运决定。
102.atoh1蛋白
103.atoh1(atonal bhlh transcription factor 1)是bhlh家族的核转录因子，另外一个常用的名称是math1。具体信息参见：
104.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/474(人类)；
105.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11921(小鼠)。
106.在本发明中，所述atoh1蛋白的氨基酸序列如seq id no.：2(人类)和seq id no.：6(小鼠)所示；核苷酸编码序列如seq id no.：4(人类)和seq id no.：8(小鼠)所示。
107.atoh1本质也是分布在细胞核内的转录因子，主要功能是启动特定基因的表达。在小鼠耳蜗中，atoh1在胚胎中期的耳蜗开始表达，其主要功能是让耳蜗听觉上皮的祖细胞发育为毛细胞。atoh1缺失的小鼠不能产生毛细胞。
108.表达载体和宿主细胞
109.本发明提供了一种用于tbx2蛋白和atoh1蛋白表达的表达载体，它含有本发明的tbx2蛋白和atoh1蛋白的编码序列。
110.通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。
111.优选地，包含编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核酸序列作为载体，优选地作为表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在靶细胞(例如耳蜗支持细胞)中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、mmlv、galv、猿猴免疫缺陷病毒(siv)、hiv、痘病毒和sv40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replication defective)，或者可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶细胞的基因组。用于向靶细胞引入编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是aav载体。使用特定的aav血清型(aav血清型2到aav血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本可以实现选择性靶向。在本发明的优选例中，所述aav载体优选为aav7m8、aav-anc80、或aav-ie。
112.病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，aav中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的ix基因、ela和/或elb基因。对于野生型aav，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在prep/cap质粒中)，并且仅aav基因组的2itr被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。
113.病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与试剂复合以有利
于病毒载体被靶细胞的摄取。此类试剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。
114.载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在靶细胞中的表达。
[0115]“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。
[0116]
启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导基因在耳蜗细胞中普遍的表达，或耳蜗细胞特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如耳蜗支持细胞(sc)(包括柱状细胞(pc)、deiters细胞(dc))。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:l7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类cmv、gad-67、鸡肌动蛋白、cag和cba等。此外，使用细胞特异的启动子可以实现靶向特定细胞的基因表达。
[0117]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期望表达时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当期望关闭表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0118]
许多表达载体可应用于tbx2蛋白和atoh1蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人耳蜗支持细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒aav载体作为表达载体。具体地，优选的aav载体包括但不限于aav7m8、aav-anc80、或aav-ie。
[0119]
本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达tbx2蛋白和atoh1蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人耳蜗支持细胞)，所述细胞具有提高的tbx2蛋白和atoh1蛋白的表达量。
[0120]
在本发明的一个实施方式中，宿主细胞为耳蜗支持细胞，尤其是内侧边缘细胞(ibcs)和/或内指细胞(iphs)。
[0121]
药物制剂和组合物
[0122]
本发明提供一种药物制剂或组合物，所述药物制剂或组合物含有(a)本发明第二方面所述的活性成分组合、或本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0123]
在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗听力受损。
[0124]
在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗内毛细胞变性和/或损伤。
[0125]
本发明所述药物制剂中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗听力受损。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。
[0126]
组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
[0127]
在本发明中，所述载体可通过直接向耳部或耳蜗向受试者施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。
[0128]
在本发明中，可以将本发明所述的宿主细胞植入受试者的耳蜗施用。优选地，宿主细胞作为可注射液体被提供。
[0129]
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0130]
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0131]
治疗方法
[0132]
本发明提供了再生vglut3+新生内毛细胞的方法，所述方法包括将包含编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核苷酸序列引入到耳蜗内。所述方法包括向耳蜗的支持细胞(ibcs/iphs)施用包含编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核苷酸序列的载体。
[0133]
本发明提供了用于通过再生vglut3+新生内毛细胞在治疗听力受损的方法中使用的药物制剂或组合物，所述药物制剂或组合物包含编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核苷酸序列的载体或含有所述载体的宿主细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药物制剂或组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。
[0134]
本发明还提供了一种治疗听力受损的方法，所述方法包括将本发明所述的药物制剂或组合物施用于受试者。所述的听力受损为因ihcs受损而导致的听力受损。所述的方法包括直接将本发明所述包含编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的核苷酸序列的载体施用至需要的对象的耳部(耳蜗)。所述方法还包括直接将本发明所述的宿主细胞植入需要的对象的耳蜗。
[0135]
如本文所用，“vglut3+新生内毛细胞”或“vglut3+内毛细胞”意指，之前不具有内毛细胞能力的细胞(例如耳蜗支持细胞)，在其中表达编码tbx2蛋白和atoh1蛋白的外来核酸序列后，变成具备内毛细胞表征和功能的细胞，其是vglut3表达阳性的毛细胞。此类细胞
在本文中可被称作转分化的细胞，或“新生内毛细胞”，因为其在其中包含非天然的核酸。优选地，转分化的细胞展现天然的内毛细胞的一些或全部的能力。优选地，转分化的细胞展现天然的内毛细胞的至少相同或大体上相同的听觉能力。优选地，转分化的细胞展现比患病的或正在退化的天然的内毛细胞高的听觉能力。因此，转分化的细胞相比于来自同一来源、保持在同一条件下、未经处理的退化的或患病的细胞，将优选地具有增加的內毛细胞。转化的细胞通过其中的外源核酸的存在可与天然的细胞区分。
[0136]
本发明的主要优点包括：
[0137]
(1)本发明首次发现将atoh1和tbx2两个基因联合共表达于耳蜗支持细胞中，可以使原本不具有内毛细胞功能的耳蜗支持细胞转分化为具备内毛细胞表征和功能的vglut3+新生内毛细胞；
[0138]
(2)atoh1和tbx2两个基因同时过表达的编码dna序列加在一起在大小为3.2kbp左右，适合于aav载体包装；
[0139]
(3)atoh1和tbx2两个基因都是内毛细胞本身表达的基因，未引入其他异源基因，不会对新生的內毛细胞产生影响；
[0140]
(4)本发明提供的药物制剂和方法为听力障碍和听力受损提供了一种新的基因治疗思路。
[0141]
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0142]
实验材料与方法
[0143]
rosa26-lsl-tat/+和fgf8-dtr/+小鼠构建
[0144]
构建rosa26-lsl-tat/+小鼠，在一细胞期注射rosa26位点的sgrna(5
′‑
actccagtctttctagaaga-3
′
，seq id no:9)，donor dna和cas9 mrna至小鼠受精卵。对于fgf8-dtr/+小鼠，在一细胞期注射fgf8的sgrna(5
’‑
agctgggcgagcgcctatcg-3’，seq id no:10)，和donor dna至小鼠受精卵。pcr检测f0代小鼠是否具有正确的基因编辑，southern blot检测f1代的小鼠基因组是否有打靶载体的随机插入。
[0145]
小鼠饲养和注射给药
[0146]
他莫昔芬(tmx)溶解在玉米油中，白喉毒素(dt)用0.9％的生理盐水溶解，tmp溶解在1xpbs中。实验小鼠p0p1注射tmx，p2注射dt，p3p4注射tmp。
[0147]
plp1-creer小鼠(stock#:005975)和rosa26-lsl-tdtomato(ai9/+)小鼠(stock#:007909)来自jackson laboratory。所有小鼠都饲养在中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心spf级鼠房。
[0148]
样品处理，免疫组化实验及细胞计数
[0149]
为排除血液对免疫组化的干扰，取样前对实验小鼠进行1xpbs和4％pfa心脏灌流后再解剖。内耳组织经4％pfa过夜固定后，1xpbs清洗三次。p4的小鼠组织可以直接分析，p7、p14、p42组织样品用120mm edta，4℃处理2天，使组织脱钙变软用于解剖分析。免疫组化分析后利用nikon c2、tie-a1或nie-a1激光共聚焦显微镜拍图。免疫组化详细实验方法参
照本领域常规方法。
[0150]
统计野生型和新生内毛细胞数量，转分化效率和突触数量
[0151]
首先用激光共聚焦显微镜10倍镜，拍摄整个耳蜗轴区域的毛细胞，分别统计dt处理和无dt处理的fgf8-dtr/+小鼠myo7a
+
细胞的数量。其次60倍镜下每间隔1μm一层扫描，统计新生-ihcs数量(tdtomato
+
/vglut3
+
)和新生-hcs(tdtomato
+
/myo7a
+
)数量。新生毛细胞转分化效率计算用tdtomato
+
/vglut3
+
或者tdtomato
+
/myo7a
+
细胞数量除以同一扫面区域靠近vglut3
+
或myo7a
+
新生毛细胞附近的tdtomato
+
细胞的总数。
[0152]
单细胞rna-seq的细胞悬液准备
[0153]
plp1-ai9(为得到p42-ibcs/iphs)和plp1-tat-dtr小鼠(为得到p42-新生ihcs)的新鲜耳蜗组织解剖后用氯化胆碱(含20u/ml papain和100u/ml dnase i)溶液37℃消化20分钟，用蛋白酶和分解酶25℃处理20分钟。再用4种不同口径的玻璃巴斯德吸管吹打均匀，最后用30μm细胞过滤器过滤所有细胞悬液，获得10x单细胞测序的所有细胞，细胞建库(chromium single cell 3’v3)后通过illumina novaseq平台测序，最终得到plp-ai9和plp1-tat-dtr的平均测序深度为111,228和84,165reads。
[0154]
另外利用单细胞测序获得p30-ihc的转录组数据：对vglut3-p2a-icreer/+；ai9/+小鼠模型p10和p11注射他莫昔芬(tmx)，p30取样，其中ihc被标记为红色。在体式荧光显微镜下挑选得到26个tdtomato
+
ihcs，通过反转录、建库及测序，最终每个库测得4g的原始数据。
[0155]
abr测试
[0156]
分别测试了p42的实验小鼠4k、5.6k、8k、11.3k、16k、22.6k、32k和45khz的听力阈值。测试方法详见li,c.,et al.,hear res,2018.364:p.12-24。
[0157]
扫描和透射电镜样品的制备及分析
[0158]
透射电镜前期样品处理同扫描电镜，最后将样品包埋在环氧树脂中(90529-77-4,spi supplies)，扫描和透射电镜样品分别用场发射扫描电镜(zeiss gemin 300)和透射电子显微镜80kv(jeol-1230)拍摄。
[0159]
野生型和新生内毛细胞的钙电流和胞外分泌
[0160]
jclamp软件用于记录电生理数据，记录ca
+
电流的胞外液包含(单位mm)：105nacl、2.8kcl、30tea-cl、5cacl2、2na-pyruvate、1mgcl2、1creatine、10d-glucose和10hepes(naoh调ph7.4)，d葡萄糖调节渗透势300mosm。胞内液包含(单位mm)：20cscl、105cs-methane sulfonate、10hepes、10tea-cl、1egta、4mg-atp和0.5na-gtp、5phosphocreatine-na(csoh调节ph7.2)，d-葡萄糖调节渗透势298-300mosm。给予内毛细胞500ms的电压钳制从-80mv记录到+70mv，记录内毛细胞的ca电流。电导率与电压关系通过记录电流的可以用boltzmann方程推导出：
[0161][0162]
公式中v是膜电位的变化，g
max
最大电导，v
half half-activation电压，k是斜率因子。
[0163]
膜电容变化记录反映了在胞吐中突触囊泡的融合。内毛细胞被钳制在-80mv，0mv的电压可以诱导胞外分泌的去极化。
[0164]
野生型和新生内毛细胞的met电流
[0165]
使用全细胞膜片钳技术记录内毛细胞的met电流，方法详见liu,s.,et al.,elife,2019.8。实验小鼠耳蜗感觉区域在溶液(单位mm)：141.7nacl、5.36kcl、0.1cacl2、1mgcl2、0.5mgso4、3.4l-glutamine、10glucose和10h-hepes(ph 7.4)中解剖，接着转移至新的记录液中(单位mm)144nacl、0.7nah2po4、5.8kcl、1.3cacl2、0.9mgcl2、5.6glucose和10h-hepes(ph 7.4)。记录电极胞内液(单位mm)包含140kcl、1mgcl2、0.1egta、2mg-atp、0.3na-gtp和10h-hepes(ph 7.2)。内毛细胞静息电位-70mv。为记录met电流，记录电极放在毛细胞附近5μm位置，通过压电片给予内毛细胞40hz的正弦刺激。
[0166]
实施例1
[0167]
条件性诱导新生小鼠耳蜗ibcs/iphs瞬时表达atoh1，持续性表达tbx2基因的遗传操作策略
[0168]
已有研究表明，异位表达atoh1可以将新生小鼠ibcs/iphs转分化为表达myo7a和fgf8的新生毛细胞，但新生毛细胞不能表达vglut3。缺少vglut3的表达，新生毛细胞将无法具有正常功能。本发明的主要目标是再生出vglut3+的新生内毛细胞。t-box转录因子2(tbx2)是已知的在新生和成年小鼠内毛细胞中均富集表达但在外毛细胞中不表达的少数转录因子之一，与ikzf2的表达模式相反。由于ikzf2不仅可以促进外毛细胞的分化，还可以促进由成年小鼠pcs和dcs转分化新生的类外毛细胞中prestin的表达，我们推测tbx2将可能促进新生内毛细胞的进一步成熟。即tbx2和atoh1可以共同将新生ibcs/iphs转化为vglut3+ihcs。值得注意的是，atoh1在胚胎期耳蜗毛细胞产生和分化时表达，小鼠出生一周后停止表达。因此，为了更好地模拟野生型内毛细胞发育过程，设计了复杂的遗传操作模型，在该模型中tbx2和atoh1在新生小鼠的ibcs/iphs共同异位表达，其中atoh1为瞬时表达，而tbx2为持续表达。
[0169]
当大肠杆菌二氢叶酸还原酶(dhfr)的破坏结构域(dds)与目的蛋白质融合时，该蛋白质不稳定并迅速降解，使用细胞可渗透的小分子甲氧苄氨嘧啶(tmp)可以维持目的蛋白的稳定性。此外，将ecdhfr同时融合到蛋白质的n和c端比单独融合到n或c端可以产生更好的控制效果。因此，我们设计构建一种全新的小鼠敲入模型:rosa26-cag-loxp-stop-loxp-tbx2*3xv5-p2a-dhfr-atoh1-3*ha-dhfr-t2a-tdtomato/+(简称rosa26-lsl-tat/+)(图1a)。在cre重组酶介导的重组过程中，atoh1(用3
×
ha标记，c和n端均与dhfr融合)、tbx2(用3
×
v5标记)和tdtomato由同一个mrna转录。杂合子(rosa26-lsl-tat/+)和纯合子(rosa26-lsl-tat/rosa26-lsl-tat)小鼠都具有正常生育能力，健康，没有任何外表异常。
[0170]
实施例2
[0171]
在新生ibcs/iphs单独异位表达tbx2不能产生新生毛细胞
[0172]
在plp1-creer新生小鼠p0p1注射他莫昔芬(tmx)，plp1-creer的cre能够标记柯蒂氏器中的ibcs/iphs和耳蜗神经节区的胶质细胞。利用plp1-creer+；rosa26-lsl-tdtomato(ai9/+)小鼠(简称plp1-ai9)，在p0和p1注射tmx，在p3和p4注射tmp，p7取样分析。实验表明tdtomato+的红色细胞主要为ibcs/iphs细胞，少数pcs和dcs也被标记，所有被标记的细胞都表达支持细胞的标记基因sox2(图1b-b
”’
)。
[0173]
另外在p42分析了p0和p1注射tmx，但从不注射tmp的plp1-tat小鼠(这种小鼠只表达tbx2而不表达atoh1)。结果提示在这些小鼠中，所有tdtomato阳性的细胞均未表达myo7a
(图1c-c
”’
)。与此一致的是，这些tdtomato阳性的细胞依旧表达ibcs/iphs细胞的分子标记物sox2。
[0174]
因此，以上结果表明，tbx2单独异位表达不能将新生小鼠耳蜗ibcs/iphs转化为毛细胞。
[0175]
实施例3
[0176]
瞬时异位表达atoh1和持续性过表达tbx2成功地将新生小鼠ibcs/iphs转化为新的vglut3+内毛细胞
[0177]
接下来，验证同时异位表达atoh1和tbx2是否能将新生ibcs/iphs转化为vglut3+新生内毛细胞(图2a)。
[0178]
以plp1-ai9小鼠为对照，plp1-tat小鼠为实验小鼠。对照组plp1-ai9小鼠耳蜗(n＝3)，p42分析ibcs/iphs的tdtomato阳性细胞既不表达内毛细胞标记物vglut3，也不表达外毛细胞标记物prestin(图2b-b
”’
)，但是p42的实验组plp1-tat小鼠耳蜗中，tdtomato阳性细胞表达内毛细胞标记基因vglut3，但不表达外毛细胞标记物prestin(图2c-c
”’
)。我们将tdtomato+/vglut3+的细胞定义为“新生内毛细胞”。这些新生内毛细胞与内源性的内毛细胞(tdtomato-/vglut3+)紧密相邻。
[0179]
同时在新生内毛细胞的下面(紧密相邻)仍存在一部分既不表达vglut3也不表达prestin的tdtomato阳性细胞(图2d-d
”’
)。我们将其定义为未能成功转分化的ibcs/iphs，这些细胞主要位于支持细胞层。我们统计了近邻内源性内毛细胞的tdtomato+/vglut3+新生内毛细胞数量。结果显示，每个p42的耳蜗管(n＝5)区域分别出现220个左右的新生内毛细胞。这个数量跟总的红色ibc/iph细胞相比，计算出转分化的效率大约为29％。换句话说，约有71％的ibcs/iphs，未能转化成为新生毛细胞。而且这些新生内毛细胞的数量比p7显著增加，但和p14无显著性差异，提示p14大部分的新生内毛细胞已经产生(图2e)。另外这些新生的内毛细胞也表达其他更早期(非成熟的内毛细胞也表达)的分子标记物如myo7a和otoferlin。
[0180]
另外，听觉脑干反应(abr)测试结果显示，p42时plp1-ai9和plp1-tat小鼠的听力阈值无统计学差异(图2f)，这个结果意味着额外产生的内毛细胞并不影响内源性内毛细胞的功能。
[0181]
综上所述，得出以下结论，在新生小鼠的ibcs/iphs细胞中，瞬时过表达atoh1和持续性过表达tbx2可以转分化再生出新的myo7a+/otoferlin+/vglut3+内毛细胞。这一结果大大超过了之前的研究结果，即在新生小鼠的ibc/iph细胞中异位单独过表达atoh1，只可以得到myo7a+/otoferlin+/vglut3-的新生毛细胞。因此，本研究结果在耳蜗内毛细胞再生领域是一个重要的、有标志性的进步。
[0182]
实施例4
[0183]
内毛细胞特定损伤模型fgf8-dtr/+小鼠的构建
[0184]
为了进一步探究杀伤内毛细胞是否进一步提高新生内毛细胞的数量或者增加ibc/iph细胞到内毛细胞的转分化效率，构建了fgf8-dtr/+小鼠模型(图3a)。fgf8是一个内毛细胞特异的基因，因此白喉毒素受体(dtr)只表达在内毛细胞，如果在p2注射白喉毒素(dt)，dt和dtr结合会引起内毛细胞的特异性死亡。
[0185]
在p42时，未用dt处理的同窝小鼠(n＝3)中的fgf8-dtr/+小鼠有732.0
±
15.4(n＝
3)个内毛细胞(图3b，b’和d),但是dt处理的fgf8-dtr/+小鼠中仅有16.3
±
6.7(n＝4)个内毛细胞(图3c，c’和d)，提示内毛细胞的死亡率约为97.8％。此外，可以确认内毛细胞的死亡发生在耳蜗的底端、中端，顶端，而且没有位置之间的差异(图3e)。同时听觉脑干反应(abr)显示，在检测的所有频率下，经过dt处理的小鼠(n＝7)听力阈值显著高于未用dt处理的小鼠(n＝8)(图3f)。值得注意的是，三排外毛细胞在未注射dt和dt处理的fgf8-dtr/+小鼠中均排列良好(图3b-c’)。因此，fgf8-dtr/+是一个高效且特异的损伤小鼠耳蜗内毛细胞的小鼠模型。
[0186]
实施例5
[0187]
内源性内毛细胞的损伤可以提高由atoh1和tbx2异位表达诱导产生新生内毛细胞的转分化效率
[0188]
下一步，利用fgf8-dtr/+模型，确定内源性内毛细胞的损伤能否进一步提高新生内毛细胞的转分化效率(图4a)。
[0189]
将plp1-creer+；rosa26-lsl-tat/+；fgf8-dtr/+(简称plp1-tat-dtr)小鼠分为两组：1)第一组作为对照组仅注射dt(图4b-b”)；2)第二组实验组在p0和p1注射tmx，p2注射dt，p3和p4注射tmp，定义为tmx/dt/tmp处理组(图4c-c”)。值得注意的是，为了准确标记ibcs/iphs及后续的细胞命运谱系分析，先于dt前注射tmx(图4a)，排除由于相反的注射顺序从而改变plp1-creer+中cre表达模式的可能。
[0190]
dt处理的plp1-tat-dtr小鼠在p42仅剩下17.3
±
4.0(n＝4)个内毛细胞。相比之下，在p42时，在tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠的整个耳蜗中观察到了大约477.0
±
48.0(n＝4)个tdtomato+/vglut3+/prestin-新生内毛细胞。有趣的是，内源性内毛细胞未损伤的plp1-tat小鼠中，新生vglut3
+
内毛细胞数量为221.8
±
19.0。因此，杀伤内源性内毛细胞能够2.2倍幅度提高产生新生内毛细胞的数量。随之而来，在tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠中，73.5％
±
2.3％tdtomato阳性细胞(最初是ibcs/iphs)转分化为vglut3+的内毛细胞，这个转分化效率也显著高于plp1-tat小鼠模型中的29.5％
±
1.2％(图4d)。
[0191]
因此，得出如下结论：当内源性内毛细胞受损时，新生ibcs/iphs中异位表达atoh1和tbx2实现再生内毛细胞的效率比没有内源性内毛细胞损伤的时显著提高。
[0192]
实施例6
[0193]
新生内毛细胞的表征检测
[0194]
6.1新生内毛细胞具有纤毛，而且与神经元之间有带状突触的形成
[0195]
通过扫描电子显微镜(sem)分析p42的新生内毛细胞的表面是否存在静纤毛。分析比较1)plp-ai9(图4e和e’)；2)plp1-tat(图4f和f')和3)plp1-tat-dtr(图4g-h')三个模型的耳蜗毛细胞。对照组plp1-ai9小鼠，内源性ohcs的静纤毛呈现典型
‘v’
或
‘
w’形状(粉红色)，内毛细胞的静纤毛呈
‘
bird-wing’形状(紫色)(图4e和e’)。在plp1-tat小鼠中，邻近内源性内毛细胞静纤毛(图4f和f'中的紫色)分布了一排额外且离散的“bird-wing”状静纤毛(图4f和f'中的蓝色)。这些“bird-wing”静纤毛位于新生的内毛细胞的细胞表面，并且在plp1-ai9小鼠从未中观察到额外的静纤毛分布(图4e和e’)。而dt处理的plp1-tat-dtr小鼠p42时，内毛细胞的静纤毛缺失(图4g和g')。相比之下，在tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠中恢复了“bird-wing”状静纤毛(图4h和h’)。我们注意到在plp1-tat和tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠“bird-wing”状静纤毛与内源的内毛细胞相似，但并非完全相同。总
之，这种“bird-wing”状静纤毛的产生也证明了新生细胞向着内毛细胞的命运发展。
[0196]
利用透射电子显微镜(tem)进一步确认新生内毛细胞中存在带状突触(图4i-j’)。在对照组plp1-ai9和tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠中都捕捉到了高清晰的带状突触(图4i'和j'中的红色点状圆圈)。由于新生内毛细胞中静纤毛的存在以及与神经元细胞之间突触的存在，我们推测与dt处理的plp1-tat-dtr小鼠相比，tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr的实验组小鼠的听力会有显著提高。
[0197]
abr结果显示，tmx/dt/tmp处理组plp1-tat-dtr小鼠(n＝15)的听力阈值存在较大差异。其中5/15(33.3％)听力稍好(abr阈值较低)，10/15(66.7％)听力较差(abr阈值较高)。因此，如果我们单独分析阈值低的5只小鼠(图4k中的红线)，相比dt处理的plp1-tat-dtr(n＝4)小鼠(图4k中的黑线)，在32khz(图4k中的蓝色虚线)频率上听力有统计学上的改善(p《0.05)，但其他频率听力没有改善(p《0.05)。虽然5只tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠的阈值的线总体位于dt处理的plp1-tat-dtr小鼠的下方，但不存在显著性差异。值得注意的是，如果我们将15只实验组tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠合并分析，则32khz的听力改善也会消失。
[0198]
同时5只tmx/dt/tmp处理的plp1-tat-dtr小鼠(图4k中的红线)在p42时各频率的听力阈值均显著高于对照组plp1-ai9小鼠(图4k中的蓝线)。
[0199]
以上结果表明，虽然约有410个新的内毛细胞再生，但整体听觉系统水平上还未实现显著的听力恢复。尽管如此，考虑到在32khz时听力略有改善，推测新的内毛细胞可能在单细胞水平上发挥功能(图4k)。
[0200]
6.2新生内毛细胞表现出与内源性内毛细胞非常相似的电生理特征，在单细胞水平具有功能
[0201]
利用全细胞膜片钳方法，测试了单个新生毛细胞是否具有内毛细胞的电生理特性。
[0202]
p42时记录野生型内毛细胞及新生内毛细胞。首先，野生型(wt)内源性内毛细胞(图5a)和新生内毛细胞(图5b)都检测出电压依赖性的ca
2+
电流，并且新生内毛细胞(n＝10，细胞数)的电流幅度变化比野生型内毛细胞(n＝5)大(图5c)。其次，发现新生内毛细胞体积小于(n＝9)野生型内毛细胞(n＝9)，具有更小的膜电容，这与新生内毛细胞起源于ibc/iph细胞(图5d)从而体积偏小是一致的。第三，当野生型内毛细胞和新生内毛细胞触发去极化时，均可以记录到膜电容发生了明显的变化(图5e)。此外，当施加更长时间的去极化刺激时，野生型和新生内毛细胞的表面积增加是一致的，表明新生内毛细胞建立了正常的囊泡缓释功能(图5f)。
[0203]
综上，电生理分析表明，新生内毛细胞在单细胞水平上具有核心的电生理功能。但是由于听力没有恢复，可能整体水平上缺乏协同。
[0204]
6.3新生内毛细胞基因表达谱与野生型成年小鼠成熟内毛细胞相似
[0205]
进一步我们利用单细胞转录组和生物信息学的手段来确定新生内毛细胞与哪个发育阶段的野生型内源性内毛细胞最相似。
[0206]
将p42-新生内毛细胞，ihcs与e16-ihcs(106)、p1-ihcs(103)、p7-ihcs(79)和p30-ihcs(26)混合。umap分析显示形成了4个簇(图6a和b)。p42-新生ihcs与p30-ihcs彼此靠近(图6b黑色虚线圈)。此外，9个p30-ihcs出现在由p7-ihcs组成的集群2。推测这9个p30-ihcs
可能来自耳蜗顶端，剩下的17个p30-ihcs组成集群3可能来自耳蜗中部和基底部。而集群0和1分别由e16-ihcs和p1-ihcs聚类。
[0207]
由此得出结论，p42-新生ihcs的基因表达谱与p30-内毛细胞的最相似，它们聚类中彼此接近。
[0208]
此外，所有细胞的轨迹分析显示了两个明显的分化轨迹(图6c和d)。一个代表了从e16-ihcs到p30-ihcs的成熟过程(图6c黑色箭头)。第二个标记了从p1-ibcs/iphs到p42-ibcs/iphs的成熟过程(图6c灰色箭头)。此外，通过psuedotime计算匹配的ihc谱系实际年龄(图6d)和monocle algorism的算法发现ibc/iph谱系分化程度比ihc分化程度低。
[0209]
此外，p1-ibcs/iphs和e16-ihc之间的相似性促使我们推测，从p1-ibcs/iphs到p42-新生ihc(粉色点箭头)的重编程轨迹将在很大程度上与内源性ihc谱系的分化轨迹重叠(黑色箭头)。p42-新生ihc和p30-ihc确实聚集在一起(图6c中的虚线圈)。总体来说，数据显示，p42-新生ihc更接近于成熟的p30-ihc。然而，新生p42-新生ihc或许并非完全等同于p30-ihc，因为在内毛细胞损伤再生的模型中，听力没有显著改善。
[0210]
6.4新生内毛细胞低表达少数外毛细胞和前庭毛细胞基因
[0211]
鉴于p42-新生ihcs与p30-ihcs相似，预测前庭毛细胞和ohc基因将最低表达。判定该基因是否在p42-新生ihcs中表达，需要同时满足两个标准：1)该基因平均标准化表达值》0.5；2)超过一半的p42-新生ihcs表达这个基因的值》0.5。否则认为该基因不在p42-新生ihcs中表达。10x平台的表达标准》0.5与smartseq平台tpm》16不可比较。
[0212]
结果显示，仅有13/166(7.8％)的成熟ohc基因，6/53(11.3％)的新生ohc基因和2/26(7.7％)的前庭毛细胞基因在p42-新生ihcs中表达。
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综上，p42-新生ihcs少量表达外毛细胞和前庭毛细胞基因，主要表达成熟p30-ihcs基因。
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在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种活性成分组合的用途，其特征在于，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：(i)再生耳蜗內毛细胞；和/或(ii)治疗或预防听力受损；其中，所述的活性成分组合包括：(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。3.一种可用于再生耳蜗內毛细胞的活性成分组合，其特征在于，包括：(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体包括：(z1)第一表达载体，所述第一表达载体含有用于表达tbx2蛋白的第一表达盒；(z1)第二表达载体，所述第二表达载体含有用于表达atoh1蛋白的第二表达盒；其中，所述的第一表达载体和第二表达载体是同一载体或不同的载体。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为耳蜗支持细胞(sc)。7.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)如权利要求3所述的活性成分组合，或权利要求4所述的载体，或如权利要求5所述的细胞，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。8.一种如权利要求3所述的活性成分组合，如权利要求4所述的表达载体，如权利要求5所述的宿主细胞，或如权利要求7所述的药物制剂在制备用于治疗或预防听力受损的药物中的用途。9.一种再生耳蜗內毛细胞的方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的活性成分组合，或权利要求4所述的表达载体，转导进入耳蜗支持细胞。10.一种活性成分的用途，其特征在于，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：促进未成熟的毛细胞转变成熟的vglut3+内毛细胞；其中，所述的活性成分包括：tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。

技术总结
本发明提供了异位联合过表达Atoh1和Tbx2再生耳蜗內毛细胞及其应用。具体地，本发明提供了一种可用于再生耳蜗內毛细胞的活性成分组合及其用途，所述活性成分组合包含Tbx2蛋白和Atoh1蛋白，将所述活性成分组合施用于具有与耳蜗內毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损的受试者后，可通过再生vGlut3+新生内毛细胞缓解听力受损，为临床上治疗听力受损提供了新方法。方法。


技术研发人员：刘志勇 毕政鸿 李响 任旻蕙 顾云鹏 李杰 王广琴 李超 李书亭 孙雨薇
受保护的技术使用者：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心
技术研发日：2022.01.05
技术公布日：2023/7/20